Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Riepilogo

Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.

Abstract

I macrofagi alveolari (ma) guardia spazio alveolare del polmone. Fagocitosi di AMs svolge un ruolo critico nella difesa contro l'invasione di agenti patogeni, la rimozione delle cellule morte o particelle estranee e nella risoluzione della risposta infiammatoria e rimodellamento del tessuto, i processi che sono mediati dai vari recettori di superficie di L'AMs. Qui, segnaliamo i metodi per l'analisi della funzione fagocitica di AMs utilizzando saggi in vitro e in vivo e strategie sperimentali per differenziare il modello riconoscimento del recettore - complemento recettore- e Fc gamma ricevitore-mediata fagocitosi. Infine, si discute un metodo per stabilire e caratterizzare un modello di polmonite di p. aeruginosa nei topi per valutare la clearance batterica in vivo. Questi saggi rappresentano i metodi più comuni per valutare le funzioni AM e possono anche essere utilizzati per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.

Introduzione

AMs sono i fagociti residenti principali negli alveoli in fase di riposa e uno dei principali attori della risposta immunitaria innata attraverso il riconoscimento e interiorizzazione degli agenti patogeni per via inalatoria e particelle estranee^1,2. È stato segnalato che AMs sono essenziali per la rapida clearance di molti agenti patogeni polmonari come p. aeruginosa e Klebsiella polmonite^3,4, quindi una carenza nella fagocitosi AM si traduce spesso in respiratoria infezioni, come la polmonite acuta, che causano più alti tassi di mortalità e morbosità.

AMs anche avviare le risposte infiammatorie innate nel polmone con la produzione di citochine e chemochine come TNF-α e IL-1 β, quale area interattiva con altre cellule dell'ambiente alveolare per produrre chemochine e reclutare infiammatori neutrofili, monociti, e cellule immuni adattive nel polmone⁵. Per esempio, IL-1 β prodotto da AMs aiuta per innescare il rilascio di neutrofili chemochina CXCL8 da cellule epiteliali⁶. Inoltre, AMs contribuiscono alla fagocitosi di apoptotic leucociti polimorfonucleari (PMNs), di che conduce alla perdita sostenuta di enzimi intracellulari da PMNs mancato il tessuto circostante, con conseguente danno tissutale e l'infiammazione prolungata ^{7 , 8 , 9}.

Fagocitosi di AMs sono mediato da un diretto riconoscimento di pattern molecolari associati alla superficie dell'agente patogeno da recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) dell'AMs o dall'associazione di agenti patogeni opsonized con i recettori immuni effettrici dell'AMs ¹⁰. per quest'ultimo, AMs può riconoscere i bersagli opsonized con immunoglobuline (IgG) attraverso i loro recettori Fcy (FcγR) o gli agenti patogeni rivestiti con frammenti di complemento, C3b e C3bi, attraverso i loro recettori del complemento (CR)¹¹. Tra i recettori del complemento, il CR della superfamiglia delle immunoglobuline (CRIg) è espressa selettivamente nel tessuto macrofagi¹², e una recente scoperta ha evidenziato il ruolo di CRIg nella fagocitosi AM nel contesto della polmonite di p. aeruginosa ¹³.

Molti studi originali utilizzano metodi per valutare la fagocitosi del macrofago per descrivere i meccanismi molecolari del macrofago funzione^14,15. Tuttavia, i metodi come fagocitosi in vivo richiedono una precisa quantificazione della fagocitosi. Qui, riassumiamo una metodologia dettagliata per fagocitosi sia in vitro che in vivo utilizzando isotiocianato di fluorescina (FITC)-microsfere di vetro e proteina di p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), rispettivamente. Inoltre, spieghiamo il metodo della differenziazione fra PRR-, CR- e fagocitosi mediata da FcγR. Infine, segnaliamo un metodo per caratterizzare lo spazio batterico nel topo rispetto alla polmonite di p. aeruginosa .

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) della Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescente perline fagocitosi

