Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9

Riepilogo

Pronuclei iniezione (PN) del cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) e sistema di CRISPR-collegato della proteina-9 nucleasi (CRISPR/Cas9) è un metodo altamente efficiente per produrre geneticamente criceti dorati siriani. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato di PN iniezione per la produzione di gene knockout criceti con il sistema CRISPR/Cas9.

Abstract

La tecnica di iniezione pronuclei (PN) è stata fondata in topi per introdurre materiale genetici estraneo in pronuclei di embrioni in fase uno-cella. Materiale genetico introdotto può integrarsi nel genoma embrionale e generare animali transgenici con stranieri informazioni genetiche dopo il trasferimento degli embrioni iniettati per favorire le madri. Dopo il successo nei topi, iniezione di PN è stato applicato con successo in molte altre specie animali. Recentemente, iniezione PN è stato impiegato con successo per introdurre i reagenti con gene-modifica attività, quali il sistema CRISPR/Cas9, per ottenere le modifiche genetiche site-specifiche in laboratorio diversi e specie animali da fattoria. Oltre alla padronanza il set speciale di microiniezione competenze per la produzione di animali geneticamente modificati mediante iniezione di PN, i ricercatori devono capire la fisiologia della riproduzione e il comportamento delle specie bersaglio, perché ogni specie presenta unico sfide. Ad esempio, criceto siriano embrioni hanno unica gestione requisiti in vitro tale che tecniche di iniezione di PN non erano possibili in questa specie fino alle recenti scoperte dal nostro gruppo. Con il nostro protocollo per volta specie iniezione PN, siamo riusciti a produrre diversi knockout del gene (KO) e knockin criceti (KI), che sono stati utilizzati con successo per malattie umane modello. Qui descriviamo la procedura di iniezione di PN per la consegna del complesso CRISPR/Cas9 per gli zigoti del criceto, le condizioni di manipolazione dell'embrione, le procedure di trasferimento dell'embrione, e allevamento necessaria per produrre geneticamente modificati criceti.

Introduzione

Criceto siriano dorato (Mesocricetus auratus) è uno dei roditori più ampiamente usati per la ricerca biomedica. Secondo l'US Department of Agriculture, circa 100.000 criceti sono stati usati negli Stati Uniti nel 2015, che rappresentano il 13% di utilizzo degli animali di laboratorio totale tra specie contemplate dall'Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; letta 10 marzo 2017).

Il criceto offre parecchi vantaggi sopra altri roditori nello studio di un certo numero di malattie umane. Ad esempio, l'istopatologia dell'ammina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) indotto da adenocarcinomi duttali in criceto è simile a tumori pancreatici umani, mentre BOP trattamento induce principalmente tumori della tiroide nei ratti e del polmone e tumori del fegato in topi¹. Perché i criceti sono il solo piccolo roditore trovato per supportare la replica di adenovirus, sono anche il modello di scelta per i test basati su adenovirus oncolitici vettori e farmaci anti-adenovirus^2,3,4. Un altro esempio in cui il modello di criceto offre un vantaggio su topi e ratti è nello studio di iperlipidemia. Gli esseri umani e criceti esibiscono molte somiglianze nelle vie metaboliche del lipido ed entrambe le specie portano il gene che codifica la proteina di trasferimento dell'estere del colesterile (CETP), che svolge un ruolo centrale nel lipido metabolismi, mentre CETP è assente in topi e ratti⁵. Inoltre, criceti sviluppano malattia emorragica più rappresentativa della manifestazione umana dopo esposizione a Ebola virus⁶. I criceti sono anche i modelli di scelta per lo studio di aterosclerosi⁷, carcinoma orale⁸e myopathies infiammatori⁹. Recentemente, è stato dimostrato anche che i criceti sono altamente suscettibili all'infezione del virus di Ande e sviluppano hantavirus polmonare sindrome-come la malattia, fornendo il modello solo roditore di Andes virus infezione¹⁰.

