Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

Resumen

En esta publicación, se describe un procedimiento rápido y conveniente para el aislamiento y cultivo de las células acinares pancreáticas primarias del páncreas murino. Este método constituye un enfoque valioso para el estudio de la fisiología de las células pancreáticas exocrinas normales / no transformada primarios frescos.

Resumen

Este protocolo permite el aislamiento rápido (en menos de 1 hora) de acinos pancreáticos murino, por lo que es posible mantener en cultivo durante más de una semana. 10 ⁶ células acinares Más de 20 x puede obtenerse a partir de un único páncreas murino. Este protocolo ofrece la posibilidad de procesar de forma independiente hasta 10 páncreas en paralelo. Debido a que preserva la arquitectura acinar, este modelo es muy adecuado para el estudio de la fisiología del páncreas exocrino in vitro en contraste con las líneas celulares establecidas a partir de tumores de páncreas, que muestran muchas alteraciones genéticas que resultan en la pérdida parcial o total de su diferenciación acinar.

Introducción

Un problema frecuente para los laboratorios de investigación que trabajan en tejido pancreático exocrino es la dificultad de cultivar las células acinares in vitro durante un periodo de tiempo suficientemente largo para permitir que un experimento a largo plazo.

Un factor que impide el desarrollo de estos sistemas de cultivo es la sensibilidad intrínseca del tejido pancreático a la manipulación experimental, debido al alto contenido de enzimas glucolíticas, proteolítica y lipolítica, que literalmente digerir el tejido pancreático cuando se liberan durante el aislamiento de las células pancreáticas.

Un segundo factor es la notable en la plasticidad in vitro de las células acinares, que tienden a perder sus características de secreción y transdifferentiate a otras células maduras, tales como células ductales pancreáticas o células de hepatocitos como ^1. In vitro, esta plasticidad de las células varía con las condiciones experimentales (tales como composición del medio de cultivo) ² e introduce un grado de complejidad en el diseño de las condiciones de cultivo apropiados para las células pancreáticas exocrinas ^1.

Varios métodos han sido desarrollados para el aislamiento y cultivo de células acinares, primero desde el páncreas conejillo de indias ^3-5. Inicialmente, los protocolos involucrados digestión de tejido pancreático con colagenasa, quimotripsina, y un cóctel de proteasa, con el aislamiento final por disociación mecánica vigorosa. Las células pancreáticas aisladas de esta manera muestran características estructurales y funcionales anormales, en particular una pérdida de estructuras apicales y daños significativos a sus receptores de membrana. Las células aisladas se mantuvieron viables sólo 1 ó 2 días.

Preparación de acinos dispersa mantiene su arquitectura intra-e intercelular, la preservación de las membranas celulares, lo que limita el daño a receptores de la superficie, y por lo tanto la mejora de la secreción exocrina en respuesta a secretagogos de ^6-8. Como resuLT, este método ofrece la importante ventaja de extender la viabilidad celular acinar a 7-10 días in vitro. Por otra parte, actualmente se prefiere este método de aislamiento de células acinares ^9-12 porque el mantenimiento de los contactos intercelulares, incluyendo acoplamiento celular por uniones, es un determinante esencial de la exocrina pancreática acinar fenotipo celular ^13.

A medida que la desdiferenciación de las células acinares y su transdiferenciación de células ductales es uno de los mecanismos propuestos para la génesis de los cánceres de páncreas exocrino agresivos ^14, el modelo de acinos dispersa es también un sistema adecuado para estudiar la plasticidad pancreática y sus mecanismos moleculares subsiguientes. Además, en combinación con el uso de animales modificados genéticamente ^15,16 y el desarrollo de técnicas de transferencia de genes (adenoviral ² o transducción lentiviral, el uso de las nanopartículas, etc), en este modelo de células acinares primaria in vitro puedeser muy útil en la determinación de cómo diversas disfunciones genéticas afectan la regulación de la diferenciación de células acinares o desdiferenciación y deberían proporcionar una mejor comprensión de los eventos moleculares responsables de la aparición de la pancreatitis, lesiones precancerosas, y los cambios en la plasticidad de las células.

El aislamiento de los acinos dispersa es el enfoque que usamos en nuestro laboratorio con las células acinares pancreáticas cultura. Se describen y discuten el método utilizado. Se trata de la disociación enzimática de tejido pancreático (con una colagenasa bacteriana) acoplado a la disrupción mecánica sin la disociación de las células acinares. Aunque la mayoría de protocolos implican el cultivo de la acinos, en suspensión o en sustratos de plástico especialmente tratadas, les crecen en suspensión sólo brevemente (durante 24 horas), sembrando en ellos después andamios matriz si se requiere cultivo celular prolongado.

Este protocolo permite el aislamiento rápido (en menos de 1 hora) de la dispersión de páncreas de corriente alternaini, sostenible desde hace más de una semana en la cultura. Se permite el aislamiento de más de 20 x 10 ⁶ células acinares por páncreas de ratón. Su simplicidad hace que sea posible procesar de forma independiente un máximo de 10 páncreas en paralelo. Mediante el mantenimiento de la arquitectura intra e intercelular de los acinos y por lo tanto el fenotipo de las células acinares primarias aisladas, este modelo constituye un sistema de elección para el estudio de los mecanismos de transdiferenciación, como todos los otros modelos pancreáticas exocrinas actualmente disponibles se derivan de los tumores pancreáticos se presentan muchos genética alteraciones que conduce a la transformación celular.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por un comité de ética bajo reglamentación de la autoridad gubernamental ("Comité d'Evaluación Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de tránsito de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). Los ratones fueron mantenidos en una instalación específica de animales libres de patógenos en el "Plateforme Anican, Centro Léon Bérard" (Lyon, Francia) y manipulen de conformidad con las directrices institucionales.

Una representación esquemática del procedimiento se muestra en la Figura 1.

1. La disección del páncreas y dilaceración (día 0)

Una disección muy rápido es crítico para un rendimiento óptimo de la extracción y para asegurar una buena viabilidad de las células en cultivo. Con el fin de reducir el tiempo necesario para el aislamiento del páncreas, todos los instrumentos y equipos deben estar preparados antes de la eutanasia del ratón.

1. La eutanasia ratón por asfixia con _CO2 o dislocación cervical.

A partir de este paso, todos los procedimientos tienen que ser realizadas bajo una atmósfera estéril (cabina de seguridad microbiológica, el nivel II) con el equipo de disección estéril.

2. Fijar el ratón y rociar el abdomen del ratón con etanol al 70%. Con las tijeras de disección y pinzas, hacer una incisión en forma de V en el área genital y continuarla hasta el diafragma para abrir completamente la cavidad abdominal.
3. Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, sino que deben permanecer allí si la cavidad corporal está abierta lo suficiente. Tire del intestino y el colon fuera de la cavidad abdominal a su izquierda, y encontrar el recto. Con un par de pinzas curvas y tijeras de disección, agarre y la sección del recto.
4. Con el mismo par de pinzas, cuidadosamente desenrollar por completo el intestino desde el recto hasta el estómago tirando del intestino a la izquierda.

ent "> En este paso, el páncreas se puede distinguir como una pequeña franja entre el estómago y el comienzo del intestino. Sus ligaciones con el bazo permanecen intactos.

5. Uso de Noyes tijeras y un par de fórceps, cortar cuidadosamente el páncreas a lo largo del intestino y liberar con el bazo del resto del tracto digestivo.
6. Coge el bazo y el páncreas sección unido a él (Figura 2).

En este paso, asegúrese de que no hay tejido grasa mesentérica y / u otro tejido adyacente (bazo, intestino, etc) pueden ser recogidos con el páncreas, para evitar la contaminación celular.

Para el resto del procedimiento, todos los tampones deben estar preparados sin calcio de iones Ca ^{2 +} quelantes para evitar la disociación completa del tejido pancreático exocrino en las células acinares individuales.

7. Enjuague el páncreas dos veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) 1x.

En este paso, como el tejido de grasa flotará en contra de páncreas que se hundirá, es fácilmente posible para visualizar y eliminar rápidamente el contaminante tejido adiposo blanco todavía unido a páncreas.

Si necesita el páncreas para ser transportado a las instalaciones de cultivo celular, se debe tener en hielo en HBSS 1x.

8. Transferir el páncreas en una placa de Petri estéril que contiene 5 ml de HBSS 1x. Uso de Noyes tijeras y un bisturí, cortar el páncreas en pequeños trozos de 1 a 3 mm ³ (Figura 3A).

2. Disociaciones enzimáticas y mecánicos de Páncreas (día 0)

1. Transferirlos a un tubo de polipropileno estéril de 50 ml.
2. Se centrifuga durante 2 minutos a 450 xg y 4 ° C. Aspirar y descartar el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas.
3. Añadir 10 ml de solución de colagenasa IA (1x HBSS que contiene HEPES 10 mM, 200 U / ml de collagenaSE IA, y 0,25 mg / ml de inhibidor de tripsina) a las secciones de páncreas. Usando una pipeta de 25 serológica, transferirlos a un matraz de 25 cm ^2. Incubar durante 20-30 min a 37 ° C. Durante este tiempo (cada 5 min), lleve a cabo una disociación mecánica por enérgicamente en movimiento hacia atrás y hacia adelante los fragmentos de páncreas alrededor de diez veces, en pipetas estériles de tamaño decreciente (25, 10, y 5 pipetas serológicas ml).

En este paso, es esencial controlar con frecuencia la medida de la disociación enzimática de secciones pancreáticas.

4. Cuando el tejido pancreático parece ser bien disociado (de acuerdo con la desaparición de los fragmentos pancreáticas y para el aumento de la turbidez de la solución) (Figura 3B), detener la reacción enzimática mediante la adición de 10 ml de solución de lavado fría tamponada (HBSS que contiene 1x 5 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mM de HEPES).
5. Traslado en un tubo de polipropileno estéril de 50 ml y centrifuge durante 2 minutos a 450 xg y 4 ° C. Con cuidado aspirar y descartar el sobrenadante para eliminar la solución de colagenasa IA.
6. Resuspender y lavar el precipitado con 10 ml de solución de lavado tamponada. Centrifugar durante 3 min a 450 xg y 4 º C. Con cuidado aspirar y descartar el sobrenadante. Repita este paso dos veces más.

3. La filtración y la siembra de Dispersed acinos (día 0)

1. Resuspender el sedimento celular en 7 ml de medio de Waymouth que contiene 2,5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina mezcla (PS), 0,25 mg / ml de inhibidor de tripsina, y 25 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF).
2. El filtrado de la mezcla de células por permitiendo que pase a través de un filtro de 100 micras para retener los fragmentos no digeridos (conductos, vasos sanguíneos, y los islotes de Langerhans). Estructuras acinares pancreáticas (acinus de 10-15 células) pasar a través.
3. Enjuague el filtro con 6 ml de medio que contiene FBS al Waymouth, PS, tripsina inhibitor y EGF.

Después de este paso, las células tienen que ser tratado con mucho cuidado, para evitar cualquier acinos disociación.

4. Semilla los acinos aislado en una placa de cultivo de 6 pocillos (2 ml por pocillo) (Figura 3C). Cultura ellas a 37 ° C bajo 5% (v / v) de atmósfera de CO _2.

Después de este paso, las células acinares se cultivan en suspensión.

4. Cultivo de células acinares (Día 1 a 10)

1. Veinticuatro horas después, transferir los acinos (en suspensión) en una nueva placa de cultivo de 6 pocillos, para eliminar las células contaminantes y los restos celulares que se han adherido durante la noche (figura 4).

Si necesita extenderse durante varios días o si las condiciones experimentales requieren células cultivadas en monocapa, se recomienda para la transferencia y la semilla de acinos en andamios de matriz del cultivo celular.

2. El día antes de verding el soporte de la matriz (día 0), recubrir una placa de cultivo de 6 pocillos con colágeno tipo I (5 mg / cm ^2). Añadir 1 ml de solución de colágeno tipo I (50 mg / ml en ácido acético 0,02 M, 0,2 m-filtrada) a cada pocillo y permitir que se adsorba pasivamente sobre plástico, durante 1 hora a 37 ° C (o durante la noche a 4 ° C ).
3. Aspirar la solución de colágeno tipo I y enjuagar el pozo cubierto dos veces con buffer fosfato salino-1x.
4. Deje que el pozo cubierto para secar (en una cabina de seguridad microbiológica) por lo menos 12 horas antes de su uso.
5. Transferir los acinos primaria aislado (obtenida en la etapa 4.1) en el colágeno de tipo I-recubierto placa de cultivo de 6 pocillos y la cultura en las mismas condiciones que las descritas anteriormente (a 37 ° C bajo 5% (v / v) de atmósfera de CO ₂₎ . Las células se adhieren al sustrato de colágeno tipo I durante 2 días.
6. En el Día 3, cambiar el medio de cultivo para eliminar las células no viables que no se han adherido. Con el tiempo en cultivo, las células se progresivamente spleer en el soporte que contiene colágeno. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días (Figura 5).

Las células acinares aislados obtenidos se pueden contar, después de una disociación mecánica completa mediante el uso de una cámara de recuento de células Thoma. Tenga en cuenta que las células acinares aislados no pueden mantenerse en cultivo después.

La calidad de la cultura acinares obtenido puede ser controlado por el control de la expresión de marcadores específicos acinares tales como tripsinógeno, Páncreas Factor de Transcripción 1 subunidad alfa, o carboxipeptidasa A1 (por inmunocitoquímica o experimentos de inmunofluorescencia).

Resultados

La figura 1 esquematiza el método acinos "dispersado" para las células acinares aislamiento primario. Los pasos críticos, que tienen que ser estrictamente respetado durante el protocolo, se describen en la parte de discusión.

Para facilitar su retirada, el páncreas tiene que ser recogida desde el abdomen junto con el bazo adjunto (Figura 2). Ambos órganos tienen que ser cortados a pedazos, y el tejido graso residual que podría ser aún en el...

Discusión

En este protocolo, se describe un procedimiento para el aislamiento de células acinares pancreáticas. Este método hace posible aislar más de 20 x 10 ⁶ células acinares por animal en menos de 1 hora. Gracias a su rápida y fácil aplicación (hasta 10 páncreas se pueden procesar de forma independiente por experimento en paralelo), este protocolo aparece como un buen compromiso entre los métodos de aislamiento existentes ^3-5,9-12,17.

Los pasos críticos / Local...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Dutscher	146560
10 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357551
100 μm filter	Beckton Dickinson	352360
100 mm Petri dish	Beckton Dickinson	353003
1000 μl filter tips	Starlab	S1122-1830
20 μl filter tips	Starlab	S1120-1810
200 μl filter tips	Starlab	S1120-8810
25 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357535
5 ml serological pipettes	Beckton Dickinson	357543
50 ml polypropylene tube	Beckton Dickinson	352070
6-well plate	Beckton Dickinson	353046
Acetic acid 100%	VWR BDH Prolabo	20104.298
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C2676
Curved forceps, Dumont #7	World Precision Instruments	14188	To sterilize before use
Dissecting scissors, straight	World Precision Instruments	14393	To sterilize before use
Epidermal Growth Factor, human	Promokine	C-60180
Ethanol absolute (AnalaR Normapur)	VWR BDH Prolabo	20821.310
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
Forceps, Dumont #5	World Precision Instruments	14098	To sterilize before use
Hank's Balanced Salt Solution 1x	Gibco	14025050
HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)	Lonza	17-737F
Incubator O2/CO2	Sanyo	MCO-19M
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100
Matrigel	Beckton Dickinson	356234
Microbiological Safety Cabinet, level II	Faster	SafeFast Elite 212 S
Noyes scissors, sharp/sharp tips, German	World Precision Instruments	500228-G	To sterilize before use
Penicillin-Streptomycin mixture	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Saline 10x	Gibco	14200067
Pipet-Aid	Drummond Scientific Company	Pipet-Aid XP
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P200	Gilson	F123601
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Scalpel	Paramount Surgimed Ltd.	Disposable Scalpel Size 23
T25 flask, 25 cm2	Sigma-Aldrich	Z707481
Trypsin inhibitor, from Glycine Max	Sigma-Aldrich	T6522
Type I collagen	Beckton Dickinson	354236
Waymouth's medium	Gibco	31220-023