1. Eutanasia il mouse (C57BL/6J, vecchio 6 settimane, femmina) di CO₂ asfissia secondo protocolli IACUC per l'eutanasia etico degli animali.
2. Appoggiare il mouse pancia-up su una tavola di dissezione coperta con carta da cucina. Fissare le zampe con le sue membra spread-eagle e gancio una stringa sotto i suoi denti anteriori per tirare la testa indietro in modo che la trachea è ben diritta e livello.
3. Bagnato il mouse gola, petto e pancia con etanolo al 70% per disinfettare e prevenire la pelliccia di attaccarsi agli strumenti.
4. Usando il forcipe regolare, tirare la pelle in corrispondenza dell'asse del corpo e tagliare con forbici chirurgiche fino alla linea d'asse alla parte superiore della gola.
5. Utilizzando l'estremità smussata di forbici chirurgiche standard, allontanare il muscolo e dei tessuti connettivi sulla gola e attentamente utilizzare forbici di primavera (microforbici) per esporre la trachea.
6. Accuratamente con le pinze di presa un anello di cartilagine, praticare una piccola incisione (~1.5 mm), utilizzando microforbici, sul viso ventricolo della trachea e inserire una cannula 18 G nella trachea.
7. Delicatamente il lavaggio 3 mL di tampone fosfato salino (PBS), 1 mL alla volta. Ogni volta che aspirare delicatamente il liquido nella siringa e reinfuse indietro nel polmone, 3 volte consecutivamente. Dopo aver raccolto il BALF, eseguire dislocazione cervicale per garantire l'eutanasia. Trasferire il PBS raccolto (~2.8 mL), che è il fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), in una provetta, centrifugare a 1.000 x g per 10 min e raccogliere il pellet. Aggiungere 1 mL di PBS fresco per la provetta e centrifugare a 1.000 x g per 10 min lavare i detriti e raccogliere i macrofagi alveolari pellettati.
8. Risospendere il pellet in 2 mL di medium dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% nonheat-inattivato siero bovino fetale (FBS) e macrofagi alveolari primario di cultura nello stesso supporto per 2 giorni su un piatto di vetro-inferiore a 37 ° C in atmosfera umidificata.
9. Aspirare i vecchi media, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 2 mL di terreno fresco. Aggiungere perline FITC (granuli di lattice carboxylated, 2 µm di diametro, 50 Perline/cella) e incubare per 1h a 37 ° C in atmosfera umidificata.
10. Lavare estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) per rimuovere cordoni di extracellulare. Immagine 100 cellule in modo casuale e contare le celle con i branelli intracellulare (488 nm).
    Nota: gli indici fagocitico sono il numero di perle ingeriti diviso per il numero totale dei macrofagi; la percentuale delle cellule fagocitiche è il numero di macrofagi che ingerire almeno un branello diviso per il numero totale di macrofagi¹⁶.
    1. In alternativa, dopo un'incubazione di 1 h con perline, lavare le cellule con 3 mL di PBS ed elaborarli per citometria a flusso per la quantificazione della fagocitosi. Allo stesso modo, è possibile elaborare AMs senza perle come le celle non macchiate o controllo. Calcolare la percentuale di positività e significare l'intensità di fluorescenza, utilizzando software di citometria a flusso, selezionando le opzioni del software.

2. fagocitosi mediata da FcγR e CR

1. Per l'opsonizzazione, incubare 2 x 10⁸ pecore globuli rossi (SRBCs) con 50 µ l di coniglio anti-SRBC-IgM o 50 µ l di coniglio anti-IgG SRBC per 30 min a temperatura ambiente¹¹.
2. Incubare IgM-opsonized SRBCs con 50 µ l di siero umano C5-carenti (C5D) per 30 min a 37 ° C per correggere i frammenti del complemento C3b e C3bi su rivestite con IgM SRBCs.
3. Seme dei macrofagi murini cellule (MH-S) (10.000 cellule/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti e incubare durante la notte per ottenere una confluenza di ~ 70%. Aggiungere 100 µ l di 1 x 107/ml opsonized SRBCs in ciascun pozzetto della cellule MH-S e incubare per 1h a 37 ° C. Lavare unbound SRBCs molto rapidamente (~ 1 min) con 100 µ l di tampone di lisi di cloruro di ammonio e potassio (ACK).
4. Lisare le cellule con 0,1% SDS e aggiungere 50 µ l di 2,7-diaminofluorene (DAF) contenente perossido di idrogeno 3% e 6 M urea. Misurare l'assorbanza della formazione di emoglobina-catalizzata fluorene blu a 620 nm.
5. Determinare il numero di SRBCs con una curva standard a 620 nm assorbanza valori con un numero noto di SRBCs. Allo stesso modo, il processo MH-S cellule incubate con nonopsonized SRBCs da utilizzare come controlli negativi.

3. PRR-mediata fagocitosi

1. Procedura il 1.1-1.9, per l'isolamento e la coltura dei macrofagi alveolari primario del mouse.
2. Dopo 2 giorni, rimuovere il supporto, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di fresco che contenevano Alexa Fluor-488-coniugato zymosan-A bioparticelle (100 particelle/piatto).
3. Incubare per 1 h a 37 ° C. Fermare la fagocitosi aggiungendo 500 µ l di PBS ghiacciata.
4. Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi). Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente.
5. Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) e mantenere le cellule in 500 µ l di PBS.
6. Immagine le cellule sotto contrasto differenziale di interferenza e un canale fluorescente a 488 nm. Contare AMs contenente zymosan-A bioparticelle e determinare la percentuale di fagocitosi.

