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要約

このプロトコルは、血管化 heterotopic 脾臓移植のマウスモデルの外科的ステップを詳述し、脾臓細胞の運命と長寿を研究するための強力なツールとして役立つことができる技術的に困難なモデル、明確な脾臓のメカニズム疾患の進行における細胞集団、および移植免疫。

要約

脾臓は、免疫および造血系の恒常性に重要な役割を果たしているユニークなリンパ球性器官である。沈殿の原因に関係なく脾臓摘出を受けた患者は、圧倒的なポスト脾臓摘出感染症を発症し、深部静脈血栓症および悪性腫瘍のリスクの増加を経験する傾向がある。最近、疫学研究は、脾臓摘出が心血管疾患の発生と関連している可能性があることを示し、脾臓の生理的機能が未だ十分に認識されていないことを示唆している。ここでは、異なる生物学的プロセスにおける脾免疫細胞サブセットの機能と行動活性を研究するために利用できるだけでなく、テストする強力なツールにもなる血管化 heterotopic 脾臓移植のマウスモデルを紹介します。特定の疾患における脾臓移植の治療可能性。このモデルの主な外科的処置には、ドナーの脾臓の収穫、レシピエントの天然脾臓の除去、および脾臓移植血管再生が含まれる。コンジェニマウス系統 (例えば、CD 45.1/CD 45.2 の背景を持つマウス) を用いて、同系移植後、ドナー由来の脾リンパ球と骨髄細胞の両方が術後1日目のように移植片から移行したことを観察し、それに付随して複数のタイプのレシピエント細胞の流入は、したがって、ユニークなキメラを生成する。 比較的困難な技術にもかかわらず、この手順は > 90% の成功率で実行することができます。このモデルは安定した状態の間に脾細胞の運命、長寿および機能を追跡し、脾臓の移植の後で病気の設定で、それによって脾臓由来の免疫細胞のための明確な役割を発見する大きい機会を提供することを可能にする異なる疾患プロセス。

概要

脾臓は、体内で最大の二次性リンパ球器官であり、免疫および造血系において重要である。その機能は、主に2つの形態学的に異なる区画、赤色パルプおよび白色パルプ1によって行われる。赤色パルプは、網状繊維、網状細胞、および関連するマクロファージからなる静脈洞および脾コードの三次元帯網である。このユニークな構造は、異物や古いまたは損傷した赤血球を除去する有効な血液フィルターとして機能する赤いパルプを可能にします。ホワイトパルプは、卵胞、マージナルゾーン、および periarteriolar リンパ鞘 (パル) を含み、抗原捕捉および処理、リンパ球ホーミング、形質転換、増殖、および成熟2のための重要な部位である。それにもかかわらず、リンパ節のような他のリンパ器官も、その機能の一部を実行し、脾臓の喪失が通常は死に至ることがないため、脾臓は済む器官として一般的に考えられてきた。脾臓摘出は、それゆえに、脾損傷または良性血液疾患の患者に対する治療方法として広く実施されている3.しかし、脾臓摘出の患者は、長期の合併症の数に直面しています。細菌感染は、脾臓摘出4,5の最もよく認められた合併症である。最近、圧倒的なポスト脾臓摘出敗血症は、高い死亡率6に関連する脾臓摘出の集中的な合併症として認識されている。さらに、最近の疫学的研究は、脾臓摘出が心血管疾患の発生に関連し得ることを示しており、さらなる脾臓の生理的機能が検討されるべきであることを示唆している7、8。

脾臓 autotransplantation および脾臓他家移植の両方がクリニックで利用されている。現在、脾組織の切片を大きな大網で作成されたパウチに注入することによって脾臓 autotransplantation は、外傷性脾臓摘出9,10後の脾機能を保存する唯一の可能性と考えられている。しかし、この外科手術の有効性は、無菌性の組織と術後の癒着による小腸閉塞が11で発生する可能性があることのような術後合併症として議論されている。脾臓他家移植は、multivisceral 移植12に関与する。Multivisceral 移植からの臨床的証拠は、脾臓他家移植が移植片対宿主病 (GVHD)12を引き起こすことなく小腸同種移植拒絶反応において保護的役割を果たし得ることを示唆している。しかし、multivisceral 移植の構成要素としての脾臓他家移植の有益な効果に関する文献は依然として制限されており、その根底にあるメカニズムは定義されたままである。2006年に、Yair Reisner et al. は、マウスに T 細胞を持たないブタ胚性脾臓組織を移植することが、GVHD13を発症せずに遺伝性疾患である血友病 a を治療することができ、脾臓移植が治療的な約束を保持することを支持すると報告した。特定の病気.したがって、脾臓移植の治療可能性に関するさらなる調査が必要である。

脾臓移植の動物モデルは、疾患進行における脾臓由来免疫細胞の unappreciated 機能を探索するだけでなく、脾臓移植の潜在的な治療効果を試験するために貴重である。実験全体の脾臓の移植のモデルはコーエン14によって確認されるように1900年初頭以来、文書になっています。1969では、・コバーンリチャード j. とリー et al. ラット15,16における脾臓移植の技術を詳述した。さらに最近では、Swirski FK et al. 脾臓移植17のマウスモデルについて説明した。ラットモデルと比較して、脾臓移植のマウスモデルは、そのいくつかの固有の利点のために、より魅力的です。例えば、マウスモデルを利用することで、ラットモデルでは利用できない多種多様な試薬にアクセスすることができます。さらに、コンジェニマウス (例えば、CD 45.1/CD 45.2 バックグラウンドを有するマウス) を使用することによって、同系脾臓移植は、その運命、長寿、および脾細胞の機能を追跡することを可能にする18。Swirski FK et al.17による作業に基づいて、我々はさらに、マウスにおける脾臓移植のこの単純化および強化されたプロトコルを確立した。以下に述べるプロトコルは、標準化された方法で信頼性と実現性の両方を兼ね備えており、脾臓生物学と移植免疫を研究するツールとして利用することができます。

プロトコル

本研究におけるすべての手技および動物の使用は、ノースウェスタン大学内部動物ケアおよびユース委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルに従って実施した。本研究では、8 ~ 10 週齢の男性用 CD 45.2 および CD 45.1 マウス (両方とも BALB/c バックグラウンド、ジャクソン研究室からのもの) をそれぞれ脾臓ドナーおよびレシピエントとして使用し、同系脾臓移植モデルを作成した。全ての動物は、ノースウェスタン大学の動物施設における無菌環境に収容された。眼の潤滑剤を、乾燥を防ぐために anesthetization の全てのマウスに塗布した。

1. 外科的調製、Anesthetization、および鎮痛レジメン

  1. 外科プラットホームに生殖不能の使い捨て可能なドレープ (45.7 cm x 66 cm) を置きなさい。マウスをやさしくつかみ、ケタミン (50 mg/kg) とキシラジン (10mg/kg) を注入し、腹腔内 (i. p) を麻酔とし、0.05 mg/kg のブプレノルフィンを鎮痛のために皮下注射する。
  2. つま先で麻酔の深さを確認し、カミソリで腹部全体の髪を剃り、6-10x 倍率で手術用顕微鏡下の滅菌手術用プラットフォーム上にマウスを置きます。

