Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Resumen

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Resumen

La determinación del proceso de plegado de las proteínas de su secuencia de aminoácidos en su estructura 3D nativa es un problema importante en biología. Microscopía de fuerza atómica (AFM) puede solucionar este problema permitiendo el estiramiento y relajación de las moléculas de proteína única, que da una evidencia directa de despliegue y refolding características específicas. Basada en AFM solo-molécula-espectroscopia de fuerza (AFM-SMF) proporciona un medio para medir consistentemente alta energía conformaciones de las proteínas que no son posibles en las mediciones (bioquímicos) a granel tradicionales. Aunque numerosos artículos fueron publicados para mostrar principios de AFM-SMF, no es fácil llevar a cabo experimentos de SMF debido a la falta de un protocolo de manera exhaustiva completa. En este estudio, nos ilustran brevemente los principios de la AFM y detalle ampliamente los protocolos, procedimientos y análisis de datos como guía para lograr buenos resultados de los experimentos de SMF. Demostramos representante SMF resultados de proteína único mecánico despliegue mediciones y proporcionar resolución de problemas estrategias algunos comúnmente encontrado problemas.

Introducción

Avances en espectroscopía de fuerza sola molécula (SMF) por AFM permitieron manipulación mecánica y caracterización precisa de las moléculas de proteína sola. Esta caracterización ha producido nuevos insights sobre proteína mecánica^1,2, proteína plegable³, de las interacciones proteína-ligando⁴, de las interacciones proteína-proteína⁵, y basados en proteína de ingeniería materiales^6,7,8. SMF es especialmente útil para el estudio de proteína desplegar, estirar por AFM permite los vínculos químicos y físicos dentro de la molécula de proteína para extender gradualmente según su rigidez, que da lugar a una constantemente creciente longitud del contorno. Este estiramiento excesivo de una molécula de proteína puede producir una brusca transición en la curva de fuerza de extensión en un evento de ruptura (o fuerza pico). El pico de fuerza da información directa en el cambio estructural y la fuerza de despliegue de la proteína durante el proceso de despliegue mecánico. Uno de los primeros estudios utilizando AFM mide titin¹ y encontrar aspectos novedosos de la proteína despliegue y refolding bajo condiciones fisiológicas sin el uso de desnaturalizantes antinatural como productos químicos concentrados o temperaturas extremas.

SMF experimentos se llevan a cabo en una variedad de instrumentos, aunque aquí consideramos sólo la AFM. La AFM se compone de cuatro elementos principales: la sonda, el detector, el sostenedor de la muestra y el analizador piezoeléctrico. La sonda es una punta afilada en el extremo bogie de un voladizo. Después de la calibración, doblez del voladizo durante estiramiento de una molécula adjunta se mide utilizando un rayo láser que se refleja la parte de atrás de la micropalanca para determinar precisamente las fuerzas utilizando la ley de Hooke. Los proyectos del haz láser reflejada en un detector de fotodiodo de cuadrante que produce un voltaje proporcional a la dislocación de la viga de láser diodo del centro de la. El sustrato con la muestra de proteína en líquido está montado en un escenario 3D piezoeléctrico que puede ser controlado con precisión sub-nanométrica. Una computadora lee la tensión de los detectores de fotodiodos y controla el escenario 3D a través de una fuente de voltaje controlada por ordenador. Estas etapas del actuador piezoeléctrico se equipan generalmente capacitivo o galga de tensión sensores de posición precisamente desplazamiento de piezo medida y correcta histéresis a través del sistema de control de retroalimentación. La salida de señal de sensor del controlador piezoeléctrico se convierte en distancia mediante la constante tensión de la piezoeléctrico que está calibrado en fábrica. Una curva de fuerza de extensión de ejemplo de un experimento de tracción se muestra en la figura 2.

Hay dos tipos de experimentos de AFM-SMF: velocidad constante y fuerza constante tirando de las mediciones. Medidas de fuerza constante SMF se describen en Oberhauser et al. ⁹, mientras que aquí nos centramos en medidas de velocidad constante. Un típico experimento tirando de velocidad constante AFM realiza proporcionando voltaje a un piezoeléctrico que mueva suavemente el sustrato con respecto a una punta del cantilever. Un experimento típico tiene la punta al principio presionando contra la superficie. La medida de la tracción se inicia moviendo el sustrato de la punta al sacar contacto. Si una proteína entra en contacto con la punta al principio, se tiró y se medirá la huella de despliegue de la fuerza contra desplazamiento. El sustrato luego se trae en contacto con la punta y un rastro relajante se mide en plegamiento de la proteína puede ser determinado por el desplazamiento de la fuerza.