4. in Vivo fagocitosi dai macrofagi alveolari

Nota: Inoculare p. aeruginosa GFP su una piastra di agar nutriente e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Il giorno successivo, inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo nutritivo e crescere i batteri a 37° C durante la notte.

1. Il giorno successivo, anestetizzare i topi con una somministrazione intraperitoneale di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Confermare il corretto amputate tramite una mancanza di risposta per il pizzico di punta.
2. Posare il mouse su una tavola piatta con un elastico tra gli incisivi superiori e collocarlo in una posizione semirecumbent (45°) con la superficie ventrale e rostro rivolto verso l'alto. Utilizzando forcipe curvo, ritrarre parzialmente la lingua. Utilizzando un microsprayer, vari amministrare 50 µ l (5 x 10⁶ unità formanti colonie [CFU])¹⁷ di p. aeruginosa GFP nei polmoni dei topi anestetizzati.
3. Dopo 1 h di infezione, come segue: 1.1-1.7.
4. Risospendere le cellule in PBS e citocentrifuga li (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) su una lastra di vetro.
5. Differenzialmente colorare i vetrini cytospin per alveolari macrofagi, neutrofili e linfociti, secondo le istruzioni del produttore.
6. In modo casuale selezionare 100 AMs, contare l'AMs contenente batteri intracellulari e determinare la percentuale di fagocitosi.

5. in Vivo batteri Clearance utilizzando p. aeruginosa

1. Inoculare in p. aeruginosa su una piastra di agar isolamento di p. aeruginosa e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo di Lisogenesi (LB) e crescono i batteri a 37° C durante la notte. Calcolare il CFU, utilizzando la seguente formula.
   
   CFU/mL = (numero di colonie x fattore di diluizione) / volume della piastra di coltura.
   
   Diluire la cultura con PBS per ottenere il desiderato CFU/mL.
2. Nella prova 1, vari iniettare una dose subletale di ~2.5 x 10⁵ CFU/mL p. aeruginosa in anestetizzati wild-type (WT) e TRIM72^KO topi, come indicato al punto 4.2. Misurare il peso corporeo al giorno per 6 giorni.
3. Nella prova 2, iniettare una seconda dose di p. aeruginosa (5 x 10⁵ CFU/mL) in topi che è sopravvissuto in prova 1 e misurano il peso corporeo per 4 giorni.
4. In prova 3, utilizzando un diverso insieme di topi, topi WT e TRIM72^KO di iniettare con una dose letale (3 x 10⁷ CFU/mL) di p. aeruginosa e registrare la mortalità entro 2 giorni dall'iniezione. Gli animali che presentano segni di grave stress quali perdita di peso significativa, gobba, anoressia o dispnea sarà valutata dai veterinari che frequentano. Intrattabili animali saranno sacrificati immediatamente.
5. Morte o dopo l'eutanasia al giorno 2 dopo l'iniezione, raccogliere il tessuto intero-polmone per la quantificazione degli oneri batterica polmonare all'infezione di picco.
6. Per verificare la carica batterica polmonare, aggiungere 200 µ l di soluzione salina normale per i tessuti polmonari e omogeneizzarle, utilizzando un'impostazione precedentemente testata su un omogeneizzatore elettronico che interrompe completamente il tessuto polmonare senza rompere i batteri. Regolare il volume totale dell'omogeneato del polmone a 1 mL e piastra 100 µ l del lisato su piastre di agar Pseudomonas isolamento alle 10 volte diluizioni seriali del polmone.
7. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h e conta delle colonie batteriche per determinare il CFU per intero polmone.

6. elaborazione statistica

1. Utilizzare di Student t-test per determinare la significatività statistica della differenza tra i due gruppi. Si consideri una differenza statisticamente significativa quando p < 0.05. Tutti i dati sono presentati come mezzi ± errore standard della media (SEM).

Risultati

Abbiamo effettuato prima l'esperimento per analizzare fagocitosi da mouse primario AMs. Nel corso di tutte le analisi, abbiamo confrontato AMs isolati da topi WT e TRIM72^KO . Come illustrato nella Figura 1A, microscopia di fluorescenza ha rivelato che fagocitosi di FITC-vetro perline da mouse AMs primario si verifica dopo 1 h di incubazione. Figura 1 B Mostra l'analisi della fagocitosi...

Discussione

Durante l'esecuzione di una funzione di scambio di gas, il polmone si confronta con insistenza allergeni, agenti patogeni e particelle estranee. AMs rappresentano la prima linea di difesa in virtù della loro funzione principale, vale a dire la fagocitosi. AMs anche coordinare con altre cellule immuni a distruggere gli agenti patogeni e nella risoluzione di infiammazione. Qui, abbiamo descritto metodi per valutare specificamente la fagocitosi di AMs isolato dal polmone del topo. Il protocollo presentato in questo manoscr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade