Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

Riepilogo

Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali.

Abstract

Le tecniche di Western Blot che sono stati originariamente stabiliti alla fine del 1970 sono ancora attivamente utilizzati oggi. Tuttavia, questo metodo tradizionale di Western blotting ha diversi inconvenienti che includono risoluzione bassa qualità, bande spurie, diminuita sensibilità e integrità proteina poveri. I recenti progressi hanno drasticamente migliorato numerosi aspetti del protocollo Western Blot standard per la produzione di dati qualitativi e quantitativi più elevati. Il sistema gel Bis-Tris, in alternativa al sistema Laemmli convenzionale, genera una migliore separazione delle proteine ​​e risoluzione, mantiene l'integrità proteine, e riduce elettroforesi per un tempo di 35 min di esecuzione. Inoltre, il sistema blotting secco iBlot, migliora notevolmente l'efficacia e la velocità di trasferimento proteina alla membrana in 7 min, che è in contrasto con i tradizionali metodi di trasferimento proteine ​​che sono spesso più inefficiente con lunghi tempi di trasferimento. In combinazione con queste modifiche altamente innovative, proteine ​​detection utilizzando risultati di imaging fluorescente infrarosso in qualità superiore, più accurato e dati coerenti rispetto alla tecnica Western blotting tenore di chemiluminescenza. Questa tecnologia può rilevare simultaneamente due antigeni differenti sullo stesso membrana utilizzando due colori coloranti vicino infrarosso che vengono visualizzati in canali fluorescenti differenti. Inoltre, la linearità e la gamma dinamica di immagini fluorescenti consente per la quantificazione precisa di bande proteiche sia forti e deboli. Così, questo protocollo descrive i principali miglioramenti al classico metodo di Western blotting, in cui questi progressi aumentano notevolmente la qualità dei dati riducendo notevolmente il tempo di esecuzione di questo esperimento.

Introduzione

La tecnica del Western blotting è stato sviluppato tra il 1977 e il 1979 al fine di creare un metodo migliore per rilevare proteine ​​utilizzando anticorpi ^1-3. Questa procedura utilizzata trasferimento elettroforetico delle proteine ​​di membrane da gel SDS-PAGE con proteine ​​bersaglio visualizzati usando anticorpi secondari e rilevati mediante autoradiografia, luce UV, o un prodotto di reazione perossidasi ^3. Così, questi stessi principi di base sono ancora ampiamente utilizzati in protocolli di Western blot di oggi. Tuttavia, questa tecnica classica Western blotting fa presenti molti svantaggi, quali tempi lenti corsa elettroforetica, bassa risoluzione e bande proteiche artificiali, suscettibilità alla degradazione delle proteine, e limitata sensibilità nonché scarsa qualità dei dati ^4. Pertanto, questo protocollo descrive progressi e miglioramenti significativi alla procedura di Western Blot standard che genera dati qualitativi e quantitativi più precisi.

"> Il sistema di Laemmli per separare una vasta gamma di proteine ​​mediante SDS-PAGE è il sistema gel più utilizzato per Western blotting ^5. Nonostante la popolarità di questo sistema di Western blotting, questo metodo può portare a una distorsione band, perdita di risoluzione, e bande spurie ^4. Questa può essere una conseguenza della deaminazione e alchilazione di proteine ​​a causa del pH elevato (9.5) del gel di separazione, riossidazione di legami disolfuro ridotto grazie alla variabile di stato redox del gel e scissione di aspartil-prolil prestiti stessi al riscaldamento della proteina in tampone Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptidici. Il sistema gel Bis-Tris, che opera ad un pH neutro (7.0), fornisce vantaggi significativi rispetto al sistema Lamemmli. Questo sistema migliora la stabilità della proteina, minimizza modificazioni delle proteine, mantiene le proteine ​​nei loro stati ridotti, impedisce aspartyl-prolyl scissione durante l'elettroforesi, e, soprattutto, il tempo di elettroforesi familiare è 35 min ^4,6,7. Inoltre, tSistema di gel lui Bis-Tris produce anche fasce più nitide, maggiore risoluzione e separazione, e una maggiore sensibilità conseguente dati più affidabili ^4.

