트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

요약

Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

초록

노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 > 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.

서문

정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands¹간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화². 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지³. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치⁴신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]⁵. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명^{1,6 셀 관련} . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.

우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발⁷을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형⁷리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands⁸에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문^1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.

¹⁰ 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구^11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드¹¹ 을 표현 하 고 표현 Serrate¹³, 노치 ligand 집계 실험⁸에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩^11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands¹⁵ (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성^8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.

여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타⁸. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.

프로토콜

1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비

1. 제품의 PCR 증폭
   1. 야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분).
      녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')-
      앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')-
      앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
2. 젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.
3. 전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.
4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장
5. 다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
   1. 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 10⁵ s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.
   2. 각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
   3. 수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.
   4. 분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분).
      참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   5. 2^-ΔΔCT 방법¹⁶를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.

2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands

1. 신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
   1. hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 10⁵ S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
      참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어.
   2. 각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
   3. 0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO₄ 를 추가 합니다.
      참고: CuSO₄ metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.
2. 신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
   1. 사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 10⁶ 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate^톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
      참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate^톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate^톰의 표정-Serrate¹²의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다.
   2. 0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO₄ 를 추가 합니다.
3. 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
   1. DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 10⁵ 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.
   2. 5 x 10⁵ 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate^톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스).
      참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다.
   3. 150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.
   4. 1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.
      1. 10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.
      2. 수동으로 집계를 계산 (> 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.
   5. 통에 접시를 놓습니다.
   6. 이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.
4. 트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
   1. 배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate^톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.
   2. S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate^톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).

3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands

1. 신호 수신 셀을 준비 합니다.
   1. 플레이트 5 x 10⁵ s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.
   2. 각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.
   3. 공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치¹¹ (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타¹¹ (DGRC) 또는 pMT Serrate총¹⁷ DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도.
      참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 & 델타^과도 또는 S2-노치 & Serrate^과도 셀이.
   4. 뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.
   5. 0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO₄ 를 추가 합니다.
2. 2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.
3. 2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
4. 트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
   1. 배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.
   2. Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.
      1. S2-노치^과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.
      2. S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 & 델타^과도)와 S2-델타 세포.
      3. 상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A
      4. Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C.
         참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.

결과

우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands⁸. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 ?...

토론

정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands⁵간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호^3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module