Per affrontare il bisogno insoddisfatto per romanzo genetiche modelli animali studiare le malattie umane, dove nessun modello di roditore piccolo affidabile è disponibile, siamo recentemente riusciti nell'applicare il sistema CRISPR/Cas9 per il criceto e hanno prodotto geneticamente diverse linee di criceti derivati dal¹¹. Zigoti criceto sono altamente sensibili ad ambienti ambientali tali che i protocolli di iniezione PN sviluppati in altre specie non sono adatti. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un protocollo di iniezione PN per il criceto che soddisfa i requisiti speciali per la movimentazione di criceto embrioni in vitro. Qui, descriviamo la procedura dettagliata di iniezione PN utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e accompagnamento di Spagna, dalla preparazione della singola guida di RNA (sgRNA) per il trasferimento di embrioni iniettati nelle femmine destinatario.

Protocollo

Le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Utah State University (protocollo IACUC: 2484). Criceti utilizzate nel presente protocollo sono adulti (6-10 settimane di età) LVG ceppo criceti dorati siriani. Tutti i criceti sono alloggiati in Vivario presso il centro Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente è impostato a 23 ° C, umidità è fissato al 40-50% e ciclo di luce è impostato 14:00 (luce: scuro). Quando possibile, le procedure di manipolazione e surugical di embrione devono essere eseguite con tecniche sterili.

1. sgRNA e Cas9/sgRNA ribonucleoproteine (RNP) preparazione

1. Sintetizzare sgRNAs in vitro trascrizione procedure descritte nel manuale del kit di sintesi (tabella materiali, Supplement 1).
2. Per assemblare ribonucleoproteine, mescolare 2 µ g di Cas9 con 1 µ g di sgRNA e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10-15 min. Iniettabile di PN, fare una soluzione di lavoro alla concentrazione di 100 ng / µ l Cas9 e sgRNA di 50 ng / µ l con 10 mM di tampone TE (RNAsi libera, Materiali tavolo).

2. vasectomia preparazione

Nota: Vasectomia viene eseguita su criceti maschi a 6-8 settimane di età. La chirurgia dovrebbe essere eseguita 10-14 giorni prima del primo accoppiamento. Sterilità è confermata da gravidanze non riuscite da accoppiarsi con femmine fertili. Vasectomia maschi possono essere usati normalmente per un anno prima che diventino meno sessualmente attivi.

1. Anestetizzare i maschi per iniezione intraperitoneale (i.p.) di chetamina/xilazina con una dose di 40 mg/kg (ketamina) e 10 mg/kg (xilazina). Confermare l'anestesia dalla mancanza di una reflex pedale (pizzico di punta).
2. Posare il criceto sedato in decubito dorsale su un foglio di tessuto asciutto. Sciacquare l'addome con tre turni di antisettici trattamenti alternando chirurgico macchia soluzioni tra il 70% di alcool e povidone-iodio.
3. Praticare un'incisione verticale con forbici chirurgiche a partire da 1,5 cm cranialmente il prepuzio che si estende 1 cm per ogni lato da metà di linea (Figura 1a). Incidere la pelle, il tessuto sottocutaneo e la linea alba per accedere allo spazio peritoneale (Figura 1b).
4. Applicare una leggera pressione alla parte caudale dello scroto per forzare i testicoli e il tessuto grasso fuori. Afferrare i deferens delicatamente con la pinzetta e separare con cura il vaso sanguigno da vas con un secondo set di pinze (Figura 1C).
5. Tenere il dotto deferente con pinze per formare un anello. Riscaldare la punta di un altro forcipe in fiamma fino a quando è rosso e quindi utilizzarlo per rimuovere il ciclo dei vasi deferenti. Inserire il tessuto grasso e testicoli torna all'addome. Rimuovere il dotto deferente dal lato avversario con le stesse procedure.
6. Sutura della muscolatura prima seguita da sutura della pelle. Metti l'animale su un pad caldo in una gabbia per 30 min fino a quando l'animale recupera. Osservare l'animale fino a quando non riprende la normale attività.

3. donatore/ricevente criceto preparazione programma

1. Monitorare e registrare cicli estrali.
   Nota: Criceti femminili hanno un ciclo estrale stabile 4-giorni sia salvaguardata immediatamente dopo il parto. Le femmine il primo giorno di estro possono essere identificate dallo scarico vaginale opaco, giallastro e appiccicoso (Figura 2a). Femmine il giorno 4 di estro possono essere identificate dal muco trasparente, appiccicoso (Figura 2b).
2. Per superovulazione del criceto di donatore, superovulate le femmine sessualmente mature (> 6 settimane) il primo giorno del ciclo estrale mediante iniezione di IP della gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG; disciolto in PBS come 50 UI/mL) (tabella 1) tra 9-12 AM.
   Nota: PMSG è per l'induzione della superovulazione, ma non per la sincronizzazione del ciclo estrale.
3. 80 - 84 h dopo l'iniezione di PMSG (giorno 4, 6-8 PM), posizionare le femmine in gabbia con i maschi per l'accoppiamento. I criceto accoppiamenti non provocano copulazione spine, garantire accoppiamenti successo guardando gli accoppiamenti.
4. Preparare le femmine pseudopregnant con l'accoppiamento le femmine sessualmente mature il giorno 4 di estro con maschi vasectomia. Il calendario per la preparazione di femmine donatore e ricevente sono riportati nella tabella 2.
   Nota: Le femmine gravide vere utilizzabile anche come destinatari, cioè, le femmine con un cappotto colore distinguibile dal colore dorato arruffato con i maschi fertili di colore stesso. Cuccioli derivati dal trasferimento dell'embrione possono essere identificati basato su colori del cappotto. Un potenziale vantaggio nell'utilizzo di femmine gravide vere è che gli embrioni in modo endogeno prodotti sarebbero garantire riuscite gravidanze e aiutare embrioni PN iniettato per l'impianto; un potenziale svantaggio nell'utilizzo di femmine gravide vere come destinatari è che PN iniettato embrioni necessità di competere con in modo endogeno prodotto embrioni per l'impianto.

4. zigote isolamento

1. Preparare il terreno di coltura (HECM-9; ricetta viene descritta nel supplemento 2), come descritto in precedenza in McKiernan e Bavister¹².
2. Un giorno prima dell'iniezione di PN, preparare zigote manipolazione piatti (25 µ l/goccia) e una goccia di iniezione di PN (100 µ l) nel coperchio di un piatto di 35 mm con HECM-9. Poi coprire le gocce medie con olio minerale. Medio di equilibrio in un incubatore durante la notte le seguenti condizioni: 37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ e 100% di umidità.
3. Il giorno previsto per l'iniezione di PN, preparare piatti consuntivazione dell'embrione (1 criceto piatto/donatore) con HECM-9 e memorizzare tutti i piatti nell'incubatrice fino all'utilizzo.
4. Eutanasia superovulated criceti con CO₂.
5. Ovidotto isolamento
   1. Posizionare un criceto femmina eutanasizzato in decubito dorsale su un telo chirurgico o carta velina e preparare l'addome con uno spray di etanolo 70%.
   2. Tenere la pelle e strato del muscolo addominale al midline saldamente e fare un'incisione. Incise il peritoneo per esporre gli organi addominali.
   3. Afferrare uno dei corni uterini con un forcipe fine e ritrarre il tessuto dall'addome. Separare l'utero dal tessuto Mesometrio e grasso. Fare un taglio tra l'ovidotto e dell'ovaia e un secondo taglio adiacente alla giunzione del ovidotto e dell'utero (includono una piccola parte dell'utero). Posizionare le due ovidotti nello stesso filo piatto.
6. Lavare e raccogliere zigoti
   1. Sotto il microscopio di dissezione, afferrare il lato del corno uterino con un forcipe di Dumont #5 e inserire un ago fatti in casa (Figura 3) il lume dell'ovidotto dalla fine infundibular e sciacquare l'ovidotto con 300-400 µ l di terreno di HECM-9.
   2. Raccogliere gli zigoti immediatamente e lavare due volte con il piatto di movimentazione di medie HECM-9. In questa fase di sviluppo, tutti gli zigoti dovrebbe essere denudati da cellule del cumulo.
   3. Posizionare gli zigoti in un'incubatrice (37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ e 100% umidità) immediatamente dopo la raccolta per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

5. PN iniezione

1. Scongelare il RNP Cas9/sgRNA sul ghiaccio e mantenere il complesso sul ghiaccio durante l'intero processo di iniezione di PN.
2. Caricare gli aghi per iniezione con soluzione Cas9/sgRNA RNP immediatamente prima degli esperimenti di iniezione. Posizionare l'estremità posteriore di aghi iniettori nella provetta contenente la soluzione di Cas9/sgRNA RNP e consentire la soluzione di Cas9/sgRNA RNP riempire l'ago per azione capillare.
3. Preparare il piatto di iniezione e gli aghi. Riempire la pipetta titolare con olio minerale all'interno di ~ 3 mm della curva dell'ago titolare. Collocare il supporto in microinjector con la punta dell'ago orizzontale sul fondo del piatto e riempire la punta dell'ago con il mezzo di aspirazione. Impostare l'ago per iniezione ad un angolo di 10-15° opposto titolare.
4. Iniezione di PN
   1. Identificare uno zigote ed aspirare un bene con l'ago del titolare. Idealmente, i pronuclei maschili e femminili sono all'interno della stessa gamma focale e parallelo stato allineato al titolare.
   2. Penetrare la zona e i pronuclei maschile (posizione 3) con l'ago per iniezione.
   3. Ritirare l'ago per iniezione rapidamente una volta che il pronucleo si gonfia per impedire che il nucleo aderendo all'ago e per evitare di danneggiare il pronucleo.

6. zigoti trasferimento ai criceti Pseudopregnant

1. Anestetizzare un criceto pseudopregnant (lo stesso modo come descritto nella precedente sezione vasectomia) e adagiarlo su un telo chirurgico o asciutto carta velina in decubito ventrale.
2. Applicare lubrificanti occhio agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza degli occhi e coprire la testa con un panno o carta per proteggere gli occhi dalla luce. Preparare la funzione laterale del corpo attraverso la rasatura una zona della pelle di circa 4 x 4 cm su ogni lato del corpo seguito da applicare 3 volte di povidone-iodio scrub e gommage di etanolo 70% 3 volte. Fare un'incisione verticale di 2 cm 2 cm caudale all'ultima costola (come mostrato nelle figure 4a, 4b) su ciascun lato della parte posteriore dell'animale.
3. Afferrare il cuscinetto di grasso con la pinzetta e tirare delicatamente finché l'ovidotto e utero sono visibili. Fissare il cuscinetto di grasso con un emostatiche e riflettono il rilievo grasso dorsale sopra la spina dorsale (Figura 4c). Posizionare il tratto riproduttivo in modo tale che la tuba uterina può essere penetrata con un ago da 30 gauge per trasferimento dell'embrione (Figura 4D).
4. Lavare gli zigoti iniettati con HECM-9 in un nuovo piatto. Utilizzare una nuova pipetta di vetro (diametro: ~ 150-200 µm) per caricare 10-15 zigoti. Organizzare gli zigoti come una catena di perle seguita da diverse bolle d'aria. Inserire la pipetta nella provetta aperta penetrato dal punto 6.3 e soffiare dolcemente nella pipetta per trasferire gli zigoti ovidotto. Continuare a soffiare fino a quando non viene rilasciata la prima bolla di aria nel tratto ovidotto (Figura 4e).
5. Rilasciare il cuscinetto di grasso e restituire il tessuto all'addome. Trasferimento circa lo stesso numero (10-15) di embrioni iniettati a un altro tratto di ovidotto negli stessi processi.
6. Suturare la muscolatura e la pelle in 2 strati. Somministrare per via sottocutanea buprenorfina-HCL (0,5 mg/kg) come analgesia post operatoria. Tornare il criceto in una gabbia e posizionare la gabbia su un pad caldo per il recupero. Tornare la gabbia alla stanza animale quando l'animale è completamente recuperato dall'anestesia. Post-op analgesici sono dati ancora sei ore più tardi.

Risultati

L'efficienza del protocollo descritto nella produzione di criceti geneticamente dipende dai risultati delle seguenti due fasi critiche: il tasso di nati vivi di femmine destinatario e il numero di cuccioli dal vivo con delle modificazioni genetiche previste. Il tasso di natalità è un risultato diretto della qualità degli embrioni e l'abilità dell'individuo di eseguire l'iniezione di PN e procedure di trasferimento dell'embrione. Per garantire che il potenziale inerente allo sviluppo d...

Discussione

Per sfruttare meglio il potenziale di criceti dorati siriani come modelli della malattia umana, abbiamo sviluppato un protocollo di iniezione PN per la consegna di un CRISPR/Cas9 complesso per impostare come destinazione il genoma di criceto. Il protocollo di iniezione PN ottimizza diverse variabili chiave, tra cui il terreno di coltura dell'embrione, la temperatura e lunghezze d'onda della luce¹³. Ci sono anche parecchie procedure di gestione animale criceto-specifica che è necessario seguire pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation