Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Abstract

Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all'interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività dell'enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all'interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell'aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all'aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l'attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.

Introduzione

Capire le posizioni all'interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l'attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l'attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell'enzima. Quando l'attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle all'interno della miscela o la distribuzione spaziale delle cellule con alta o bassa attività all'interno di un tessuto.

Forniamo qui un protocollo dettagliato per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica all'interno di un campione di tessuto. La metodologia si basa su precedenti studi che dimostrano che sali di tetrazolio possono essere utilizzati per localizzare l'attività della deidrogenasi, riduttasi e ossidasi in tessuto congelato¹. Con questi metodi, un formazan insolubili in acqua si forma quando protoni vengono trasferiti a un tetrazolium sale^2,3. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi genera NADPH e un protone ed è stata rilevata con attività di tetrazolium. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi è stata monitorata epatociti Platichthys flesus⁴, nelle cellule alveolari di tipo 2 del polmoni⁵ e nefroni del rene⁵. Sali di tetrazolio sono stati utilizzati anche per monitorare l'attività di transketolase in tessuto congelato⁶. Un approccio simile è stato recentemente utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi multiple nel tessuto stesso su diapositive adiacenti⁷.

Descriviamo qui un metodo per utilizzare sali di tetrazolio per monitorare la distribuzione spaziale delle attività della deidrogenasi del lattato (Figura 1). Lattato deidrogenasi può convertire piruvato generato da glicolisi di lattato e la reazione inversa. L'attività della deidrogenasi del lattato è di conseguenza un determinante importante dell'entrata di piruvato nel ciclo dell'acido tricarbossilico contro sua secrezione come lattato. Livelli di lattato nel sangue sono spesso utilizzati per diagnosticare una gamma di malattie, compreso cancro^8,9,10, perché può segnalare che la malattia o infortunio ha danneggiato le cellule e l'enzima è stato rilasciato.

Ci sono quattro geni di lattato deidrogenasi: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD¹¹. LDHA e LDHB sono pensati per risultare dalla duplicazione di un gene di iniziali LDHA¹². LDH è attivo come un tetramero e LDHA e LDHB possono formare homotetramers ed eterotetrameri con a vicenda. LDHA è segnalato per avere maggiore affinità per piruvato, mentre LDHB è segnalato per avere maggiore affinità per lattato e preferenzialmente convertire lattato in piruvato¹³. Il promotore LDHA contiene siti di legame per fattori di trascrizione HIF1α, cMYC e FOXM1¹¹. Inoltre, come molti altri enzimi glicolitici^14,15, LDH può essere modificato da modificazioni post-traduzionali. Ricevitore di fattore di crescita del fibroblasto 1 può fosforilare LDHA Y10, che promuove la formazione di tetramero, o Y83, che promuove il NADH substrato associazione¹⁶. LDHA può anche essere acetilata¹⁷. Per questi motivi, una comprensione completa delle attività LDH richiede un monitoraggio non solo i livelli di proteina LDH, ma l'attività dell'enzima pure.

Oltre al metodo che presentiamo qui, altri approcci sono stati utilizzati per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato può essere monitorata spettrofotometricamente a lisato proteico omogeneizzato. La generazione del NADH come lattato viene convertito in piruvato può essere misurata basata su assorbanza a 340 nm, mentre la scomparsa del NADH può essere monitorata come piruvato viene convertito in lattato¹⁸. L'attività della deidrogenasi del lattato è stata monitorata anche con risonanza magnetica (MRI). ¹³ C-piruvato può essere somministrato e la conversione di piruvato a lattato possa essere monitorata come il rapporto di [1 -¹³C] lattato / [1 -¹³C] piruvato. Elevati coefficienti di [1 -¹³C] lattato / [1 -¹³C] piruvato sono stati osservati in cancro del tessuto¹⁹. Mentre gli approcci basati su MRI possono fornire informazioni sulle attività della deidrogenasi del lattato nel normale e tessuti malattia, le metodologie non hanno la risoluzione necessaria per determinare il livello di attività in celle specifiche. La metodologia fornita qui può fornire informazioni sull'attività della deidrogenasi del lattato in aree di tessuto e anche in singole cellule.

Usando in situ analisi di attività, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è ricco di cellule staminali del follicolo pilifero di mouse pelle²⁰. Abbiamo anche usato il metodo per monitorare l'attività del lattato deidrogenasi in cellule staminali embrionali coltivate e l'attività è più alto nelle cellule staminali dello strato dell'alimentatore. Infine, abbiamo monitorato l'attività del lattato deidrogenasi nell'aorta del mouse fresco e osservato la macchiatura in cellule di muscolo liscio. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo congelati.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal comitato di cura animale presso l'Università di California, Los Angeles.

1. generare diapositive della pelle del topo congelati

1. Eutanasia topi in conformità alla politica di istituzione.
   Nota: Seguire la politica istituzionale per indumenti di protezione. Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali devono essere approvati dal Comitato cura animale istituzionale.
2. Rimuovere i capelli del mouse con un trimmer peli di animali.
3. Fare delle incisioni nella pelle usando le forbici. Usando il forcipe, sollevare la pelle dal mouse. Utilizzando le forbici, tagliare la sezione di pelle.
4. Riempire il cryomold con congelamento reagente composto (Vedi Tabella materiali).
5. Sezioni di pelle posto in cryomolds riempito usando il forcipe dal naso dell'ago. Orientare la pelle affinché fettine di tessuto genererà una sezione trasversale della pelle dall'epidermide al derma, ipoderma e muscolo (Figura 2).
   Nota: se possibile, montare sperimentale e topi di controllo insieme alla cryomold stesso modo possono essere sezionati sulla diapositiva stessa ed elaborate insieme. Fare attenzione a non per creare bolle.
6. Posto cryomold sulla superficie piana di un blocco di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio e far congelare. Continuare ad osservare l'orientamento della pelle. Regolare se necessario.
   Nota: Indossare guanti criogenici maneggiare ghiaccio secco.
7. Trasferimento cryomolds in un congelatore-80 ° C per la conservazione. I campioni possono essere mantenuti in freezer per circa 3 mesi senza una significativa perdita di attività enzimatica. Sezioni congelate non lasciare asciugare.
8. Utilizzando un criostato a-20 ° C, fetta del tessuto per creare sezioni 7-10 µm di spessore per la miglior pelle morfologia²¹.

2. preparazione diapositive per la colorazione

1. Stabilire il set di diapositive da testare. Includono un vetrino di controllo su cui sarà trattenuto il NAD e far scorrere un altro controllo in cui il substrato, lattato, verrà trattenuto. Includere un vetrino di controllo positivo da un blocco di tessuto congelato precedentemente studiato.
2. Brevemente Difficoltà diapositive contenente sezioni di pelle con formalina 4% per 5 min da pipettaggio 1 mL di formalina 4% sulla diapositiva, o durante l'elaborazione di più diapositive, immergendo i vetrini in un recipiente contenente formalina 4%.
   Nota: La fissazione garantirà che la pelle non staccare dalle diapositive durante le seguenti procedure e preservare la morfologia della pelle.
   Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno e pericolose; indossare guanti, non lasciare che toccare la tua pelle ed eseguire questo passaggio in una cappa chimica.
3. Lavare i vetrini con il fosfato di almeno 1 mL tampone, pH 7.4, per ogni diapositiva o pipettando o immersione.

3. preparare la soluzione di colorazione

1. I reagenti insieme vortice per la colorazione di attività della deidrogenasi del lattato (Tris 50 mM a pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazina methosulfate (PMS), cloruro di nitrotetrazolium blu 600 µM e lattato di 30 mM) in un tubo di dimensione appropriate a seconda della quantità di macchiatura soluzione necessaria.
   Nota: 1 mL è sufficiente per coprire completamente una diapositiva.
2. Preparare una seconda soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti tranne NAD. Preparare una terza soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti ad eccezione del lattato.

4. Incubare i vetrini nella soluzione di colorazione

1. Delicatamente dispensare la soluzione colorante o soluzioni per il controllo sui vetrini preparati che coprono la sezione nella sua interezza (1 mL è sufficiente per una diapositiva). Se più diapositive vengono elaborati insieme, immergere tutti i vetrini nella soluzione colorante allo stesso tempo (assicurarsi che il contenitore è una soluzione abbastanza per coprire completamente la sezione di tessuto).
2. Incubare i vetrini in un ambiente umidificato a 37 ° C al buio. Se la soluzione di colorazione è in cima alla diapositiva, è possibile collocare il vetrino in un ambiente umidificato per evitare l'evaporazione.

5. monitorare le diapositive

1. Monitorare la conversione della soluzione colorante da chiaro a blu mediante ispezione visiva. Quando i campioni hanno raggiunto il livello desiderato di azzurro, arrestare la reazione rimuovendo la soluzione colorante.
   Nota: Per la pelle, 10 min è sufficiente. Il tempo dipenderà l'organo e l'attività enzimatica.
2. Sciacquare i vetrini con tamponato fosfato salino pipettando (1 mL è sufficiente per ogni diapositiva) o immersione.
   Nota: Eventuali campioni che saranno confrontati a vicenda devono essere mantenuti nella soluzione colorante per la stessa quantità di tempo.

6. colorante di contrasto e montare

1. Dispensare una colorazione sui vetrini quando le diapositive hanno raggiunto un livello adeguato di azzurro.
   Nota: Coloranti che trasformano i nuclei rossi o verdi fornirà buon contrasto con il blu creato dal formazano precipitante.
2. Montare con acquoso o non acquoso montaggio medio²². Una-tre gocce (40-50 µ l) di mezzo di montaggio è sufficiente a seconda delle dimensioni del vetrino coprioggetti.

7. immagini diapositive e quantificare

1. Diapositive di immagini al microscopio ottico. Prendere fotografie di sperimentale e campioni di controllo e tutti i controlli negativi a 10x, 20x e 40x.
2. Determinare l'intensità della macchia blu in diverse regioni con software di analisi di immagine.

Risultati

Precedentemente abbiamo segnalato risultati per analisi di attività in situ in mouse pelle²⁰. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che alti livelli di attività della deidrogenasi del lattato in cellule staminali del follicolo pilifero, alla base del follicolo di capelli quando le procedure descritte sopra sono stati seguiti. Questi risultati sono stati confermati da celle attivate la fluorescenza ordinamento della...

Discussione

Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all'interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope