Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.

Abstract

La coltura ex vivo dei cardiomiociti di mammiferi adulti (CM) presenta il sistema sperimentale più rilevante per lo studio in vitro della biologia cardiaca. I VM di mammiferi adulti sono cellule terminalmente differenziate con capacità proliferative minima. Lo stato post-mitotico dei VM adulti non solo limita la progressione del ciclo cellulare cardiomiocato, ma limita anche la coltura efficiente delle CM. Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per molti studi, come la proliferazione CM e l'analisi dell'espressione genica.

Il topo e il ratto sono i due animali da laboratorio preferiti da utilizzare per l'isolamento cardiomiocato. Mentre la cultura a lungo termine dei CCI ratti è possibile, i VM per topi adulti sono suscettibili alla morte e non possono essere sevati più di cinque giorni in condizioni normali. Pertanto, vi è una necessità critica di ottimizzare l'isolamento delle cellule e il protocollo di coltura a lungo termine per le CCI murine adulte. Con questo protocollo modificato, è possibile isolare con successo e coltura sia per topi adulti e ratto CMs per più di 20 giorni. Inoltre, l'efficienza della trasfezione del siRNA di CM isolato è significativamente aumentata rispetto ai rapporti precedenti. Per l'isolamento CM del topo adulto, il metodo di perfusione Diatrofio viene utilizzato con una soluzione enzimatica ottimale e con tempo sufficiente per la completa dissociazione della matrice extracellulare. Al fine di ottenere CM ventricolari puri, entrambi gli attri sono stati sezionati e scartati prima di procedere con la dissociazione e la placcatura. Le cellule sono state disperse su una piastra rivestita di laminina, che ha permesso un attaccamento efficiente e rapido. I VM sono stati autorizzati ad accontentarsi di 4-6 h prima della trasfezione del siRNA. I supporti di coltura sono stati aggiornati ogni 24 h per 20 giorni, e successivamente, i CM sono stati fissati e macchiati per marcatori cardiaci specifici come La troponina e marcatori del ciclo cellulare come KI67.

Introduzione

Le malattie cardiache sono una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Quasi tutti i tipi di lesioni cardiache si tras danno una significativa perdita di cardiomiociti adulti (CM). I cuori dei mammiferi adulti non sono in grado di riparare le loro lesioni cardiache a causa della natura senescente del CM^{1 adulto.} Così, qualsiasi insulto al cuore dei mammiferi adulti si traduce in una perdita permanente di CMs, che porta a una ridotta funzione cardiaca e insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi adulti, piccoli animali come il pesce zebra e i cuori di nuovatta possono rigenerare le loro lesioni cardiache attraverso la proliferazione CM^{esistente 2,3,4}. È in corso uno sforzo mondiale per trovare un nuovo intervento terapeutico per le lesioni cardiache tramite approcci prolifertivi e non proliferative. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari tipi di modelli genetici di topo per studiare le lesioni cardiache e la riparazione. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali in vivo continua ad essere un approccio costoso con l'ulteriore complessità per decifrare un meccanismo autonomo dalle cellule dagli effetti secondari. Inoltre, i sistemi in vivo sono difficili da analizzare CM effetti specifici di un intervento farmacologico che induce la segnalazione cardioprotettiva dal CM.

Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per eseguire analisi di proliferazione cm. I saggi di proliferazione CM richiedono un minimo di 4-5 giorni affinché le cellule siano indotte nel ciclo cellulare e per ottenere dati accurati dopo di che. Inoltre, gli studi che utilizzano cM isolati per studi elettrofisiologici, screening farmacologici, studi^di tossicità e studi sull'omeostasi di Ca sono tutti bisognosi di un sistema di^{coltura migliorato 5,6,7}. Inoltre, studi recenti mostrano il significato cardioprotettivo delle citochine secrete dai CMs (cardiocine)^8,9. Al fine di studiare il ruolo terapeutico e il meccanismo molecolare di queste cardiochine durante la riparazione e la rigenerazione del cuore, è necessaria una coltura prolungata.

Le CCI ratto adulte sono sufficientemente robuste per l'isolamento a una cellula e la coltura a lungo termine in un sistema in vitro^10,11,12. Tuttavia, i CIM per topi adulti sono di grande interesse per gli analisi in vitro, a causa della disponibilità di una varietà di modelli murini geneticamente modificati, che consente la progettazione e l'esecuzione di varie analisi innovative che non sono possibili con il ratto CM¹³. A differenza dell'isolamento CM del ratto adulto, è piuttosto difficile ottenere una sospensione a un solo cellula dai cuori dei topi adulti, e la cultura a lungo termine delle VM per topi adulti nella cultura è ancora più impegnativa.

L'isolamento CM adulto dai cuori di topo e ratto utilizzando un sistema Langendorff è stato precedentemente stabilito per studiare la funzione CM^5,14,15. Qui, abbiamo descritto in dettaglio i protocolli per l'isolamento CM adulto da ratti e topi, così come una coltura a lungo termine modificata, la trasfezione e la proliferazione CM di cellule isolate.

Protocollo

Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità con le linee guida della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicata dal National Institute of Health (NIH) degli Stati Uniti. Tutti i protocolli visualizzati nel video sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati, College of Medicine.

1. Preparazione prima dell'estrazione cardiaca da topi adulti (e ratti)

1. Preparare le corrispondenti soluzioni di perfusione, enzima e arresto, secondo le ricette fornite nella Tabella 1 e nella Tabella 2,rispettivamente per l'isolamento di ratti e topi. Filtrare le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 m per rimuovere eventuali contaminazioni o particelle non dissolte.
2. Pulire e sterilizzare gli strumenti chirurgici immergendoli nel 70% di alcol per 15 minuti, e successivamente lavare con acqua doppia distillata. Lasciare asciugare gli utensili su un tovagliolo di carta pulito.
3. Preriscaldare il bagno d'acqua a 37 oC. Controllare il livello dell'acqua nel bagno d'acqua per garantire una circolazione ininterrotta di acqua calda attraverso l'apparato di perfusione durante la procedura.
4. Pulire l'apparato di perfusione correndo con 70% di alcol per 5 min. Ripetere.
   NOTA: Aumentare la velocità di flusso, che aiuta a pulire il tubo.
5. Dopo il flusso di alcolattraverso, pulire i resti di alcol eseguendo acqua doppia distillata per 10 min.
6. Impostare 3 piatti di pesatura in polistirolo usa e getta di medie dimensioni per pulire il cuore dopo l'escissione. Riempire i piatti con 20 mL di tampone miocite.
7. Aggiungere 2-3 gocce di epatina ad ogni piatto con l'aiuto di Pasteur pipette e mescolare bene pipetta più volte.
8. Prendere una siringa da 10 mL con una cannula ad ago smussato.
   NOTA: Una cannula ad ago smussato può essere preparata tagliando la punta di un ago pulito e sterile. Un ago da 21 G e un ago da 14 G sono stati utilizzati per fare la cannula per il topo e il ratto, rispettivamente.
9. Riempire la siringa con il buffer di perfusione( Tabella 1). Rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa e posizionarla nel terzo piatto in una posizione angolata. Fissalo con nastro adesivo.
   NOTA: per i ratti, è stata utilizzata la soluzione A (Tabella 2) al posto del buffer di perfusione di miociti.
10. Preparare un nodo sciolto con una sutura chirurgica e posizionarlo intorno all'ago.
11. Iniettare il topo con epatina (100 unità USP/mouse) per iniezione intraperitoneale, 20 minuti prima dell'iniezione di anestesia.
12. Far circolare il buffer di perfusione del miocito (Tabella 1) attraverso l'apparato di perfusione. Diminuire la velocità di flusso a 3 mL/min.
    NOTA: per i ratti, è stata utilizzata la soluzione A (Tabella 2) al posto del buffer di perfusione di miociti.
13. Dopo 5 minuti, sostituire il buffer di perfusione con la soluzione enzimatica (Tabella 1). Saturare la soluzione enzimatica con ossigeno durante il processo. Utilizzare una velocità di flusso di 3 mL/min.
    NOTA: per l'isolamento del RAT CM, utilizzare invece la soluzione E (Tabella 2).
14. Anestesizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di anestesia. Utilizzare la dose appropriata di anestesia, raccomandata da IACUC, per la chirurgia terminale.
15. Confermare la profondità sufficiente di anestesia dalla mancanza di una risposta a un pizzico di dito del piedi. Quindi, mettere il mouse sulla piattaforma chirurgica.

2. Estrazione del cuore da topi adulti (e ratti)

1. Sterilizzare la pelle asciugandosi con il 70% di alcol.
2. Aprire con attenzione il petto.
3. Accise il cuore. Evitare tessuti non cardiaci durante l'escissione.
4. Mettere il cuore sul primo piatto, riempito con tampone perfusione (Tabella 1).
   NOTA: utilizzare la soluzione A per il ratto (Tabella 2).
5. Cancellare il sangue dal cuore spremendo delicatamente.
6. Trasferire il cuore al secondo piatto.
7. Pulire il sangue dal cuore e rimuovere i tessuti non cardiaci. Successivamente, trasferire il cuore al terzo piatto.
8. Tagliare i polmoni e altri tessuti circostanti e puònulate tramite l'aorta ascendente. Questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile (<5 min) per migliorare la qualità e la quantità di CM.

3. Digestione del cuore

1. Digestione del cuore del topo
   NOTA: Tutte le soluzioni/buffer che circolano attraverso il cuore del topo devono essere ossigenate durante tutta la procedura.
   1. Rimuovere con cura l'ago cannulante dalla siringa e collegarlo all'apparato di perfusione Langendorff.
   2. Evitare eventuali bolle d'aria che vanno nel cuore, che possono influenzare il flusso-through della soluzione enzimatica e la digestione.
   3. Spostare la giacca d'acqua verso l'alto per fornire un ambiente omogeneo al cuore. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisca attraverso il cuore ad una velocità di 2-3 mL/min.
      NOTA: la velocità della soluzione di passaggio è fondamentale e ha un impatto significativo sul risultato della quantità e della qualità CM.
   4. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisci attraverso il cuore per 2 minuti.
   5. A 2 minuti, aggiungete 40 soluzione CaCl₂ di 100 M alla soluzione ematica e mescolate. Lasciare che la soluzione enzimatica passi attraverso il cuore per altri 10-15 min.
      NOTA: Una volta che il flusso diventa liscio, il cuore diventa brunastro e morbido, indicando la distribuzione uniforme dell'enzima collagenasi e la corretta digestione del cuore.
2. Digestione del cuore di ratto
   NOTA: Tutte le soluzioni/buffer che circolano attraverso il cuore del ratto devono essere ossigenate durante tutta la procedura.
   1. Rimuovere con cura l'ago cannulante dalla siringa e collegarlo all'apparato di perfusione Langendorff.
   2. Evitare eventuali bolle d'aria che vanno nel cuore, che possono influenzare il flusso-through della soluzione enzimatica e la digestione.
   3. Spostare la giacca d'acqua verso l'alto per fornire un ambiente omogeneo al cuore.
   4. Avviare il flusso della soluzione A ad una velocità di 2-3 mL/min per 3-5 min per rimuovere il sangue dal cuore.
      NOTA: la velocità della soluzione di passaggio è fondamentale e ha un impatto significativo sul risultato della qualità CM.
   5. Una volta che il sangue viene eliminato dal cuore, passare dalla soluzione A alla soluzione E (Tabella 2). Soluzione di titrate E con CaCl₂ come indicato di seguito per una concentrazione finale di 0,1 mM nella soluzione:
      1. Dopo 10 minuti di perfusione, aggiungere 12,5 L di 0,1 M CaCl₂.
      2. Dopo 15 minuti di perfusione, aggiungere 25 L di 0,1 M CaCl₂.
   6. Lasciare che la soluzione enzimatica passi attraverso il cuore per altri 30-40 min, fino a quando il flusso diventa rapido e il cuore è flessibile.

4. Preparazione della sospensione CM a cella singola

1. Preparazione della sospensione CM a cella singola (topo)
   1. Rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Di Langendorff. Spostarlo in un piatto Petri da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione enzimatica e trasferire il piatto in una cappa di biosicuzione.
      NOTA: Assicurarsi una digestione cardiaca sufficiente prima di rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Langendorff. Il tempo di digestione dipende dall'attività enzimatica, dal flusso della soluzione e dalle dimensioni del cuore.
   2. Eseguire qualsiasi ulteriore disaggregazione meccanica in una cappa di biosicuzione per garantire la sterilità ed evitare la contaminazione.
   3. Rimuovere con cura gli atri (1/4^{th della} porzione di cuore basale) e tessuti grassi extra.
   4. Tritare il cuore con le bende in pezzi fini.
   5. Prendere una pipetta Pasteur sterile e tagliare la punta ad un angolo di 45o.
   6. Utilizzare questa pipetta Pasteur per erogare il tessuto cardiaco in una sospensione a un solo cellula mediante pipetta dolce. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti uni cellula.Optimal digestion provides a suspension of single-cell cardiomiocytes.
      NOTA: Rimuovere la parte inferiore stretta del tubo di trasferimento per ridurre i danni da CM dovuti alla bruciatura meccanica.
   7. Quindi, aggiungere 5 mL di soluzione di arresto per fermare l'attività enzimatica, che evita la possibilità di overdigestion.
   8. Prendere un fresco conico da 50 mL e posizionarci un colino sterile da 100 m per cellule.
   9. Passare la sospensione cardiomiocato attraverso il colino cellulare per rimuovere il pezzo di tessuto. Lavare il piatto Petri e il colino con altri 5 mL di soluzione di arresto(tabella 1) per raccogliere eventuali cardiomiociti che rimangono attaccati al colino.
2. Preparazione della sospensione CM a cella singola (rat)
   1. Rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Di Langendorff. Spostare il cuore in un piatto Petri da 100 mm riempito con 5 mL di soluzione A e spostare il piatto in una cappa biosicurie.
      NOTA: Assicurarsi una digestione cardiaca sufficiente prima di rimuovere il cuore dal sistema di perfusione Langendorff. Il tempo di digestione dipende dall'attività enzimatica, dal flusso della soluzione e dalle dimensioni del cuore.
   2. Eseguire qualsiasi ulteriore disaggregazione meccanica in una cappa di biosicuzione per garantire la sterilità ed evitare la contaminazione.
   3. Rimuovere con cura gli atri (1/4 della porzione di cuore basale) e i tessuti grassi extra.
   4. Tritare il cuore con le bende in pezzi fini.
   5. Prendere una pipetta Pasteur sterile e tagliare la punta ad un angolo di 45o.
   6. Utilizzare questa pipetta Pasteur per erogare il tessuto cardiaco in sospensione a unimo mediante pipetta dolce. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti uni cellula.Optimal digestion provides a suspension of single-cell cardiomiocytes.
      NOTA: Rimuovere la parte inferiore stretta del tubo di trasferimento per ridurre i danni da CM dovuti alla bruciatura meccanica.
   7. Aggiungere 5 mL della soluzione B (Tabella 2) alla sospensione CM e passare la soluzione attraverso un colino a cellule da 100 m per rimuovere eventuali pezzi di grasso rimanenti o altri tessuti non digeriti.
   8. Raccogliere il filtrato in una fresca fiala conica da 50 mL.
   9. Utilizzare altri 5 mL di soluzione B per lavare il piatto Petri e qualsiasi CM rimanente attraverso il colino cellulare.

5. Rimozione di non CPM

1. Rimozione di non CCI dalla sospensione per uni cellulare per adulti (topo)
   1. Centrifugare la sospensione della cella a 20 x g per 3 min.
   2. Eliminare il supernata e risundere le celle in 10 mL della soluzione di arresto (Tabella 1).
      NOTA: Aumentare la concentrazione di BSA nella soluzione stop aumenterà la sua viscosità e ridurrà il tasso di sedimentazione dei non-CM.
   3. Riesponire i CM per leggera inversione del tubo 3-5 volte.
   4. A intervalli di 3 minuti, aggiungere 10 gradi di 100 M CaCl_{2 e} mescolare. Ripetere tre volte.
   5. Dopo la quarta aggiunta, centrifugare la sospensione cardiomiocato a 20 x g per 3 min.
   6. Scarta il supernatant.
   7. Rispendere le CCI in pre-riscaldato (37 oC), il supporto di placcatura CM per topi adulti(Tabella 3).
2. Rimozione di non PM dalle sospensioni monotono per adulti (rat)
   1. Cellule di pellet a 20 x g per 3 min a 25 oC.
   2. Eliminare il supernante e rispendere le cellule in 25 mL della soluzione B(Tabella 2).
   3. Mescolare le cellule per inversione delicata e posizionarlo in un supporto tubo per consentire al CM di stabilirsi sotto gravità.
   4. Scartare con cura il supernatant.
   5. Risundere le cellule in 25 mL fresche della soluzione B e a 1,0 mM CaCl₂ con l'aggiunta graduale di 50 l, 75 l, e 100 l di 0,1 M CaCl₂ a intervalli di 3-5 minuti.
      NOTA: In questa fase potrebbe essere utilizzata una maggiore concentrazione di BSA nella soluzione B. Aumentando la concentrazione di BSA nella soluzione B aumenta la viscosità e, quindi, riduce il tasso di sedimentazione dei non-CM.
   6. Cellule di pellet a 20 x g per 3 min a 25 oC, aspirare il supernante e aggiungere il volume desiderato di supporti di coltura delle cellule di ratto adulto (Tabella 4).
   7. Seme di MM su una piastra rivestita di laminina.
      NOTA: La pre-placcatura dei PM su una piastra di coltura non rivestita può essere utilizzata per ridurre al minimo la contaminazione delle cellule non CM.

6. Placcatura CM per adulti

1. Pre-placcating
   1. Rispendere i cardiomiociti nei media di coltura.
   2. Pre-piastra le cellule in un piatto di 60 mm o 100 mm per topo o ratto CM, rispettivamente.
   3. Incubare i VM per 2 h in un'incubatrice integrata con il 5% di CO₂ a 37 oC.
   4. Durante l'incubazione pre-piastra, rivestire le piastre di coltura cellulare con laminina (10 g/mL in PBS) per la coltura CM a lungo termine.
2. Dopo 2 h di pre-placcatura, raccogliere i CM in una fiala conica da 50 mL.
3. Raccogliere le cellule dal piatto e ri-plate in un laminin rivestito 24 piastra di coltura bene per esperimenti di trasfezione.
4. Cellule di coltura in un incubatore a 37 oC integrato con 5% con CO₂. 4-6 ore è sufficiente per aderire ai cardiomiociti con la superficie, e quindi, la trasfezione può essere eseguita 6 ore dopo la placcatura.
   NOTA: Il mezzo di placcatura contenente FBS è comunemente usato e mostra una migliore compatibilità con gli studi di proliferazione. Tuttavia, un mezzo privo di siero può essere utilizzato per esperimenti in cui vengono analizzati fattori secretori.

7. Trasfezione

1. Incubare i PM alle piastre di coltura cellulare rivestite con laminina per 4-6 ore.
2. Quattro ore dopo la semina CM sulla piastra rivestita di laminina, le cellule trasfect con siRNA (50 nM) di interesse utilizzando un reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamine RNAiMAX) secondo il protocollo del produttore.
3. Cambiare i media 24 ore dopo la trasfezione e ogni 24 ore dopo per un massimo di 20 giorni.
4. Dopo 20 giorni, fissare le cellule con 4% PFA in PBS per applicazioni a valle, tra cui l'immunocitochimica per marcatori cardiaci specifici come Troponin per garantire cardiomiociti vivi sono stati ri culturezzati con successo a lungo termine.

Risultati

L'attuale protocollo modificato consente un isolamento efficiente e la coltura di RAT e topi in vitro. Per l'isolamento del ratto CM, nella procedura sono stati utilizzati 3 ratti Fischer di sesso maschile adulto (12 settimane). Figura 1 mostra l'apparato chirurgico e le configurazioni di isolamento che sono necessari nella procedura; ogni parte è stata contrassegnata e descritta nella legenda della figura. Collagenase tipo 2 è stato utilizzato per la digestione, che produce un'elevata qua...

Discussione

C'è una necessità fondamentale di stabilire un protocollo per l'isolamento dei cardiomiocisti adulti e la coltura a lungo termine per eseguire studi meccanicistici specifici delle cellule. Ci sono solo pochi rapporti che parlano di protocolli di isolamento CM adulti, e ancora meno di loro sono utilizzati per la coltura a lungo termine di topi adulti CM^15,16,17. È stato dimostrato che il ratto adulto CM ha una maggiore tollera...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S