Protocolo

1. preparación de la proteína

1. Clonación de ADN.
   1. Sintetizar una secuencia de ADN de interés, por ejemplo, la secuencia de ADN de NI₁₀C¹⁰, o aislar mediante PCR del organismo anfitrión mediante técnicas de biología molecular estándar¹¹. Flanquean el gen de interés, con sitios de restricción durante la síntesis o mediante la colocación de sitios en el extremo 5' de los cebadores de la PCR para corresponder a un módulo en el plásmido pEMI91 (Addgene #74888)¹².
   2. Digerir por separado el plásmido pEMI91¹² y la secuencia de ADN de interés con un par de sitios de restricción para que la secuencia de interés se estará flanqueada por el tándem que i91 repite (ver figura 1). Seguir el protocolo estándar para los sitios de restricción.
   3. Purificar el producto digerido mediante electroforesis en gel y luego ligar los productos utilizando T4 ADN ligasa, siguiendo un protocolo estándar. Después de la ligadura, transformar el plásmido en las células de e. coli para la purificación del plásmido y purificar el plásmido usando protocolos estándar. Secuencia utilizando T7 cebadores o primers pEMI91 interna para verificar que la secuencia se transformó con éxito.
2. Transformación.
   1. Eliminar las células de expresión de proteína, como C41 (DE3) pLysS las células, un congelador de-80 ° C y descongelar totalmente en hielo.
   2. Añadir 1 μl de ADN plásmido a las células y remover brevemente; pipeteo arriba y abajo no es recomendable introducir burbujas de aire y calentar las células.
   3. Incubar el tubo de cultivo que contiene las células y el plásmido en el hielo durante 30 minutos.
   4. Choque de calor las células en un baño de agua a 42 ° C por 45 s.
   5. Devuelva el tubo en hielo durante 2 minutos.
   6. 950 μl de caldo LB en las células y agitar a 250 rpm durante 1 h a 37 ° C.
   7. Colocar 200 μL de la transformación sobre placas LB que contiene 100 μg/mL de ampicilina. Si utiliza un plásmido distinto pEMI91, utilice el antibiótico apropiado para ese plásmido. Coloque la placa durante la noche en una incubadora a 37 ° C. Al día siguiente, retire la placa de la incubadora, enrolle con parafilm y almacén refrigerado hasta 1 mes.
3. Expresión de la proteína.
   1. Sembrar 15 mL de medio de caldo LB con ampicilina 100 de μg/mL en un tubo de 50 mL a 37 ° C para el crecimiento durante la noche tocando la punta de una pipeta estéril a una sola Colonia de bacterias en la placa y pipeteo arriba y abajo en la LB.
   2. Transferencia de la cultura de 15 mL en 1 L de medio de caldo LB con ampicilina 100 de μg/mL y agitar durante 4-12 h a 37 ° C (hasta OD₆₀₀ > 0.8).
   3. Recoger 10 mL del cultivo para la preparación de plásmido.
   4. Añadir 0.2-1 mM Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y bajar la temperatura a la temperatura para la expresión durante la noche.
   5. Cosecha de células al día siguiente por dividir en cuatro tubos y centrifugar a 4.000 x g durante 40 minutos y luego congelar la pelotilla a-80 ° C durante varias horas.
   6. Enviar la plásmidos extraída de las células para la secuencia con los cebadores correspondientes al cassette insertado de la proteína¹² y verificar la fidelidad de la DNA insertada.
4. Purificación de proteínas.
   1. Descongelar un tubo de células congeladas durante 30 min a temperatura ambiente.
   2. Suspender las células descongeladas en tampón de lisis (38 mL de agua, 2 mL de glicerol, 50 mM de Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 10 μg/mL DNasa, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 lisozima μg/mL) y agitar con hielo durante 1 hora.
   3. Congelar las células sometidas a lisis a-80 ° C durante varias horas y luego volver a descongelar a temperatura ambiente.
   4. Girar el lisado abajo en 13.100 × g durante 30 min a 4 ° C.
   5. Ejecute el sobrenadante a través de una columna de flujo de gravedad para la etiqueta específica (por ejemplo, Strep-tag o su etiqueta).
   6. Realizar un intercambio de buffer utilizando un filtro centrífugo con el tampón adecuado para Strep-tag o su etiqueta y almacenar a 4 ° C antes de usar.