In combinazione con il sistema gel Bis-Tris, il sistema blotting secco iBlot utilizza alta intensità di campo e le correnti di ridurre significativamente il tempo di trasferimento delle proteine ​​dal gel su membrane in 7 min ^8. Questo sistema di trasferimento si basa sul metodo blotting secco che genera un trasferimento più efficiente e affidabile di proteine ^​​8. Per un confronto dettagliato dell'efficacia del sistema di trasferimento iBlot ai sistemi di trasferimento convenzionali consultare il seguente sito web: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Si utilizza uno stack anodo e catodo, che sono costituiti da una matrice di gel contenente i buffer di trasferimento appropriate, che fungono da serbatoi di litio ^8. Durante il trasferimento, elettrolisi dell'acqua aiuta a prevenire la generazione di ossigeno dall'anodo rame conseguente trasferimento proteina più coerente senza causare distorsioni banda ^8. Inoltre, questo sistema di trasferimento aumenta anche la velocità di trasferimento riducendo la distanza tra gli elettrodi ^8.

Anche se chemiluminescenza è la tecnica più comune e tradizionale per la rilevazione della proteina di Western Blot analisi, rilevazione fluorescente a raggi infrarossi a due colori migliora notevolmente la sensibilità, la qualità e l'accuratezza dei dati Western Blot. Questo metodo di rilevamento utilizza infrarossi eccitazione laser in due lunghezze d'onda ottimali, 700 nme 800 nm, per generare un'immagine chiara dati con il massimo rapporto segnale-rumore e massima sensibilità ^9. Così, due proteine ​​bersaglio possono essere visualizzate contemporaneamente sulla stessa membrana utilizzando il 700 nm e 800 nm canali di rilevamento fluorescenti. Ancora più importante, la linearità e la gamma dinamica di fluorescenza a raggi infrarossi permette di precisa analisi quantitativa sia forti e deboli bande proteiche ^9. Inoltre, questo protocollo fornisce enormi vantaggi e miglioramenti rispetto alla classica tecnica Western blotting diminuendo l'elettroforesi e tempi di trasferimento di questo esperimento senza compromettere l'efficacia di questi processi e utilizzando rilevazione proteina fluorescente infrarosso per produrre maggiori dati di Western blot qualitativi e quantitativi.

Protocollo

1. Preparazione dei lisati cellulari intero di coltura cellulare

1. Posizionare cellule di coltura piatti su ghiaccio e aggiungere PBS freddo con 5 mM EDTA (es. 5 ml di PBS con 5 EDTA/10 mm cm ² piastra). Rimuovere le cellule aderenti dal piatto usando un raschietto cellulare e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml freddo.
2. Agglomerare le sospensioni di cellule per centrifugazione a bassa velocità a 1000 rpm (230 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Mettere tubi conici su ghiaccio e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
3. Lavare il pellet con 1 ml di PBS con 5 mM EDTA e trasferire sospensione cellulare ad un raffreddore 1,5 ml provetta da centrifuga. Sospensione giro veloce a 13.000 rpm (13.226 xg) per 10 secondi a pellet cellule. Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare i tubi pellet e posto sul ghiaccio.
4. Risospendere il pellet in 25-200 ml (a seconda delle dimensioni del pellet, cioè per 3 x 10 ⁶ cellule aggiungere ~ 150 ml di tampone RIPA) inTampone RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% sodio desossicolato, 1% NP-40) contenente proteasi appena aggiunto e inibitori di fosfatasi ad una concentrazione finale 2x. Brevemente vortice ogni provetta e incubare sospensione per 20-30 minuti in ghiaccio. Nota: ci sono diversi buffer di lisi che possono essere utilizzati per estrarre proteine, che differiscono nella loro capacità di solubilizzare le proteine ​​e la forza della loro detersivo denaturazione (cioè SDS, Triton X-100, o NP-40). RIPA buffer è utile per la preparazione di lisati cellulari totali e interrompere le interazioni proteina-proteina.
5. Per creare una frazione post-nucleare, lisati centrifuga a 14.000 rpm (15.339 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere il pellet e posizionare i tubi nucleare arricchito su ghiaccio. Nota: il pellet nucleare arricchito può anche staccare dal tubo durante l'estrazione del surnatante. Per evitare di raccogliere il pellet nucleare arricchito, posizionare la punta della pipetta direttamente into il pellet nucleare arricchito viscoso e tirarla su con la pipetta, al fine di disporne.
6. Determinare le concentrazioni di proteine ​​di ciascun campione secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando tali dosaggi della proteina di quantificazione come BCA o Bradford.

