筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

要約

骨格筋は、特に核の配置に依存する非常にダイナミックなプロセスです。ここでは、我々 は筋芽細胞の分化と筋層の間の生きているセルイメージ投射によって核の動きを追跡する自動追跡から情報を抽出することにより核動態の定量的な解析を実行する方法をについて説明します。

要約

細胞内の核の配置、開発および再生の複数の細胞プロセスが重要です。核の配置の最も興味深い例は骨格筋の中に発生します。筋繊維 (筋線維) が筋前駆細胞 (筋芽細胞) 由来の筋幹細胞 (サテライト細胞) の増殖と分化を融合して多核巨細胞の細胞です。筋線維内の正しい核配置は、適切な筋肉の再生と機能に必要です。筋芽細胞の分化と筋線維の形成を評価する共通のプロシージャは、蛍光抗体法により、時間の経過とともに核の運動と細胞挙動の研究を妨げる用いて固定セルに依存します。ここでは、生細胞イメージングによる筋芽細胞の分化と筋線維の形成の解析手法について述べる.分化と融合の中に細胞核ダイナミクスと筋芽細胞挙動 (すなわち、軌道) の高スループットの定量的な特徴づけを取得する自動核追跡のためのソフトウェアを提供します。

概要

骨格筋は、本体質量¹の 35-40% を合計、人間の体内で最大の組織です。衛星細胞は筋肉細胞、増殖筋芽細胞 (筋前駆細胞) を生じさせる、(細胞膜、筋線維の基底膜下に並べ)、彼らの位置によって特徴付けられる解剖学的結果となった区別するため、既存の筋線維に統合および/またはフォーム新しい筋線維^2,3,4ヒューズします。彼らの発見と生物学の研究の進展は、筋肉の発達と再生に重要な洞察力につながっています。

分離し、単に筋芽細胞を分化するプロトコルは何年も前に開発されているおよびまだ広く骨格筋分化^5,6,7を調べるために用い。ただし、これらのメソッドのほとんどは、固定細胞の解析に依存し、その結果、筋芽細胞の融合や筋線維の成熟などの非常に動的なプロセスを完全に探検する科学者を許可しない静的なプロシージャを表します。最も顕著な例は、しっかりと規制されており、初期状態で筋線維の中心核と、筋線維の成熟^8,9後周辺に位置しを核配置です。ライブ イメージングは、さらに特有の現象についての洞察を取得する最も適切な手法です。

ここでは、科学者タイムラプス顕微鏡による筋芽細胞の分化と筋の形成を記録し、筋芽細胞核の自動追跡から定量的な解析を実行することができる手法について述べる。このメソッドは、分化と融合の中に核ダイナミクスと筋芽細胞挙動の高スループットの定量的な解析を提供します。プロトコルは分かれて 4 つさまざまな部分、すなわち (1) コレクション (2) マウスの後肢筋の機械的および酵素の消化力、(3) 筋芽細胞増殖、分化および (4) は、プライマリの筋芽細胞の分離ライブ イメージング筋芽細胞分化の最初 16 h 内の核を追跡します。

次の手順で筋芽細胞は H2B GFP マウスから隔離され、前述¹⁰として、H2B GFP 発現のためのドキシサイクリン 1 μ g/mL で処理しました。また、核の蛍光蛋白質の表現他のトランスジェニック マウスから筋芽細胞を分離する、または前述のピメンテルらによる核の蛍光蛋白質を表現する野生型マウスから分離した細胞を使って可能です。⁹。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、サン ラッファエッレ機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. マウスの後肢筋の解剖

1. ピンセットとはさみ (直線と曲線) をオートクレーブで滅菌します。
2. 準備し、実験を開始する前にすべてのメディア (ブロック中、消化中、媒体、媒体を区別する) (0.22 μ m) にフィルターを適用 (材料の表を参照してください)。
3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL を 35 mm 筋コレクション用シャーレに入れてください。
4. 頚部転位か CO₂を使用して、マウスを犠牲にしエタノールで皮膚を消毒します。後肢と上肢から皮膚を削除するには、筋肉の分離を容易にするはさみとピンセットを使用します。
   注: 筋肉は新生児または大人のマウスから分離することができます。新生児マウス成体マウスに比べて衛星細胞数の増加があります。ただし、単一の大人マウスから分離でき、衛星細胞の総数は下記実験を実行するための十分です。
5. 前脛骨筋、ヒラメ筋、長趾伸筋 (EDL)、腓腹筋、大腿四頭筋、上腕三頭筋を隔離し、PBS を含むシャーレに入れてください。氷の上の皿を残します。腱と滅菌ハサミとピンセットで脂肪を慎重に取り外します。

2. 主な筋芽細胞の単離

注: 細胞培養のためのすべての手順は、無菌状態で行われます。

1. PBS から筋肉を削除します。カットし、均一な塊が得られるまで滅菌曲線はさみを使用して筋肉をミンチします。筋肉部分を 50 mL チューブに入れます。
2. 筋肉部分に消化中の 10 mL を追加し、37 ° c 水お風呂、酵素によって筋肉を消化するための強い撹拌 (250 min^-1) の下で 30 分間インキュベートします。
3. ダルベッコの 10 mL 変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、グルタミン 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、消化を停止する 1% ゲンタマイシン (ブロック中) を含むを追加します。
4. 5 分 40 × gで遠心分離し、50 mL のチューブに上清を収集します。氷の上には、ペレットを保存します。
   注: 遠心分離後上澄みが含まれますいくつかの衛星細胞、血液細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、ペレットには未消化の筋肉や結合組織の部分が含まれています。隔離されたセルの数を増やす、消化下記のとおりの追加手順にペレットを受ける必要があります。
5. 650 x gで 5 分間破棄で上澄みの上澄みを遠心し、10% を含む DMEM の 1 mL にペレットを再懸濁します FBS。氷の上の再懸濁のペレットを維持します。
6. 手順 2.2 〜 2.5 2.4 の段階で得られたペレットの残りの部分の 2 倍、氷の上保存されている最初の再懸濁のペレットを再懸濁後のペレットを追加します。
7. 70 μ m のフィルターを通過し、40 μ m のフィルターを通して再懸濁のペレットを渡します。650 x gで 5 分で 10%、FBS と遠心分離機 DMEM の 15 mL を追加します。
8. 赤の血液細胞を破壊する赤い血セル換散バッファーの 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。室温で 5 分間インキュベートそれ。赤色の血液細胞の換散を停止し、650 x gで 5 分間削除上澄みの遠心分離機、DMEM 10 %5 mL にペレットを再懸濁します PBS の 40 mL を加えて政府短期証券。
9. Preplating のステップとして 20 ml 150 mm コーティングされていないシャーレで増殖中の細胞をプレートします。(37 ° C、5% CO₂) 細胞文化のインキュベーターで孵化の 1 時間後に、媒体を収集します。
   注: 線維芽細胞、プレートへの取り付けは破棄されます、衛星細胞の懸濁液のまま。
10. 手順 3 の 2.9 倍と preplating の最後のステップで、衛星細胞懸濁液を含む媒体を収集します。
11. 650 × gで 5 分間遠心します。
12. セルは、遠心分離中コラーゲン (0.1 M 酢酸溶液に 0.1% 溶液の 10 mL) 2 つの 150 mm のペトリ皿のコートします。これを行うには、プレートにコラーゲンを入れて、5 分間インキュベート、それを削除します。30 分間乾燥プレートができます。
13. 2.11 の手順で得られた上澄みを廃棄し、増殖培地 (材料表) の 40 mL の細胞ペレットを再懸濁します。2 コラーゲン被覆 150 mm ペトリ皿 (皿あたり 20 mL) に細胞をプレートし、H2B GFP 発現を誘導するためのドキシサイクリン 1 μ G/ml と 2-3 日間増殖培地で細胞文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO₂ 5% O₂) で細胞を保ちます。
    注: この手順により、さらなる分析のための細胞数の増加を取得する筋芽細胞の増殖です。細胞密度が筋芽細胞の細胞への自発的な分化を避けるために非常に低く維持されます。

3. 筋芽細胞の分化・増殖の試金

注: 筋芽細胞密度が高いと、いくつかの細胞が伸長を開始し、セルを分割する必要は。一般的に、彼らの表現型に影響を与えずに細胞 2 x-3 x を分割することが可能です。

1. 培地を除去、5 ml の PBS のセルを洗浄して、トリプシン (1 x) 2 mL を加えると 5 分チェック、顕微鏡下で細胞のインキュベーターで 37 ° C でプレートを孵化させなさい、円形細胞をデタッチすると、10% を DMEM の 5 mL を追加し、トリプシンを不活化する政府短期証券。セルの数をカウント (通常は約 1 × 10⁶セル/マウスを取得することが可能)。
   注: 5 分トリプシン培養は通常十分な増殖筋芽細胞をデタッチします。
2. 下記の試金の 1 つのセルを対象します。
   1. 拡散の試金
      1. 1 mL/コラーゲン膜 12 ウェル プレートで増殖中の 50,000 細胞/ウェルをプレートし、めっきされたセル (37 ° C、5% CO₂) 細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。修正し、24、48、72 h でセルをカウントします。
         注: 媒体は養分の枯渇を避けるためにすべての 48 h を置き換えられます。
   2. 分化アッセイ
      1. 分化培地含む基底膜マトリックス (1: 100) の 350 μ L で 12 ウェル プレートをコートします。30 分の 37 ° C でプレートをインキュベートし、メディアを削除します。
      2. マトリックス コーティング プレートで分化培地で細胞/ウェル プレート 200,000。細胞文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO₂ 5% O₂) で細胞をインキュベート プレートにくっつきまで (2 h は、十分に一般に付着し、分化を開始するセル)。
      3. 差別化を評価するために、前述¹¹ミオシン重鎖と核の染色法を実行します。また、下記のとおりライブ イメージング解析を実行します。

4. 筋芽細胞分化と原子力の追跡のライブ イメージング

1. 生細胞イメージング、細胞、セクション 3.2.2 で得られた、インキュベーション システム装備して 5% CO₂の 37 ° C で細胞を維持するために、共焦点顕微鏡の下の 12 ウェル プレートのメッキを配置します。
2. 筋線維の形成を監視するのに十分な細胞の何百ものフィールドの表示を取得するのに 20 x 乾燥目的 (0.7 NA) を使用します。H2B GFP の細胞低強度 488 nm アルゴン レーザーでイメージを作成することができます。
   メモ: 開くピンホールは、画像の深度 (~ 10 μ m) では、セルがフォーカス実験中に格納できるように、セル厚が含まれていることを確認します。共焦点顕微鏡を用いたが有利なイメージの信号対雑音比が向上するのでワイド フィールド顕微鏡を使用することも。筋線維の形成は、伝送路を監視できます。
3. 16 時間 6 分毎フレームごとの 16 ビット、1,024 × 1,024 ピクセルのイメージを取得します。各取得した位置は、multiframe.tif ファイルを生成 (補助ファイルの例を参照してください)。
   注: 現在のプロトコルで顕微鏡 (材料表) に関連付けられている商用ソフトウェアを使用されています;その他の顕微鏡を使用するときに同じ目標を達成するために適切なソフトウェアを使用します。
4. .Zipの補足ファイルとして提供されているソフトウェアをダウンロードしてください。
   注: ルーチンは、MATLAB で実行する必要がありますスクリプトです。ソフトウェアは、筋形成過程における核の追跡のために最適化された公開されたソフトウェア¹²の適応です。このソフトウェアは、2 つの部分に分かれています: 最初の 1 つ 2 つ目は核運動の「トラック」(軌跡) を生成し、それらのセグメント化によって各フレームで核を識別します。核分割と追跡を開始するステップ バイ ステップ ガイドの完全なコードは、補助ファイルで提供されます。
5. Zip ファイルを抽出し、使用中のパーソナル コンピューター (PC) に目的のパスに保存します。すべての実行、必要なソフトウェアを既にインストールした PC 上の通路の下。.Zip ファイルは、以下のとおりの 3 つのフォルダーで構成されているに注意してください。
   注:分割ルーチンには、セグメンテーションを実行する関数が含まれています。追跡ルーチンは、代わりに、トラッキングに必要な機能が含まれます。基本的なスクリプトおよびファイル システムと知り合いに例のセグメンテーションの追跡を提供します。分割に使用されるソフトウェアと核の追跡が MATLAB、R2015a またはそれ以降のバージョンで正しく動作します。
6. .Tif ファイルから核をセグメント化、たとえば、 NameFile.tifファイルを名前します。
   1. 例セグメンテーション追跡フォルダーを開き、 DoSegmentation.mをクリックします。これは MATLAB のコマンド ウィンドウを開きます。
   2. 分割の例追跡フォルダー内のすべての要素を参照してください左に現在のフォルダーウィンドウを確認します。DoSegmentation.mをダブルクリックします。
      注: スクリプトで実行する必要がある変更の詳細については、StepbyStep.txt ファイルで見つけることが。変数filenameinputはNameFile.tif 、 folderinputは .tif ファイルが含まれているフォルダーは、スクリプトを変更するのには必須です。
   3. スクリプトを実行 (緑の上をクリックして [実行] ボタン)。分割の結果は、核のセグメンテーションは、出力図で視覚化すること、file.mat (SegmentedNameFile.mat) として保存されます。
      注: 必要な場合は、スクリプトに記載されている、分割のためのパラメーターを変更できます。CheckSegmentation.mスクリプトを使用してセグメンテーションの品質をチェックすることができます (StepbyStep.txt ファイルを参照してください)。セグメンテーションの品質が低い場合、これに基づいて (のみいくつか核検出)、セグメンテーション、 DoSegmentation.mスクリプトに明確に記載のパラメーターを調整し、手順を繰り返します。
7. トラック (すなわち、各時間に原子核の軌道) を生成するには、同じ作業フォルダーでスクリプトGenerateTracks.mを実行、分割で得られた核の位置を使用して。入力として適切な分割ファイルを追加してください (詳細については、StepbyStep.txt ファイルを参照してください) の前に得られました。
   注: 出力でユーザーはファイルTrackedNameFile.mat、x 座標のための行列と生成されたトラックの y 座標に別の行列を得られます。
8. CheckTracking.mを使用してトラックの品質評価 (詳細については、StepbyStep.txt ファイルを参照してください)。この最後の通路の出力図を時間内の各核位置を視覚化するために使用します。各セグメントの核を示す緑色の十字の左上を確認します。1 つの特定の核を選択すると、下部のスクロール バーを使用します。選択した核を一周することに注意してください赤で右側中軌道選択セルの続くことができる時間 (上部のスクロール バーを使用して)。

結果

自動的にライブ イメージングで筋芽細胞分化に非核運動に従う、核が優先的に蛍光に分類します。これらの分子は¹³主筋芽細胞の分化と増殖を妨害するため、DNA 間をインターカ レート分子を使用して実現可能なないが注意することが重要です。例として、増殖と分化をプライマリ筋芽細胞培養ヘキスト (図 1) の有無で分析さ?...

ディスカッション

筋繊維 (筋線維)、多核巨細胞の細胞増殖と分化の^{2,3を受ける筋幹細胞 (サテライト細胞) 由来筋前駆細胞 (筋芽細胞) の融合によって形成されます。 4}。媒体を区別し、MyHC、分化のマーカーとの染色の染色蛍光抗体法を実行する異なる時点で細胞を固定で筋芽細胞を培養筋芽細胞分化を評価するには、一般的な手順ので構成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um