2. preparación para la preparación de la muestra de diapositivas

1. Preparación de portaobjetos con solución de piraña.
   1. Piezas de 10-30 lugar de redondo vidrio cubreobjetos (radio de 7,5 mm) en un vaso de vidrio de 40 mL.
      Nota: Realizar este paso y los siguientes pasos en una campana. Siga los procedimientos estándar para tratar con productos químicos peligrosos durante este paso.
   2. Añadir 30 mL de ácido sulfúrico de concentrado (18,4 M).
   3. Añadir 10 mL de peróxido de hidrógeno 30%.
   4. Calienta la mezcla durante 10-30 min a 95 ° C.
   5. Decantar con cuidado la solución piraña en un contenedor de residuos separado (para ser reutilizado o desechado).
   6. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada para eliminar la solución piraña.
   7. Suspender las diapositivas en 40 mL de acetona.
   8. Decantar la acetona en un recipiente y vuelva a suspender diapositivas en 40 mL de etanol.
   9. Use pinzas limpias y cuidadosamente extraer una diapositiva a la vez seco con argón o aire purificado.
   10. Coloque los portaobjetos limpios y secos bajo vacío hasta la evaporación oro o bajo argón para almacenamiento a largo plazo.
2. Preparar portaobjetos recubiertos oro (opcionales).
   Nota: Este paso requiere el uso de un evaporador de vacío (e-beam), que está disponible en muchas instalaciones de sala limpia en importantes universidades.
   1. Corte cinco portaobjetos (forma rectangular 25 x 75 mm) por la mitad utilizando a un glasscutter.
   2. Aplicar cinta adhesiva de doble cara en el centro de cada uno de los 10 portaobjetos medio.
   3. Corte el lado pegajoso de una nota adhesiva y se aplica a la cinta de doble cara para que el lado pegajoso de la nota es boca arriba. La nota pegajosa es generalmente menos adhesivo, pero firmemente se adhiere a diapositivas para prevenir fractura futura. Entonces los portaobjetos medio ahora pueden trabajar como titular de portaobjetos de vidrio.
   4. Presione cuidadosamente cuatro portaobjetos de vidrio limpio (de sección 2.1.10) a cada esquina del lado pegajoso del titular.
   5. Mover el portaobjetos a un evaporador e-beam. Seguir las especificaciones del evaporador para aplicar 70 nm de cromo y 300 nm de oro a la superficie.
   6. Almacenar los portaobjetos recubiertos con oro bajo argón.

3. preparación de la muestra

1. Preparar la diapositiva.
   1. Seleccione un disco de hierro limpio (15 mm de diámetro) y una pestaña adhesiva a éste.
   2. Desanexa la pieza de la cubierta de la lengüeta adhesiva.
   3. Seleccione un trozo de vidrio limpio (de sección 2.1.10) u oro (apartado 2.2.7) y colóquela firmemente en el lado pegajoso del disco de hierro, se trata de la diapositiva muestra.
2. Depósito de proteína en la diapositiva.
   1. Dializan la poliproteína en el búfer para el experimento (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 con 150 mM NaCl) usando una columna de intercambio de tampón como el filtro centrífugo de 0.5 mL. La proteína en la columna 10 min a 13.000 rpm de la vuelta atrás de la columna y eluir la proteína en un búfer de nuevo de gira a 1.000 rpm durante 2 min.
   2. Determinar la concentración de proteína aproximada midiendo la absorbancia a 280 nm, usando un espectrofotómetro.
   3. Diluir la proteína 10-100 μg/mL en un volumen final de 100 μl.
   4. Se aplican los 60 μL de solución de proteína en el centro de la diapositiva. Tenga cuidado en esta etapa para que no deje ningún líquido entrar debajo de la brecha entre el vidrio y la diapositiva de hierro, ya que esto puede causar hinchazón del adhesivo durante el experimento y movimientos incontrolados de la muestra.
      Nota: Oro son hidrofóbicas, y forma una gota esférica, mientras que diapositivas de vidrio son más hidrofílicos y la solución de proteína se puede extender.
   5. Deje la muestra a temperatura ambiente durante 10-60 minutos. Durante este tiempo, proceder al siguiente paso para empezar a configurar el microscopio de fuerza atómica.