2. Preparazione del campione e elettroforesi

1. Preparare ogni campione in base alla seguente tabella descritto di seguito. In alternativa, β-mercaptoetanolo può anche essere utilizzato ad una concentrazione finale di 2,5%. Tuttavia, l'agente riducente deve essere aggiunto a ciascun campione fino a un'ora prima di caricare il gel. I conti del volume totale delle variazioni di pipettaggio con soli 20 ml di ogni campione preparato caricati per bene.

   REATTIVO	CAMPIONE RIDOTTO
   Protein Sample	X microlitri
   4x LDS Sample Buffer	6 pl
   500 nM DTT Reducing agente	2.4 microlitri
   L'acqua deionizzata	Fino a 15.6 ml
   Volume totale	24 microlitri

2. Campioni di calore a 70 ° C per 10 min. Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1.000 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa (50 ml 20x MES o MOPS tampone di corsa più 950 ml di acqua deionizzata). MOPS tampone di corsa risolve proteine ​​di medie dimensioni tra 14-200 kDa, mentre MES tampone di corsa si risolve più piccole proteine ​​di peso molecolare tra 2-200 kDa con un pKa inferiore, che permette il MES tampone di corsa per correre più veloce rispetto alle MOPS ^4. Pertanto, questi due buffer hanno effetti sulla migrazione di ioni all'interno del gel di impilamento che porta a differenze nella separazione delle bande proteiche ⁴ contrastanti. Mettere da parte e unire 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa con 500 ml di antiossidanti, che saranno utilizzati per riempire il buffer Sezione del Min SuperioreUnità di elettroforesi i-Cell.
3. Una volta che i campioni sono finiti riscaldamento, campioni giro veloce prima di immetterli sul ghiaccio.
4. Per il montaggio dei prefabbricati gel Bis-Tris nell'unità di Mini-Cell per elettroforesi seguire le istruzioni del produttore. Nota: assicurarsi che ogni gel è orientata in modo tale che il più breve (minore) cassette di ogni gel rivolto verso l'interno verso il Buffer Core e gel sono di livello e ben premuto contro il buffer core per evitare perdite dal Buffer Camera Alta.
5. Riempire il Buffer Camera Alta con 200 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa contenente la antiossidante e Buffer Camera dell'unità Mini-Cell con circa 600 ml di MES 1x o MOPS tampone di corsa inferiore. I supplementari 200-300 ml di tampone di corsa possono essere salvate per un uso successivo. Tuttavia, non è consigliabile per riciclare il buffer utilizzato durante la corsa elettroforetica come il pH e la qualità del buffer possono essere modificati.
6. Caricare 20 ml di ogni samp proteinele in ogni pozzetto. Se sezionare la membrana in varie strisce, al fine di verificare la presenza di anticorpi multipli (cioè più di 2), si consiglia vivamente di caricare 2-5 microlitri della norma proteina prestained nel primo e ultimo pozzetti di ogni gel come questo servirà come guide di taglio per separare le varie sezioni della membrana senza influenzare la rappresentazione delle bande proteiche.
7. Gel funzionare a 200 V costante per 35 min con una corrente previsto di 110-125 mA / gel all'inizio e 70-80 mA per gel alla fine. L'elettroforesi è completa quando il colorante inseguimento migra verso il filo di platino lungo il buffer core.

3. Proteina di trasferimento Uso del Blotting sistema iBlot Dry

1. Completamente separare i mini-gel rompendo le parti incollate della cassetta (puo 'produrre un rumore crepitante). Eliminare il corto (piccolo) piastra e trasferire accuratamente il gel dalla più lunga (intaglio), piastra in un contenitore con acqua deionizzata erimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Nota: in rari casi, il gel può allegare alla piastra inferiore invece della più lunga, intaglio piatto. In questo caso, scartare il più lungo, piastra scanalata e rimuovere la parte spessa zampe del gel trova nella parte inferiore. Poi, trasferire accuratamente il gel dalla piastra inferiore di acqua deionizzata.
2. Montare l'anodo e catodo trasferimento pile secondo le istruzioni del produttore. Nota: entrambi nitrocellulosa o PVDF membrane di fornire alta qualità ed efficiente trasferimento delle proteine ​​e sono compatibili con la rilevazione fluorescente ^8. Tuttavia, membrana PVDF ha una elevata capacità di legame (240 g / cm ³⁾ di nitrocellulosa (200 g / cm ^{3) 8.}
3. Rimuovere accuratamente eventuali bolle o aria intrappolata tra il gel e la membrana in modo da evitare qualsiasi distorsione delle bande proteiche durante il trasferimento. Nota: non tagliare la membrana o il trasfer impilare per misura il vostro formato gel come questo farà sì che il contatto diretto tra anodo e catodo stack.
4. Dopo aver montato correttamente le pile di trasferimento sul dispositivo assorbente asciutto, selezionare il programma tensione appropriata (ad esempio Programma 3: 20 V per 7 min) e iniziare il trasferimento. Nota: proteine ​​superiore a 150 kDa tendono migrare più lentamente e possono richiedere un tempo più lungo di trasferimento 8-10 min. Inoltre, prima incubazione del gel in etanolo al 20% per 5-10 min contribuirà anche a migliorare l'efficienza di trasferimento di queste grandi proteine. Una volta che il programma di trasferimento è completo, il dispositivo si spegne automaticamente la corrente. È meglio rimuovere immediatamente la membrana e procedere con la procedura di blocco per garantire una migliore rilevazione delle proteine ​​ed evitare di seccare la membrana.

4. La rilevazione infrarossa proteina fluorescente

1. Membrana Block (s) in un minimo di 0,8 ml / cm ² di Odyssey Blocking Buffer (non aggiungere Tween-20) per 1 ora onotte a 4 ° C. Membrana (s) può anche essere bloccato con latte in polvere senza grassi, ma puo causare alto sfondo ed interferire con il rilevamento di proteine.
2. Incubare membrana (s) in anticorpo primario alla concentrazione desiderata in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 notte a 4 ° C. Per il rilevamento di due colori, in cui due antigeni differenti vengono visualizzati sullo stesso blot, i due anticorpi primari devono essere derivati ​​da diverse specie ospiti e aggiunte contemporaneamente alla membrana (s). Nota: prima dell'incubazione la membrana (s) in anticorpo primario, la membrana (s) può essere sezionato in vari pezzi, al fine di rilevare anticorpi multipli (cioè più di 2) sulla stessa membrana.
3. Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento.
4. Incubare membrana (s) con gli anticorpi secondari fluorescenza marcata ad una diluizione di 1:20.000 per il canale 700 nm e 1:6,000-1:10,000 per il canale 800 nm in Odyssey tampone di bloccaggio con 0.1% Tween-20 per 30-60 min (incubando membrana (s) per più di 1 ora può aumentare background). Proteggere membrana (s) dalla luce. Nota: gli anticorpi secondari devono essere ottenuto dalla stessa specie ospiti ciascuno degli anticorpi primari e marcato con differenti fluorofori.
5. Lavare membrana (s) 3x per 10 min in TBS più 0,1% Tween-20 con un leggero scuotimento. Proteggere membrana (s) dalla luce.
6. Membrane (s) può essere essiccato o conservato sia in TBS o PBS senza Tween-20 a 4 ° C fino digitalizzato e ripreso con un sistema di imaging a raggi infrarossi. Segnale fluorescente rimane stabile per diversi mesi se adeguatamente protetto dalla luce.

Risultati

Due colori di fluorescenza a raggi infrarossi rileva bande sia forti e deboli sulla stessa membrana con una maggiore sensibilità e il più alto rapporto segnale-rumore per produrre immagini chiare di Western blot. I risultati tipici generati da due colori rilevamento Western blot visualizzato sia nel 700 nm e 800 nm canali fluorescenti sono esemplificati nelle figure 1 e 2. Il Western blot superiore nella Figura 1 mostra la concomitante (overlay) rivelazione di totale ...

Discussione

I passaggi critici nella generazione di alta qualità, macchie occidentali quantitativi in ​​base a questo protocollo sono i seguenti: 1) misurare le concentrazioni di proteine, 2) la preparazione del campione; 3) bloccando la membrana e, 4) qualità e calibro dell'anticorpo primario.

La precisione della misurazione delle concentrazioni di proteine ​​totali può avere un impatto importante sulla quantificazione bande proteiche in quanto la eccezionale sensibilità di rilevazione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A