중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술<i&gt;를 통해</i&gt; 내부 경동맥

요약

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

초록

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

서문

중추 신경계의 생체 내 모델 (CNS) 질환은 뇌에 이러한 약물, 병원균 또는 엑소 좀과 같은 외래 물질의 효과적인 전달을 필요로한다. 따라서, 이상적인 전달 방법은 동물에게 최소의 외상을 유발하는 신경 네트워크의 무결성을 유지하고, 뇌 ^한 높은 약물 농도를 달성한다.

지방 물질 전달의 여러 가지 수술 방법은 인트라 - 시스, 뇌내, 뇌 실내 주사 나 ^{주입, 2, 3, 4, 5를} 포함하여 기술되었다. 이러한 방법은 그러나, CNS 외상으로 간주하고, 관심 물질의 낮은 양의 관리를 허용한다. 또한, 외인성 물질이 빠르게 뇌척수액 ^(6)에 의해 제거 할 수 있다고 제안되어왔다 및 상술 한 기술이 사용될 때 뇌 실질 저 투과 범위는 ⁷ 관찰되었다. 그들은 CNS에 물질 전달이 낮은 효과를 발휘하지만 경구, 폐, 피하, 정맥 내 경로 등의 전신 전달 방법은 흔히 다른 기관 ^{(8), (9)의} 흡수로 인해, 동물 모델에서 이용된다. 따라서, 전달 노선들은 부작용 및 독성이 ^{10, 11의} 위험을 증가 투여 물질의 높은 투여 량을 필요로한다.

여기서는 효과적으로 직접 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 제공하는 마우스 미세 주입 기술을 설명한다. 중추 신경계에 대한 전달을 대상으로하는 것 외에도,이 기술은 정상적인 생리 장벽을 우회하므로 biologica에 매우 관련이없는뇌 내로 치료제 또는 병원체 통로 (L)에 관여 프로세스.

프로토콜

다음 프로토콜에 관련된 절차는 마이애미 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 또한, 모든 절차는 실험 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 승인을 시설에서 진행되고있다.

외과 마우스 1. 준비

1. 실험실 마취 시스템을 이용하여, 산소와 혼합하여 이소 플루 란 마취 마우스. 2 L에 %와 산소 흐름 4-5 사이에 설정에서 이소 플루 란을 사용하여 / 상업 시스템에 분 (재료 표 참조). 실체 현미경 하에서 수술면에 동물을 전송하고, 노즈콘을 사용하여 마취를 유지 (- 2 L / 분으로 2.5 1.5 산소 유량 설정 이소 플루 란을 사용한다).
   1. 허걱없이 2 호흡 / 초 - 마우스 호흡 속도가 1 주위에 있는지 확인하십시오. 또한, 동물의 수염 자극 반응 페달 (R)가 발생하지 않도록eflex (발가락 핀치). , 수술 동안 적어도 매 5 분 호흡 속도와 노력을 모니터링합니다. 설치류 마취 모니터링을 위해 특정 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 수의학 지침을 따르십시오.
2. 건조 함을 예방하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 각각의 눈에 대한 안과 용 윤활제 방울을 적용한다. 항 염증 및 통증을 완화하는 진통제의 투여는 권장합니다.
3. 동물의 뒷면에 누워, 코 콘을 사용하여 마취를 유지한다.
4. 지역을 에탄올 70 %와 클로르헥시딘로 3 회 닦아 동물의 목 영역을 청소합니다. (아래에 설명)을 면도칼을 사용하여 동물의 수술 영역을 면도.

경동맥 2. 해부 (CCA)

1. 실체 현미경 하에서 전체 미세 절차를 수행합니다. 수술 가위를 사용하고 집게은 가슴 위에서 t 이하로, 목에 얕은 중간 선 절개를 수행그는 (약 3 ~ 4 cm)를 턱.
2. 집게를 조심스럽게 분리 지방 및 결합 조직을 사용하여 기관을 노출시킨다.
3. 더 영역을 노출, 목을 연장 마우스의 목에의 뒷면에 베개 (라운드 개체, 직경 약 0.5 cm)를 놓습니다.
4. 조직 권취 또는 후크를 사용하여 조직을 분리한다.
5. 기관의 동물의 왼쪽에서 조심스럽게 왼쪽 CCA를 노출 할 수있는 결합 조직을 분리 tweeze.
6. 사용 포셉 신중하게 CCA의 분기점을 노출하는 모든 결합 조직, 모두 외부 및 내부 경동맥의 시작을 제거합니다.

약물 주입을위한 CCA 3. 준비

1. 집게를 사용하여, 외부 경동맥에서 나일론 봉합사 (약 1cm 각)의 두 개의 세그먼트 (ECA)를 삽입합니다.
2. ECA의 가능한 가장 높은 지점에서 영구 매듭을 놓습니다.
3. ECA의 가능한 가장 낮은 지점, 바로 CCA의 분기점 위의 장소에서이동식 매듭. 이 매듭은 상부 매듭에 비해 느슨합니다.
4. 가장 낮은 지점에서, 용기 클립을 사용하여 CCA를 닫습니다.
5. 용기 클립을 사용하여 내 경동맥 (ICA)를 닫는다.
6. 사용하여 미세 절제 스프링 가위는 두 매듭 사이 ECA (약 2mm)에 작은 상처를 수행합니다.

ICA를 통해 4. 약물 주입

1. 주입 시스템을 조립합니다. 모세관 튜브 6 인치 (이상적인 크기 : 2.5 mm X 1.2 mm)를 부착 물질의 250 μl를 포함하는 투베르쿨린 주사기는 (마약, 병원균, 다른 사람의 사이에서 세포 외 소포를) 주입 및 수행 절개로 부드럽게 모세관 팁을 삽입한다 단계 3.6 인치
2. 가 분기와 CCA를 폐쇄 클립 사이의 중간 점에 도달 할 때까지 모세관을 아래로 슬라이드를 계속합니다.
3. 낮은 ECA 매듭을 묶어. 매듭은 모세관 유동을 허용 할 정도로 느슨하고 leakin을 방지하기에 충분히 단단한 지 확인지.
4. ICA에에서 클립을 제거합니다.
5. 조심스럽게 주사기 피스톤 허용 물질 주입 초당 약 10 μL에 압력을 적용합니다.

5. 사후 주입 절차

1. 장소는 ICA에 다시 클립.
2. 조심스럽게 모세관 튜브를 제거합니다.
3. 완전히 낮은 ECA 매듭을 묶어.
4. ICA에와 CCA에서 클립을 제거합니다.

6. 절개 결산 및 수술 후 케어

1. 트랙터 또는 조직 후크와 베개를 제거합니다.
2. 멸균 생리 식염수를 사용하여 청소 봉합 영역입니다.
3. 나일론 봉합사 / 바늘과 집게를 사용하여 절개를 닫습니다.
4. 항 염증 및 진통이 수술 후 불편 함을 완화하기 위해 관리 할 수 ​​있습니다.
5. 적어도 1 시간 모니터 복구를 위해 가열 패드에 배치 새장에 동물을 배치합니다.

결과

여기에 설명 된 마우스 미세 주입 기술은 매우 다목적 뇌 전이의 형성 ^{(1) (12)의} 대표 모델에서 종양 세포의 전달을 포함하여 직접 뇌에 다른 물질을 전달하기 위해 사용되어왔다.

이 기술은 또한 CNS 다른 병원균의 병리학 적 양상을 평가하기에 적합하다. HIV 감염의 마우스 모델에서...

토론

여기에 설명 된 주입 미세는 본체 ^{(1), (12)을} 통해 원치 않는 확산을 방지 CNS에 다양한 생물학적 기능 외인성 물질을 전달하는 매우 성공적인 것으로 판명되었습니다. 혈액 - 뇌 장벽을 중단 여러 CNS 관련 질환의 병리학 적 특징이다; 따라서 혈뇌 장벽 외인성 물질의 관계를 평가하는 것은 매우 중요하고 흥미 롭다.

선물이 수술 모델...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005