4. instalación de fuerza atómica microscopio (AFM)

Nota: La siguiente es una descripción general para la creación de la AFM, y algunos detalles específicos pueden diferir dependiendo de la instrumentación específica utilizada. La instrumentación utilizada es parcialmente construido casa y descrito en detalle en Scholl¹³.

1. Monte el voladizo en una celda AFM.
   1. Elegir el voladizo con propiedades adecuadas para la aplicación. Uso voladizos con las constantes de resorte 4-10 pN/nm para las fuerzas de despliegue bajo (~ 10-50 pN), mientras que uso voladizos con las constantes de resorte 15-100 pN/nm para altas fuerzas de despliegue.
   2. Cuidadosamente levante el voladizo del extremo y colóquelo en la punta de prueba de celula.
   3. Asegúrese de que la celda sostiene firmemente el voladizo en su lugar antes de continuar.
   4. Coloque la celda en la cabeza del AFM para la alineación del laser.
2. Alinee el laser en la cabeza de la AFM.
   1. Coloque el cabezal sobre un microscopio invertido y conectar una batería a la cabeza AFM para accionar el láser en la cabeza.
   2. Conectar una cámara para el detector del microscopio para que la luz láser puede visualizarse en un televisor o monitor.
   3. Coloque el láser para que se encuentra en la punta del voladizo
3. Monte el cabezal con la muestra.
   1. Ras 10 μl de buffer en cada uno de los puertos de la sonda de celula.
   2. Tome la corredera de la muestra que ha sido incubando y decantar 40 μl del líquido de la solución incubada. Agregar 40 μl del buffer en la diapositiva. Colocar el portaobjetos de la muestra sobre el imán sobre el piezoeléctrico.
   3. Asegúrese de que la etapa AFM es en la posición elevada. Luego coloque el cabezal AFM en el escenario para que el voladizo AFM está por encima de la gota de muestra.
4. Centro del haz láser reflejada en el fotodiodo.
   1. Corte un pedazo pequeño de papel y delante del fotodiodo de la AFM.
   2. Vuelva a colocar el láser AFM utilizando los botones para que el punto láser en el papel se convierte en concentrado y brillante.
   3. Ajuste el espejo principal de AFM de modo que el láser golpea el fotodiodo para maximizar la señal total en todos los cuadrantes (A + B + C + D) y hace la señal de la diferencia entre dos superior e inferior dos cuadrantes para cero (A + B-C-D).

5. atómica fuerza calibración de microscopios

1. Medir el espectro de energía.
   1. En el filtro conectado a la AFM, gire el ajuste filtro de la señal principal de AFM a ancho de banda completo.
   2. En el AFM sí mismo, asegúrese de que el piezo es apagado como esto será añadir ruido a la señal.
   3. Utilice el software AFM del¹⁴ para medir el promedio de 512 cálculos del espectro de energía de 1.024 puntos por cálculo.
   4. Utilice el software AFM¹⁵ integrar la densidad espectral de energía en el primer pico, que se corresponde con el modo principal de vibración para el voladizo.
2. Calcular la sensibilidad del fotodiodo.
   1. En el AFM sí mismo, encender el regulador piezoeléctrico y cambiar la configuración de filtro a los 500 Hz (filtro de paso bajo).
   2. Monitorizar la señal de diferencia que debe fluctuar alrededor de cero en el software AFM. Rápidamente baje el cabezal AFM unos cien micrómetros utilizando micropositioners. Repetir moviendo la cabeza y monitorizar la señal de diferencia para los saltos constantes. La superficie es muy cerca cuando salta la señal de empezar a aumentar en altura.
   3. Tan pronto como la señal de deflexión satura al entrar en contacto con la superficie, mover ligeramente la cabeza lejos de la superficie.
   4. En el software AFM, utilice los controles de entrada para regular el voltaje piezoeléctrico para encontrar la superficie, moviendo hacia arriba o hacia abajo 100-5.000 nm. Si la superficie aún no está en alcance, continuar reducir la distancia entre la cabeza y la muestra manualmente.
   5. En el software AFM, realizar un experimento tirando con un tamaño de exploración de aproximadamente 500 nm para que la punta entra en contacto por alrededor de 100 nm de viaje piezo.
   6. Medir la pendiente de la región lineal de la fotodiodo señal versus piezo desplazamiento curva donde la punta AFM sigue en contacto con la superficie del sustrato.
   7. Calcular la constante elástica y la sensibilidad usando la pendiente y el espectro de energía integrado ().