2. ドナー脾臓の収穫

  1. アルコール準備パッドで腹部を滅菌し、外科用テープで手足を固定し、3-4 cm の正中線を恥骨から剣状突起プロセスにはさみで切開してください。
  2. クリップなどからなされる生殖不能のレトラクターによって腹部壁を撤回しなさい。腹部の右脇腹に腸を移動させる (外科医の左) 滅菌綿棒を用いて脾臓を露出する。無菌の低温焼灼で脾臓に付着した短い胃静脈を包む準備 (図 1a).37° c の生理食塩水を浸した滅菌ガーゼを脾臓の上に置き、湿ったままにします (図 1b)。
  3. 門脈枝 (優れた pancreaticoduodenal 静脈および右胃静脈) を結紮することによって、膵臓組織から門脈を分離して動員する (図 1c)。脾臓静脈から遠位の門脈の周りに縫合糸を置く (図 1d)。
  4. 脾臓を右にフリップして大動脈とセリアックを脾動脈にさらす (図 1e)。肝動脈と胃動脈を結紮することによって大動脈・セリアック動脈を解剖し、動員する。セリアック動脈の近位の大動脈の周りに縫合糸を置きます (図 1f-G)。
  5. 100インターナショナル・ユニット (IU) ヘパリンを下大静脈 (IVC) に注入し全身を heparinize し、ヘパリンが作用するのを確実にするために3分待つ。大動脈をセリアック動脈に結紮、門脈をトランセクトし、次いで、10 mL のヘパリン処理冷 (4 ° c) 生理食塩水 (10 mL/20 s) を使用して全身を perfuse し、腹部大動脈から腹腔内幹にする (図 1h)。
  6. 脾臓移植片に関連した大動脈・セリアック病と門脈を採取し、脾静脈のセグメントと膵臓組織のごく一部と共にポータル静脈を集めます。移植前に4° c の生理食塩水5ml に移植片を保存します。頚部脱臼によってマウスを Euthanize。

3. レシピエント脾臓摘出と脾臓移植片移植

  1. 外科プラットホームに熱パッドを置き、37° c. に温度を調節しなさい。滅菌外科プラットフォームを作成するために、加熱パッドの上に滅菌ドレープ (45.7 cm x 66 cm) を配置します。外科準備および anesthetization のためのステップ2.1 そして2.2 を繰り返しなさい。3-4 cm の正中線切開を行い、ステップ2.1 およびステップ2.2 に記載されているように腹壁を撤回する。
  2. 滅菌綿棒を使用して、マウスの右側に腸を慎重に移動して、レシピエントの脾臓を露出させる。脾静脈と動脈を結紮、脾臓を摘出する。
  3. 慎重に腸をマウスの左に移動させると、濡れたガーゼ (無菌37° c の生理食塩水で浸した) で腸を覆います。Infrarenal 大動脈と IVC の腰椎を解剖し、結紮。infrarenal 大動脈と IVC を2つの 4 mm 微小血管クランプを使用してクロスクランプします。
  4. Infrarenal 大動脈 (完全な厚さ) を通して11-0 ナイロン縫合線を置き、microscissors が付いている単一の切口によって楕円 aortotomy を作成するために撤回しなさい (長さはドナー大動脈の直径に一致させるべきである、図 2a)。30 G 針を使用して IVC を貫通して楕円形の venotomy を作成し、microscissors を使用して、開口部をドナーポータルの静脈に一致する長さに拡張します (図 2a)。
  5. 管腔内の血液または血栓 (大動脈および IVC) を500μ l のヘパリン処理 (10 単位/Ml) でクリアします。
  6. レシピエントマウスの腹部の右脇腹に脾臓移植を配置する。ドナーの大動脈カフとドナーの門脈を慎重に同定する。血管がねじれていないことを確認した後、(4 ° c) 食塩水で浸したガーゼで脾臓移植片を覆う。
  7. ドナーの大動脈カフを、2滞在縫合線 (11-0 ナイロン縫合線、下図2b、C) でレシピエントの aortaotomy の近位および遠位頂点に接続する。ドナーの大動脈カフとレシピエントの aortaotomy (前壁) との間に2-3 の連続11-0 ナイロン縫合糸を刺された吻合術 (図 2d) を作る。脾臓移植をレシピエントの左側に回す。ドナーの大動脈カフとレシピエントの aortotomy (後壁) の間の吻合術を行う (図 2e)。
  8. ドナーの門脈をレシピエントの IVC の後壁に接続し、IVC の内側に 4 ~ 5 個の連続縫合糸を刺された後、IVC の外側で縫合糸を閉じることによって提供者のポータル静脈を受けます (図 2f、G)。
  9. 容器クランプを放し、滅菌綿棒を使用して、脾臓の色が回復するまで出血をタンポナーデします (図 2h)。
  10. 5-0 合成吸収性 vicryl 縫合糸を連続したパターンで腹部を閉じます。中断されたパターンの5-0 ナイロン縫合線の皮の層を閉めなさい。
    注:ステップ 4.7-4.8 のために、あるいは、ドナーの門脈とレシピエントの IVC の間の吻合術を最初にする (ステップ 4.8)。次に、ドナーの大動脈のカフとレシピエントの aortotomy の後壁との間の吻合術を行い、大動脈の内側で 2 ~ 3 本の連続縫合糸を使用し、大動脈の外側で縫合線を閉じる。

4. 動物の回復

  1. 腹部を閉じた後4つの別々の場所 (0.25 mL/場所) を介して皮下に温かい生理食塩水1ml を注入します。
  2. 操作後の最初の数時間は、マウスを温度制御されたインキュベーター (30 ° c) に保ち、十分な意識を取り戻した後、マウスを定期的な食品と水で新しいクリーンケージに移し、加熱パッド (30 ° c) ケージの下にあります。手術後のマウスを別のケージに保管してください。

5. 術後疼痛管理

  1. 鎮痛レジメンを維持するために、0.05 mg/kg ブプレノルフィンを皮下24時間および 48 h に注入する。

結果

マウスの脾臓の移植の全体のプロシージャは経験 microsurgeons によって90分以内に完了することができる。当研究室では、100以上の脾臓移植をマウスで実施しています。成功率は 90% 以上であり、レシピエントマウスと脾臓移植片の術後日 (POD) 1 または POD 7 (研究エンドポイント) の両方の生存によって定義される。脾臓移植片の生存率は、脾細胞の巨視的な出現および?...

ディスカッション

魅力的な証拠は、脾臓由来の単球がアテローム性動脈硬化症19、急性虚血性脳20または肺損傷18、ならびに心筋 I/R 損傷などの無菌炎症過程において重要な役割を果たしていることを示唆しており、改造21、22、23。これらの報告は、多くの慢性疾患における脾臓の過小認?...

開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

著者は、ノースウェスタン大学総合移植センターとファイン・オブ・メディスン・スクール・オブ・メディシン研究リソースと資金援助のためのコアプログラム。具体的には、フローサイトメトリーおよび組織学サービスは、ノースウェスタン大学フローサイトメトリーコア施設およびマウス組織学およびみつかり研究所によって提供され、それぞれは、CA060553 に授与される NCI P30 によって支持されている・ルーリー総合癌センター。この原稿の校正についてネイト・エスパルサに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
KetamineWyeth206205-01
XylazineLloyd Laboratories139-236
Heparin solutionAbraxis Pharmaceutical Products504031
Injection grade normal salineHospira Inc.NDC 0409-4888-20
70% EthanolPharmco Products Inc.111000140
ThermoCare Small Animal ICU SystemThermocare, Inc.
Adson ForcepsRoboz Surgical InstrumentsRS-5230
Derf Needle HolderRoboz Surgical InstrumentsRS-7822
Extra Fine Micro Dissecting ScissorsRoboz Surgical InstrumentsRS-5881
Micro-clipRoboz Surgical InstrumentsRS-5420
7-0 silkBraintree ScientificSUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needleSharpoint DR4AK-2119
Ms CD45.2 antibodyBD Bioscience553772
Ms CD45.1 antibodyBD Bioscience553776
Ms CD11b antibodyBD Bioscience557657
Ms B220 antibodyBD Bioscience553089
Ms Ly6C antibodyeBioscience48-5932-80
Ms Ly6G antibodyBD Bioscience561236
Ms F4/80 antibodyBD Bioscience565614
Ms CD11c antibodyBD Bioscience558079
Ms CD3 antibodyeBioscience48-0032-82
Ms CD4 antibodyBD Bioscience552051
Ms CD8 antibodyBD Bioscience563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain KitThermo FisherL34955

参考文献

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