Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Özet

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Özet

Karaciğer memeli vücudun metabolik merkezi ve kan için bir filtre olarak hizmet vermektedir. Karaciğer temel mimarisi hepatositlerin karaciğer kütlesinin% 85 den daha fazla oluşur ve hücresel kitle kalan% 15 Kupffer hücreleri (KCS), stellat hücreleri (HKH'lerin) oluşur Şekil 1'de gösterildiği gibi, ve sinüzoidal endotel hücreleri (sn). Sn karaciğer içinde kan damarı duvarlarının formu ve sitoplazmaya içinde Fenestra denilen özel morfolojisi içeren. Sitoplazmaya fenestrasyon saniye hareket, bir elek gibi en şilomikronlar, şilomikron kalıntıları ve makromoleküllerin, ama hücreleri, hepatositler ve ^HKH'lerin 1 (Şekil üzerinden geçtiği, böylece hücrelerin içinde delik görünüm (~ 100 mikron ) 1). Bazal membran olmaması nedeniyle SAN ve hepatositler arasında boşluk Disse Uzay oluşturur. HKH'lerin yer kaplamaz ve düzenleme ve ben önemli bir rol oynayabilirnjury, retinoik asit ve karaciğer ² immunoregulation depolama.

SAN, hücre ^yüzeyinde 3 çöpçü reseptörleri bir dizi görüntüleme vücudun en endocytically aktif hücreleri arasında yer almaktadır . Bu SR-A, Stabilin-1 ve Stabilin-2 içerir. Genellikle, büyük partiküller ve hücresel enkaz KCS ⁴ (fagosite) endocytosed, oysa tampon aşamasında küçük kolloidal parçacıkları az 230 nm ve makromoleküllerin saniye tarafından alınır. Böylece, toplu boşluk gibi kan glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı malzeme, ^sağlık ve 5,6 saniye endositik fonksiyonları büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, kan hyaluronan düzeylerinde artış, hafif ya da daha şiddetli ^formları 7 arasında değişen karaciğer hastalığının göstergesidir .

Bir rapor ⁸ istisna ile, varlığını hiçbir ölümsüzleştirdi SEC hücre hatları vardır. Hatta bu ölümsüzleştirdi hücre hattı de-diferansiyebirincil SAN (veri, gösterilmemiştir) çöpçü reseptörleri ifade etmediğini ilişkilidir. Tüm hücre biyolojik çalışmalar, taze hayvandan elde edilen birincil hücreleri üzerinde yapılmalıdır. Ne yazık ki, SAN, standart kültür koşulları altında dediferansiye ve hayvan izolasyon üzerine 1 veya 2 gün içinde kullanılması gerekir. Saniye farklılaşma Stabilin-2 veya HARE reseptör ^9, CD31 ve sitoplazmik fenestrasyon ¹ varlığı ifade ile işaretlenir. Saniye farklılaşma kültür ortamı VEGF ek veya hepatosit klimalı orta ^10,11 kültür hücreleri tarafından uzatılabilir.

Bu raporda, SEC özel Stabilin-2 reseptör hyaluronan için radyo-etiketli heparin kullanarak sağlam organ sn endositik aktiviteleri gösterecektir. Daha sonra endositoz ölçmek için perfüze karaciğer hepatosit ve SAN arındırmak.

Protokol

1. Karaciğer eksizyonu (değişiklikler ^14,15 PO Seglen ¹² ve R. Blomhoff ¹³ kabul)

1. 5.5 L odasında kapalı bir petri polietilen glikol izofluran 10 ml% 30 ekleyin. Bu odanın içinde stabilize bir atmosfer yaratmak için izofluran eklenmesinden sonra 10-15 dakika beklemek en uygunudur.
2. Kapalı odasında bir fare koyun ve anestezi olmak için izin verir. Anestezi tam etkileri hayvan tepkisiz, gevşek olduğunda fark edilir ve derin nefes alma sergiler.
3. 2 ml, 30 ml şırınga tüpün alt kısmında bazı pamuk topları polietilen glikol izofluran Yeri.
4. Bebek bezi kaplı bir tepsi ve burnu üzerinde şırınga tüp sırtında sıçan yerleştirin.
5. % 70 etanol ile karın ıslatma hemen derin anestezi onaylayın. Hayvan izofluran doz aşımı ölmesine izin vermeyin.
6. Bandaj makasları ve forseps kullanma, tüm abd maruzominal kavite.
7. Vena porta bulun ve forseps kullanarak, iki kısımlı mezenterik şube hemen üzerinde vena porta altında cerrahi ipek veya polyester iplik (ligatür) çizin.
8. Forseps çekiniz ve gevşek bir overhand düğüm.
9. Vena porta altında forseps kullanma ve damar düzeltmek için hafifçe geri çekilerek, bir Insyte Autoguard kateter (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences) veya benzeri bir kateter ile ven cannulate. Kateter parçacığı tarafından oluşturulan döngü ötesinde birkaç mm gitmeli.
10. Kateter yaylı tetik serbest iğne geri çekin ve çıkartın. Kan uygun ligatürün yerleşimini gösteren kateter içine sızan başlamalıdır.
11. Overhand düğüm aşağı sıkın ve başka bir overhand düğümle sabitleyin.
12. Inferior vena kava veya inen aorta (aorta abdominalis), kan dolaşım sistemi tahliye izin ya Sever.
13. Oksijenli ile karaciğer kızarma başlayınTBS ° 37 ° C 20 ml / dk akış hızında, kan (beyazlaşma) kaldırmak için. Karaciğer, kırmızımsı mor bir balçık renk açmak gerekir.
14. Karaciğer kızarma olmasına rağmen, tüketim, gastrointestinal sistem ve bağ dokusu kesim tarafından karaciğer. Karaciğer veya delinme Glisson kapsül delici için önemlidir.
15. Plastik tamponlar toplanan ve sirküle olması için olanak sağlayan bir huni üzerinde net karaciğer yerleştirin. Bu noktada Tamponlar sirküle, ancak atık behere akışı olmamalıdır. Flushing 10 dakika daha fazla sürmemesi. (Şekil 2A). Adım 2.1 'de gerekli endositoz çözüm hazırlayın.

2. ¹²⁵ I-SA-b-Hep (ya da diğer uygun etiketli ligand), içselleştirme

1. Küçük bir behere 50 ml RPMI ortam, nihai konsantrasyonu% 0.05 BSA ve 0.01 mCi ¹²⁵ I-SA-b-Hep veya diğer şekilde etiketlenmiş endositoz ligand ekleyin.
2. Bu beher takın apparatuoksijenasyon için izin vermek.
3. , Pompa kapatın giriş tüp geçiş ve sonra 20 ml / dak pompa açmak.
4. Etiketli RPMI karaciğer yaklaşırken, pompayı kapatın ve huni aşırı sıvı ve tüp drenaj izin.
5. Etiketli medya devridaim izin ve sonra pompa yeniden başlatmanız drenaj boru medya behere koyun.
6. Sıvılar, en fazla 1 saat için karaciğer yoluyla sirküle izin verin.
7. Bu içselleştirme adım sırasında, karaciğerde sıcaklığı kapsayan ve kollajenaz sindirim için hazırlamak istikrarlı olduğundan emin olun.

3. Kollajenaz sindirim karaciğer sindirimi

1. Taze çözünmüş ve süzülür (0,45 mikron) kollajenaz 37 60 ml geçmemek üzere toplam hacim ° C (100 mg / kg rat ağırlığı) 2 Tampon eklendi olmalıdır Hacmi boru uzunluğu / iç hacim bağlıdır ve buna göre ayarlanması gerekir.
2. Pompa ve döviz DurdurTBS medya beher giriş boruları.
3. Kalsiyum bağımlı desmosomal hücre kavşaklarından gevşeme sağlar dk 50 ml / 2 dk karaciğer yıkayın.
4. Karaciğer kızarma, beher cihazın kollajenaz içeren medya beher değişimi.
5. Hemen yıkamadan sonra, 20 ml / dak akış hızında 15 dakika kadar bir dolaşım döngü içinde kollajenaz ile sindirim başlar. Kollajenaz partiler çok sayısına göre farklılık gösterir, sindirim miktar ve zaman içinde değişiklikler kollajenaz her yeni parti için optimize edilmesi gerekir. Kollajenaz de kalsiyum bağımlıdır. Pompayı kapatın ve Flask B. (Şekil 2B) Flask Yatak atık hattı atık konteyner transfer Flask tampon ve gaz hatlarının geçiş.
6. Pompa Dur, kateter kaldırmak ve 20-30 ml Tampon 1 içeren bir çanak karaciğer aktarmak.
7. Geri Peel Glisson kapsül ve karaciğer hücre sallamaksıvı s.
8. Sıvı hücresel malzeme ile opak hale geldikçe, 30 mikron mesh ile ve daha sonra 50 ml konik içine buz filtrasyon ile 100 mikron mesh yoluyla hücrelere aktarın.
9. Karaciğer daha fazla Tampon 1 ekleyin ve mesh filtreleri ve konik sıvı, karaciğer matris hücreleri sarsmaya devam ediyor.
10. Adımları tekrarlayın 3,7-3,9 artık hücreleri karaciğer makul sallayarak yerinden olabilir kadar.

4. Hepatosit ve SEC arıtma

1. 3 dakika boyunca 150 xg'de hücreleri içeren 50 ml conicals Santrifüj. hepatositler pelet.
2. Buz üzerinde taze 50 ml conicals olmayan parankimal hücre içeren sıvı kısmını aktarın.
3. Hepatositler Tampon 3 pelet resuspending ve adımları 4.1 ve 4.2 en fazla üç defa tekrar yıkayın.
4. Yıkar sonunda, pelet ≥% 97 saf hepatositler. Sn elde etmek için, tüm borular c santrifüj10 dakika için 200 xg (HKH'lerin, saniye, ve KCS ve bazı küçük hepatositler içeren) supernatant toplanmış ontaining. 4 ° C
5. Tampon aspire 4, 5 ml RPMI / BSA tüm pelet ° C tekrar süspansiyon
6. 2 tüp içine hücreleri birlikte Havuz ve 35 mL bir birime kadar RPMI / BSA ekleyin.
7. 3 dakika boyunca 100 xg'de conicals santrifüjleyin.
8. En iyi 25 ml sıvı ve temiz bir 50 ml konik transfer toplayın.
9. Kalan 10 ml medya pelletini tekrar ve tekrar soğuk RPMI / BSA 25 ml ve 3 dakika boyunca 100 xg'de santrifüj ekleyin.
10. 3,8 ve 3,9 adımları tekrarlayın hücre pelet ve alt 10 ml medya, bir kez daha atın.
11. Pelet saniye, KCS ve 10 dakika için 200 xg HKH'lerin supernatents santrifüjleyin. 4 ° C
12. Buz 20 ml PBS içinde% 25 Percoll içeren üç 50 ml tüpler hazırlayın. Her bir tüp içinde 15 ml% 50 Percoll Underlay.
13. 30 ml RPMI / BSA toplam hacmi hücre pelletleri tekrar
14. Dikkatle bindirme eac4 h 20 dakika için 900 xg hücreleri ve santrifüj 10 ml degrade ° C
15. SAN ve KCS batmaz yoğunlukları çok yakın ve% 25/50 arayüzü var. HKH'lerin / medya lipid depolama hücreleri gibi yüksek kaldırma kuvveti nedeniyle arayüzü tipik olarak 25%. Kalan hepatositler ve kan hücreleri düşük buoyancies ve pelet. 25/50% arabiriminin yanında yukarıdan aşağıya aspire ve bu malzemenin atın.
16. 25/50% arayüzü ve soğuk RPMI ile taze bir konik hücrelerin toplayın. Son hacim Percoll sulandırmak için ~ 40 ml olmalıdır.
17. 4 az 10 dakika süreyle 350 xg'de konik Santrifüj ° C pelet hücreleri.
18. ~ 10 ml önceden ısıtılmış RPMI asitle yıkanmış cam Petri kabındaki 100 U / ml Penicillin/100 g / ml Streptomisin ve yer hücreleri içeren ya da çanak kristalize hücrelerin tekrar
19. Hücreler 15 dakika inkübe edin. 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatörde.
20. Rock ya da girdap plakası birazve sonra süpernatantı sn toplamak. KCS saniye daha çok daha hızlı bir şekilde cama yapışır. Alternatif olarak, SAN, manyetik boncuk konjuge veya anti-Stabilin2/HARE anti-CD31 antikorları kullanarak immunopurification KCS ayrılmış olabilir.
21. Canlılık ve hücre sayıları hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama ya da otomatik hücre sayıcı ile değerlendirilebilir.
22. Kültür sn 37 ° fibronektin kaplı plastik tabaklar ° C,% 5 CO _2, 40 ng / ml VEGF, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml Streptomisin veya hepatosit klimalı ortam RPMI/0.25% BSA.
23. Hepatositler, KCS ve SAN etiketli malzeme içselleştirilmesi için bir gama sayacı kullanımı ile değerlendirmek ve bu kültür yöntemleri kullanılarak (floresan ile işaretlenmiş) toplam hücresel protein veya mikroskobu ile normalize edilebilir.

5. Temsilcisi sonuçları:

Hepatosit arıtma ≥% 97 ve SEC arıtma typicmüttefiki ≥% 95 bu yöntemi kullanarak. Karın boşluğunda, portal ven, kanülasyon, karaciğer, beyazlaşma eksizyonu en iyi sonuçlar için bir dakika içinde meydana gelmelidir. HARE/Stabilin-2, karaciğer sn belirli bir reseptör ve diğer karaciğer hücre tipleri ifade değildir. Bu örnekte, hepatosit ve SAN hem de hücre lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrıldı Stabilin-2 hem de izoformları (Şekil 3) karşı monoklonal antikor ile probed.

Kan dolaşımına enjekte ^heparin, 16 karaciğer tarafından temizlenir . Gümrükleme, öncelikle hepatositlerde ve KCS ¹⁷ aksine, karaciğer sn tarafından yapılır . Stabilin-2/HARE reseptörüne bağlanır ve ¹⁸ saniye içinde heparin içselleştirmesi ana bir boşluk reseptör . Buradaki örnekte, biz GlcNAc / NS karboksilat grup biotin etiketiyle heparin etiketli. Biotin, içselleştirilmiş heparin Prot tespiti için iyotlu streptavidin ile konjugeeoglycan. Exsanguination tarafından takip etiketli heparin enjeksiyonu, enjeksiyon sonrası 30 dakika bize hangi organları heparinin bu formu içselleştirmek izlemenize olanak sağlar. Bu kısa zaman aralığında, karaciğer birincil gümrük organ (Şekil 4).

Daha açık bir şekilde hücre tipi temizlenmesi için sorumlu olduğu anlamak için,% 0.05 BSA ile desteklenmiş RPMI medya I-SA-b-Hep ¹²⁵ eklenir ve 20 dakika için karaciğer dolaşmasına izin. Kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma ardından, etiketli heparin hepatositler (Şekil 5) aksine saniye içinde büyük bir çoğunluğu tarafından içselleştirilmiş.

Şekil 1: Temel karaciğer mimarisi . Sn sinüzoidler duvarlarını oluşturmak ve normal (çevrelerin küçük kümeleri) Fenestre. Stellat hücreleri (HKH'lerin) Kupffer c aksine Disse Uzay bulundu.arşın (KCS) normalde sinüzoidler mikrovaskuleterini mevcuttur. Hepatositler Disse Uzay diğer tarafında işgal eder.

Şekil 2 perfüzyon cihazların şematik. A) Karaciğer sinüzoidler kızarma / yıkama sırasında aparat Set-up. TBS, 1 litre cam şişe içinde. B) ~ 60 ml Tampon 2 kollajenazlarla içeren 125 ml şişeyi, bir kapalı devre karaciğer sindirim için kullanılır. Atık su hattı da lastik tıpa bir çentik kesi aracılığı ile atık konteyner balon B değiştirildi. Oksijen hattı kollajenaz (balon B) içeren köpük önlemek için tampon içine batmış değildir. Her balona Stoper atık su hattının etkin transferine izin vermek ve artan oksijen gazı basıncı önlemek için çentikli.

Şekil 3. Hepatosit hazırlıkları saniye ile kontamine değildir. Eşit miktarda saflaştırılmış hepatositlerde gruplar halinde (şeritli 1) ve saniye (şeritli 2) cep lizatları% 5 SDS-PAGE ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen. HARE/Stabilin-2 hem izoformları (315 kDa ve 190 kDa) karşı spesifik monoklonal antikor # 30 lizatları prob kullanıldı.

Şekil 4 organlarda etiketli heparin Dağılımı. Sıçanlar, 30 dakika ^boyunca 125 I-SA-b-hep beklemek lateral kuyruk damar yoluyla enjekte edilir ve daha sonra exsanguinated. Kan yapay olarak herhangi bir organ yüksek okuma vermek amacıyla toplanmıştır. Her organ dakika başına (BGBM) Sayımlar, gram olarak organ ağırlığını karşı normalize edildi.

Şekil 5 hepatosit ve saniyede etiketli heparin miktarı. RPM¹²⁵ içeren medya I-SA-b-Hep kollajenaz sindirim ve hücresel arıtma takiben 20 dakika için sağlam bir karaciğer ile dolaşmasına izin verildi. Eşit miktarda hepatosit ve SEC hücre proteini lizatları Bradford Testi sayısal ve bir gama sayacı tarafından sayıldı.

Şekil 6 Kupffer hücreler cam üzerine yapışmasını sn ayrılır. Hücreler bir asitle yıkanmış cam kristalize çanak yerleştirilir ve 37 ° C,% 5 CO ₂ 15 dakika uyması izin verildi. Olmayan yapıştırılır hücreleri içeren supernatent hafifçe kıvrıldı ve bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. % 8 SDS-PAGE ile ayrılmış iki cam yapıştırılır hücreleri (şeritli 1) ve olmayan yapıştırılır hücreleri (şeritli 2) lizatları lekelenen ve Kupffer hücreleri için spesifik CD163 karşı bir antikor ile probed.

Fibronektin kaplı plastik kaplanmış Şekil 7 sn 6-iyi yemekler,% 0,1 BSA ile desteklenmiş RPMI bir gece inkübe edildi . (A) 100x ve (B), 200x büyütme Faz kontrastlı görüntüler alınmıştır.

Tartışmalar

Anestezi, izofluran buharı neden olur bilinçsizlik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem olduğu asılı damla yöntemi ile sıçan. Buharlaştırıcı da odasının dışında hayvanın korumak için pamuk ile bir şırınga yerine kullanılan, ancak cerrahi işlemler bu gerekli değildir, çok hızlı olabilir. Polietilen glikol, buhar basıncı ve buharlaşma oranı azaltmak için izofluran eklenir. Çok fazla izofluran buharı çok hızlı bir şekilde ölüme neden olacaktır. Kanüle karaciğer ve TBS, karaciğer havuzu kan olabilir pıhtı ile beyazlatılmış ve kollajenazlarla sinüzoidler ve sindirim verimli çamaşır önlemek önce hayvan ölür. Bir antikoagülan olarak heparin eklenmesi yararlı olabilir ancak bizim prob olarak etiketlenmiş heparin kullanan beri bu çalışmalarda kullanılmaz.

Gey tamponlu salin solüsyonu (GBSS) sık sık diğer laboratuvarlar tarafından saniye arıtma değiştirilir. SEC arıtma, hep yararlı olmakla birlikteatocytes 1-3 GBSS yanı sıra Tamponlar tahammül edemez ve canlılığı yaklaşık olarak yüksek değildir. Endositoz ölçerken, organ ve hepatositler saflaştırılmış arka plan düzeylerini ölçmek için iyi bir uygulamadır.

Bu yöntem iki biridir kollajenaz ile karaciğer perfüzyon aşağıdaki sn verimli arıtma. Diğer yöntem Yıkayarak tasviye santrifüj ¹⁹ yerine Percoll degrade olmayan parankimal hücreleri ayırır. Percoll gradyanlar üzerinde Yıkayarak tasviye kullanmak için avantajları biraz daha yüksek hücre canlılığı ve numaraları. Dezavantajı Yıkayarak tasviye santrifüj özel bir rotor, adanmış santrifüj, ve on binlerce dolar maliyeti birlikte peristaltik pompa gerektirir. Bu yöntem, yalnızca birçok laboratuvarda standart bir buzdolabında masa üstü santrifüj ve peristaltik pompa kullanımını gerektirir.

SAN ve seçici yapışma KCS ayrılması standart bir yöntem20-22. Saniye cam ve plastik uygun olacağı doğru olmakla beraber, 37, 15 dakikalık bir inkübasyon daha fazla asitle yıkanmış temiz bir cam kullanmak için kilit nokta ° _C,% 5 CO 2. KCS saniye daha hızlı uyacaktır ve bu gevşek bağlı hale gelmiştir kalan sn ayıklamak için medya ile KCS hafifçe yıkamak için tavsiye edilir. Pronase ve diğer proteazlar hücrelerinin canlılığı artırmak için bu protokolü kollajenaz sindirim adımları da atlanmıştır. Proteazlar ekstrasellüler reseptörleri sindirmek ve nihai arıtma adımları hücresel adezyon inhibe edebilir.

Burada sunulan yöntem, uygulamalar geniş bir yelpazede. Heparin başlangıçta birincil hepatositler almak için karaciğerin temizlenmesi, perfüzyon için alındığı sonuçta gösterse de, KC, SAN ve HKH'lerin metabolik yollar, immunoregulation, çöpçü faaliyetleri, ve diğer ilgili çok sayıda çalışma için yararlı olabilir fizyolojik Studies. Bu prosedürün en zor kısmı, portal ven kateter kayma kalmadan iyi kanülasyonu, sindirim, karaciğer ve karaciğer taşıma.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Model / katalog #	Yorum
20L su banyosu	ThermoFisher	2231	Su, yaklaşık 45 ° C soğutma telafi etmek için
			Hortumun içinde.
Peristaltik Pompa	Cole-Parmer	7553-70	Masterflex serisi
Soğutmalı Santrifüj	Sorvall	Legend XTR
Sonda	BD Biosciences	381444
Desikatörde odasına	Balıkçı	08595E	İç plakası kullanın
Percoll	Sigma	P4937
Sığır Serum Albumin	SeraCare	AP-4510-01
100 mikron mesh	Spectrum laboratuvarları	146488
30 mikron mesh	Spectrum laboratuvarları	146506
RPMI 1640	Invitrogen	21870
Polietilen glikol	Spectrum laboratuars	PO107