6. adquisición de datos

1. Preparación.
   1. En los filtros conectados a la AFM, establezca el ajuste de filtro para que la frecuencia de muestreo es por lo menos dos veces el ancho de banda (criterio de Nyquist), que le dará un límite superior para el corte de paso bajo.
2. Mediciones.
   1. Establezca el tamaño de exploración en el tamaño teórico de la poliproteína de despliegue (número de aminoácidos x 0.365) más cerca del 40% para presionar contra el sustrato. Por ejemplo, tirar una construcción x I91 9 tendrá una longitud desplegada teórica de alrededor de 300 nm, por lo que el tamaño de exploración debe ser aproximadamente de 420 nm.
   2. En el software AFM, coloque el voladizo de manera que es 80% del tamaño del escaneo de la superficie (en este caso, sobre 340 nm de la superficie).
   3. En el software AFM, ajustar la velocidad de exploración a 300 nm/s inicialmente.
      Nota: Esta velocidad puede modificarse para ser más lento o más rápido, dependiendo de la aplicación.
   4. Realizar un experimento tirando y medir la posición resultante del piezo y la señal del fotodiodo. Utilice el software AFM para iniciar la exploración.
   5. En el software AFM, continuar realizar mediciones hasta que hay unos 10.000 grabaciones.
      Nota: Generalmente, la tasa de captación de una molécula de control positivo es alrededor de 0.5%¹⁶, así que 10.000 son necesarios para poder recopilar suficientes datos para analizar.

7. Análisis de datos

1. Normalizar los datos.
   1. Para cada grabación, computar la extensión usando extensión = desplazamiento - F/kc (kc es de 5.2.7).
   2. Determinar el nivel de fuerza inicial tomando el promedio del principio o de final de la traza de la fuerza de extensión, donde no hay picos de fuerza están presentes y donde el voladizo no está presionando contra la superficie. La curva toda fuerza-extensión puede entonces ser cambiado de puesto por este valor medio.
   3. Traducir los datos para que la extensión esté alineada a lo largo del eje cero. Esto es porque la molécula debe establecerse en cero extensión al principio de un rastro.
2. Identificación de la proteína de interés.
   1. Identificar grabaciones con al menos cuatro eventos I91 que proporcionan una huella dactilar de una sola molécula. Estas grabaciones capturan "medidas de una sola molécula" verdadero.
   2. Guardar eventos que se denominan eventos de una sola molécula para su posterior análisis.
3. Determinar el incremento de la longitud de contorno.
   1. Para cada grabación, ajustar un gusano-como cadena modelo evento despliegue, donde a temperatura ambiente, p es la longitud de persistencia (normalmente 0.4 a 1 nm), x es la extensión en nanómetros y L es la longitud del contorno en nanómetros.
      Nota: Forma de la cadena de gusanos es una solución interpolada a exactamente, se encuentra una solución numérica más exacta en Bouchiat et al. ¹⁷. modelos alternativos apropiados pueden encontrarse en Su et al. ¹⁸.
   2. Calcular la diferencia entre los valores de L determinado por dos acontecimientos consecutivos, y esta diferencia es acuñada el "incremento de la longitud de contorno".
4. Determinar fuerza de ruptura.
   1. Calcular la fuerza de ruptura para un evento de despliegue determinado tomando el punto más alto antes de la mayor caída en la curva de desarrollo.

Resultados

Resultados representativos de este protocolo se muestran en la figura 2. Ambos paneles muestran las curvas de fuerza representativa-extensión de proteínas. La parte superior muestra los resultados de una poliproteína I91, mientras que la parte inferior muestra la proteína I91 flanqueando un proteína de interés, la molécula de₁₀C de NI. Estas grabaciones muestran la fuerza característica de I91 (200 pN) y el incremento de la longitud del con...

Discusión

Un paso crítico en el protocolo es el uso de una poliproteína, descrito en el paso 1.1.2, que sirve como un control positivo a la "huella digital" eventos de una sola molécula. Generalmente, allí debe ser desplegar eventos de las proteínas de la poliproteína (I91, esto significa una fuerza de despliegue de unos 200 pN y contorno incremento de longitud de aproximadamente 28 nm) a concluir inequívocamente que la proteína de interés se ha revelado. Por ejemplo, cuando la proteína del interés está flanqueada por ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface