Renal Isquemia Reperfusão: um modelo do rato de lesão e regeneração

Resumo

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Resumo

Renal lesão de isquemia e reperfusão (IRI) é uma causa comum de lesão renal aguda (IRA) em pacientes com oclusão do fluxo sanguíneo renal é inevitável durante o transplante renal. Modelos experimentais de que precisa e reproduzível recapitulam IRI renal são cruciais em dissecar a fisiopatologia da LRA e do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Apresentado aqui é um modelo do rato do IRI renal que resulta em reprodutível AKI. Isto é conseguido por uma abordagem laparotomia mediana para a cirurgia com uma incisão que permite tanto uma nefrectomia direita que fornece tecido controlo e de aperto do pedículo renal esquerda para induzir isquémia do rim esquerdo. Por cuidadosa monitorização da posição de aperto e a temperatura do corpo durante o período de isquémia este modelo consegue lesão funcional e estrutural reprodutível. Os ratinhos sacrificados 24 horas após a cirurgia demonstrar a perda da função renal com a elevação do nível de creatinina no soro ou no plasma, bem como estruturasdanos nos rins tural com necrose tubular aguda evidente. A função renal melhora e a lesão tecidual aguda resolvida no decurso de 7 dias após o IRI renais tais que este modelo pode ser usado para estudar a regeneração renal. Este modelo de IRI renal tem sido utilizada para estudar a fisiopatologia molecular e celular do AKI, bem como a análise da regeneração renal subseqüente.

Introdução

Isquemia lesão de reperfusão (IRI) é um modo comum de lesão de múltiplos órgãos, incluindo o rim, coração e cérebro. Renal IRI pode levar à lesão renal aguda (LRA) em pacientes e nenhum tratamento específico está disponível. AKI como resultado da IRI tem uma patogênese complicada que envolve tanto a resposta imune inata e adaptativa ^1. Um modelo experimental de IRI renal oferece o potencial para dissecar as células-chave e mediadores envolvidos na patogênese da IRA, bem como a regeneração renal subseqüente que segue ao longo de dias subseqüentes. Além disso, os efeitos dos agentes terapêuticos sobre os processos de doença podem ser avaliadas.

O objetivo geral do modelo experimental de IRI renal descrito aqui é induzir tanto lesão renal funcional e estrutural aguda. Alguns investigadores utilizaram um modelo que envolve a indução de IRI bilaterais ^2. Embora o modelo IRI renal bilateral é de uso, o ren unilateralmodelo al IRI tem a vantagem de uma nefrectomia direita a ser realizado no momento da cirurgia. O tecido nefrectomia direita serve como tecido de controlo valiosa em estudos envolvendo uma etapa de pré-tratamento que tanto induz ou reprime a expressão de um gene ou proteína. Por exemplo, temos usado este modelo para avaliar os efeitos pré-condicionamento do heme arginato (ha) de injeção de 24 horas antes da IRI renal ^3. A indução bem sucedida do citoprotector enzima heme-oxigenase-1 (HO-1) por HA antes IRI foi confirmada no tecido controlo nefrectomia direita ^4. HA reduzido IRI renal em camundongos idosos, em parte, através de um HO-1 mecanismo dependente. Da mesma forma, temos utilizado o modelo em estudos de depleção de macrófagos para examinar o papel dos macrófagos em IRI renal ^5. A análise imunohistoquímica do tecido nefrectomia direita pode ser usado para confirmar a eficácia do método de ablação. O tecido nefrectomia direita pode, portanto, ser utilizada tanto para confirmar e quantificar o nível de induction ou inibição da molécula de interesse de cada animal experimental individual. Este modelo será de interesse para os pesquisadores que estão usando drogas ou outros compostos para modular a expressão de genes ou proteínas, etc, antes da indução da IRI renal.

Outros estudos usaram incisões flanco para acessar os rins. O modelo descrito aqui utiliza uma única cirurgia na linha média abdominal para executar tanto a nefrectomia direita e induzir isquemia reperfusão do rim esquerdo. Esta abordagem cirúrgica oferece excelente visualização do campo cirúrgico, incluindo os pedículos renais e alterações de cor que seguem renal fixação do pedículo. A nossa experiência com o modelo publicado ^4-6 indica que os ratos se recuperar rapidamente da cirurgia com uma taxa de sobrevivência de perto de 100%.

Por fim, a análise da cinética do modelo ao longo de um período de 7 dias, indicam que este modelo exibe restauração de tanto a função renal e integridade tubular, comproliferação de células epiteliais tubulares significativa.

Protocolo

NOTA:. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos impostos pelos Animais (Scientific Procedures) Act 1986 procedimentos foram realizados utilizando (autoclavados) instrumentos e consumíveis cirúrgicos estéreis. Embora o modelo de murino de IRI renal apresentado aqui foi realizada num macho de 8 semanas de idade Balb / c do rato pode ser executada de forma reprodutível em uma variedade de estirpes de murinos de ambos os sexos com idades compreendidas tipicamente entre 7-15 semanas, com a idade ser óptima 8 semanas. Os dados apresentados na seção de resultados representante foi obtido de ambos Balb / c e camundongos FVB. A aplicação de uma solução salina aquecida é usada para manter os intestinos e área cirúrgica húmido mas deve ser cuidadosamente controlada e mantida a um mínimo, como uma aplicação excessiva de fluidos pode levar a um artefacto abaixamento do soro ou plasma, os níveis de creatinina, o que é um importante leitura experimental.

1. Preparação Animal e Laparotomia

1. Anestesiar o rato com cloridrato de cetamina (70 mg / kg) e cloridrato de medetomidina (1 mg / kg) por via intraperitoneal e confirmar a profundidade da anestesia, pela perda de reflexos por exemplo, aperto do dedo do pé. A duração do plano anestésico resultante é de 4 horas. Isto é suficiente para realizar todo o procedimento cirúrgico e sem anestesia suplementar se necessário.
2. Remova o cabelo em torno da área de incisão, garantir que a área está livre de cabelos soltos, e higienizar a pele abdominal utilizando uma solução diluída de clorexidina.
3. Posicione o mouse sobre um bloco cirúrgico aquecido em decúbito dorsal e corrigir os membros superiores e inferiores para a plataforma usando fita adesiva de baixa aderência. Certifique-se de que as extremidades superiores sejam mantidas na sua posição normal para evitar a compressão do pulmão. Durante todo o processo monitorar o mouse para queimaduras térmicas. Se possível, é recomendado que uma fonte de calor não-eléctrico ser utilizado.
4. Administrar o cloridrato de analgésico de buprenorfina (0,06 mg / kg)subcutânea e aplicar lubrificante ocular para os olhos para evitar o ressecamento da córnea. Analgésicos são administrados no pré-operatório, a fim de auxiliar a recuperação pós-cirúrgica.
5. Usando tecido separando tesoura ou lâmina de bisturi fazer uma incisão na linha laparotomia e sem rodeios separar a pele do peritônio. Isto permite que a pele e do peritoneu para ser suturada separadamente durante o fechamento da ferida. Uma incisão da alba avascular linea é feito dando acesso à cavidade peritoneal.
6. Para criar uma visão clara da área cirúrgica inserir um afastador e armar o mouse.

2. Divisão Ureter e nefrectomia direita

1. Com cuidado, empurre o intestino para o lado esquerdo da cavidade abdominal usando cotonetes esterilizados autoclavados umedecidas com soro fisiológico para expor o rim e do ureter direito. Cubra os intestinos com cortinas umedecido para evitar a secagem.
2. Levante o ureter direito com uma pinça em ângulo. Ligadura do ureter direito duas vezes, utilizando 6/0 silsutura k-trançado. Para os experimentos de longo prazo, utilizar suturas absorvíveis para todas as cirurgias abdominais.
3. Dividir o ureter entre as suturas. Embora a junção vesico-ureteral deve evitar que a urina escorra para o peritoneu da bexiga do ureter é ligado como uma salvaguarda contra qualquer fuga no pós-operatório durante as experiências de longo prazo.
4. Para permitir o acesso mais fácil ao realizar a nefrectomia direita, empurre o fígado para cima e para a direita com um cotonete umedecido e mantenha no lugar usando gaze umedecida para expor a artéria renal direita e veia.
5. Bluntly dissecar o tecido conectivo e a gordura ao longo do aspecto medial do rim direito quanto à artéria renal direita, e a veia.
6. Criar um canal de debaixo da artéria e veia renal cuidadosamente a pinça deslizante angulares por baixo dos vasos sanguíneos. Orientar a pinça por baixo com as pontas fechadas e remover suavemente com as pontas abertas, a fim de facilitar a formação do canal.
7. Repetir o passo 2.6 até que as pontas das pinças são visíveis através dos tecidos conjuntivos, logo acima da artéria e veia renal. Uma vez visível esfregar suavemente as pontas das pinças contra as pontas de um outro conjunto de pinças anguladas para quebrar delicadamente o tecido conjuntivo.
8. Com a artéria e veia renal claramente acessível eles agora podem ser ocluído. Deslize cuidadosamente uma pinça em ângulo abaixo da artéria renal e veia com as pontas fechadas. Uma vez no local abrir as pontas das pinças e orientar o aplicador clipe hemostático entre as pontas e firmemente aplicar um clipe hemostático na artéria e veia renal próxima ao rim. Em alternativa, a artéria e veia renais podem ser ligados utilizando 6/0 de seda trançada sutura.
9. Dividir a oclusão da artéria renal e veia perto do rim, o qual pode agora ser removido de qualquer tecido conjuntivo aderente remanescente.
10. Remova qualquer gaze usada para manter o fígado e os intestinos substituir com cotonetes.

3. Isquemia rim esquerdo e reperfusão

1. Com cuidado, empurre o intestino para o lado direito da cavidade abdominal com cotonetes para expor o rim esquerdo e do ureter e cubra com cortinas umedecidos. Se necessário, os pâncreas pode ser desviado com gaze umedecida para permitir o acesso mais fácil.
2. Use dissecção romba para quebrar delicadamente os tecidos conjuntivos anterior e posterior à artéria renal esquerda e veia, e, em seguida, criar um canal sob os vasos de forma semelhante ao descrito no Ureter Divisão e nefrectomia direita passo 2.4.
3. Induzir isquémia do rim esquerdo, aplicando um clipe serrafine micro na artéria e veia renal. Isquémia bem sucedida pode ser confirmada visualmente por um escurecimento uniforme gradual do rim. Os vasos sanguíneos para além da artéria renal esquerda e a veia pode, ocasionalmente, fornecer o rim. Se estiver presente, também vai precisar destes vasos sanguíneos adicionais a serem fechados com grampos serrafine micro a fim de sucessoinduzir isquemia de todo o rim.
4. Substitua os intestinos e cuidadosamente garantir que não haja torções bruscas que podem levar à isquemia intestinal resultados comprometedores. Temporariamente fechar o peritônio com uma única sutura.
5. Após a indução de isquemia colocar imediatamente o rato sobre um cobertor homeotérmicos, com um termistor rectal ligado a uma unidade de controlo que vai manter a temperatura do corpo a 37 ° C durante a duração do período de isquémia. Para definir o comprimento apropriado da isquemia necessária para induzir o desejado grau de lesão renal e insuficiência renal, recomenda-se que uma titulação de ser executada para cada estirpe e operador cirúrgico.
6. Pouco antes do final do período de isquemia reabrir o peritoneu e posicionar cuidadosamente o intestino para permitir o acesso ao grampo e visualizar o rim. A inserção do afastador, como mostrado no vídeo, não é necessário e foi apenas realizada para fins de apresentação.
7. Retire o clamp após o período de isquemia concluiu. Imediatamente após a remoção do rim vai rapidamente mudar de cor de um marrom escuro para um rosa escuro saudável indicando reperfusão bem sucedida.
8. Novamente assegurar que os intestinos não são torcidos antes do fechamento do peritoneu com um ponto cobertor com 6/0 sutura de seda trançada. Em seguida, feche a pele usando clipes de pele metálicos.
9. Para minimizar o risco de infecção pós-operatória, aplicam-se um anti-séptico tal como uma solução de iodo / álcool para a área cirúrgica.

4. Pós-operatório de Recuperação e Cuidados

1. Anestesia parcialmente inversa com cloridrato de atipamezol (2 mg / kg) por via subcutânea e administrar fluidos com uma injecção subcutânea de 1 mL de soro fisiológico aquecido para evitar a desidratação após a cirurgia.
2. Acompanhar atentamente os ratos até que tenham recuperado a consciência, parece alerta e são capazes de endireitar-se.
3. Permitir ratinhos para recuperar numa caixa aquecida mantida a 29 ° C, locciado em um ambiente tranquilo, por 24 horas. Ratos terá uma capacidade diminuída para regulação térmica devido à anestesia e, por conseguinte, é essencial que eles estão alojados a uma temperatura elevada para permitir a recuperação eficaz. Alimento humedecido também pode ser fornecida para estimular a ingestão de fluidos e da nutrição.
4. Para os experimentos de recuperação a longo prazo fornecer analgésicos em curso e retirar grampos de pele 7 dias após a cirurgia.

5. Avaliação Funcional e Estrutural lesão renal e Regeneração

1. O sangue pode ser recolhido a partir da veia da cauda durante as experiências ou por punção cardíaca na hora da eutanásia no final da experiência. Medir a função renal pela creatinina sérica, usando um método baseado creatinase e uréia (BUN) em um analisador bioquímico centrífuga como descrito anteriormente ^7. A função renal de ratos normais e saudáveis ​​precisa ser determinado antes de estabelecer um modelo de insuficiência renal, pois isso pode variar acentuadamente depending no método de análise utilizado, por exemplo a reacção de Jaffe e métodos creatinase base para a medição da creatinina dar resultados diferentes.
2. Examine estrutura renal por histopatologia em parafina cortes de tecido do rim corados com hematoxilina e eosina (H & E) ou ácido periódico Schiff (PAS). Capturar entre 5 - 10 imagens em 200x de ampliação dentro da faixa externa da medula externa (OSOM) para cada rato. Avaliar o nível de lesão no OSOM como esta região é ferido neste modelo porque é altamente vulnerável à hipóxia.
3. Use qualquer um dos dois sistemas de pontuação detalhadas abaixo para medir necrose aguda tubular (RTA) ou regeneração. Morfologia representativa das classificações utilizadas nestes sistemas é ilustrada na Figura 1.
4. Use um sistema binário simples para marcar ATN. Com base na integridade celular e marca morfologia e contar túbulos tanto como viável (a morfologia das células intactas) ou necrose (inte célula comprometidagrity, morfologia celular anormal, ou perda de células).
   1. Exprime-se o número de túbulos necróticas como uma percentagem do número total de túbulos (necrótica túbulos%).
5. Classificar regeneração utilizando outro sistema com base na integridade celular, a morfologia e o número de núcleos. Mark e contam túbulos tão saudável, necrótica, feridos ou em recuperação de acordo com os critérios indicados nas etapas seguintes.
   1. Tal como acontece com o sistema de pontuação ATN (detalhado no passo 5.4) túbulos marca com células normais saudáveis ​​intactas como túbulos enquanto mostrando a integridade das células comprometidas, morfologia celular anormal ou perda celular evidente devem ser marcados como necrótica.
   2. Classifique túbulos como feridos se eles têm um citoplasma diluído contendo alguns núcleos. Em contraste, designar túbulos contendo mais núcleos com mais morfologia celular normal, tal como a recuperação.
   3. Expresse cada classificação túbulo como uma porcentagem do número total de túbulos.

Resultados

Lesão tubular e recuperação pode ser avaliada por H & E ou coloração PAS de cortes de tecido seguintes IRI renal. Túbulos localizados dentro do OSOM são classificados como saudável, feridas, necrose ou a recuperação de acordo com a morfologia da célula, a integridade e o número de núcleos (Figura 1). A lesão funcional e estrutural neste modelo é dependente da duração da isquemia. Um aumento progressivo da gravidade da disfunção renal, avaliada pela concentração plasmática de cr...

Discussão

Renal IRI é uma importante causa de LRA sem tratamento específico disponível. O estudo experimental de IRI renal tem sido altamente informativos com trabalhos anteriores demonstrando o papel de macrófagos, células dendríticas, linfócitos T, células-regulação, assim como outras células e mediadores na indução de tanto a lesão aguda e da fase de cicatrização ^{de 5,8 - 16.} Além disso, o IRI renal experimental foi usado para avaliar o efeito de vários agentes terapêuticos ^4,17-19.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10
Micro-Adson forceps (Rat toothed)	Fine Science Tools	11019 - 12
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled	Fine Science Tools	00649-11
Colibri retractor	Fine Science Tools	17000 - 04
Micro clip applicator	Fine Science Tools	18057-14
Micro serrafines	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Hemoclip Plus Ligating Clips Small	Weck	533837
Autoclip Wound Clip System, 9mm	Harvard Apparatus	PY2 52-3748
Silk Black Braided Suture, Size 6-0	Harvard Apparatus	723288
Standard Heat Matt
Homeothermic Blanket & Control Unit	Harvard Apparatus
Lacri-Lube	Allergan
Vetasept Chlorhexidine	AnimalCare
Vetalar : Ketamine hydrochloride			100 mg/ml solution
Domitor : medetomidine hydrochloride			1 mg/ml
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride			0.3 mg/ml
Antisedan : Atipamezole hydrochoride			5 mg/ml