Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

Riepilogo

Questo documento riporta che l'aggiunta di Y-27632 al mezzo TIVA può aumentare significativamente la resa dei melanociti dai tessuti della pelle adulti.

Abstract

L'isolamento e la coltura dei melanociti primari dai tessuti della pelle è molto importante per la ricerca biologica ed è stato ampiamente utilizzato per applicazioni cliniche. Isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle con il metodo convenzionale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per passare sufficientemente. Ancora più importante, i tessuti utilizzati sono di solito pregeniti ed è ancora una sfida per isolare in modo efficiente i melanociti primari dai tessuti adulti. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo di isolamento per i melanociti che aggiunge Y-27632, un inibitore della chinasi del Rho, al mezzo di coltura iniziale per 48 h. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo metodo aumenta drasticamente la resa dei melanociti e riduce il tempo necessario per isolare i melanociti dai tessuti di prepuzio. Ora descriviamo questo nuovo metodo in modo più dettagliato usando l'epidermide adulta per coltivare in modo efficiente i melanociti primari. È importante sottolineare che i melanociti ottenuti da tessuti adulti preparati da questo nuovo metodo possono funzionare normalmente. Questo nuovo protocollo beneficerà in modo significativo gli studi di difetti di pigmentazione e melanomi utilizzando melanociti primari preparati da tessuti della pelle adulta facilmente accessibili.

Introduzione

L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i melanociti dall'epidermide della pelle adulta per la ricerca biologica e le applicazioni cliniche. I melanociti, che si trovano nell'epidermide basale della pelle e nei follicoli piliferi, svolgono un ruolo importante nella pigmentazione della pelle e dei capelli producendo melanina¹. La pigmentazione cutanea risultante dai melanociti epidermici agisce come un filtro di radiazione ultravioletta che riduce/previene il danno del DNA alle cellule sottostanti nella pelle². La proliferazione anormale dei melanociti nella pelle è abbastanza comune, come nella formazione di nevi (talpe) benigni in cui i melanociti potenzialmente si trasformano in crescita oncogenica seguita dalla senescenza cellulare^{3 .}

Dal 1957, l'isolamento e la successiva cultura dei melanociti primari umani è stato possibile⁴, ma solo dal 1982 c'è stato un metodo efficiente che può riprodurre in modo riproducibile le culture dei melanociti umani dall'epidermide⁵. Il metodo convenzionale per isolare i melanociti primari dall'epidermide comporta una digestione enzimatica in due fasi. In breve, la pelle viene inizialmente digerita con dispasi per separare l'epidermide dal derma, dopo di che l'epidermide viene digerita con la trypsin per produrre sospensioni contenenti melanociti e cheratinociti, che possono quindi essere coltivati selettivamente in diversi supporti. Attualmente, la cultura iniziale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per i melanociti per raggiungere la confluenza utilizzando il metodo convenzionale, che è probabilmente dovuto alla bassa efficienza del loro isolamento. Pertanto, aumentare la produzione iniziale di melanociti dai tessuti della pelle adulti sarebbe molto utile sia per la ricerca di laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Molti fattori di crescita, la maggior parte dei quali hanno dimostrato di essere secreti da cheratinociti (ad esempio, z-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)^5-8, regolano la differenziazione e la proliferazione dei melanociti dei mammiferi. In assenza di strati di alimentatore, la mancanza di questi fattori di crescita porta alla diminuzione della proliferazione dei melanociti e alla loro aumento dell'apoptosi⁹. La co-coltura dei cheratinociti come cellule nutritrici e melanociti potrebbe portare ad accelerare la proliferazione del melanocito e a ridurre l'apoptosi. Tuttavia, il metodo di co-cultura non solo richiede più tessuti della pelle per preparare i cheratinociti, che non è pratico, ma potrebbe anche non funzionare in modo efficiente perché le condizioni di coltura richieste dai melanociti non favoriscono la crescita dei cheratinociti e viceversa.

Studi precedenti hanno riferito che l'aggiunta di Y-27632, un inibitore rock, nel mezzo di crescita può migliorare la resa delle cellule epidermiche primarie umane dai tessuti della pelle^10-14. Pertanto, sarebbe interessante verificare se l'isolamento dei melanociti primari umani trarrebbe beneficio dalla presenza di Y-27632. Infatti, l'aggiunta di Y-27632 nell'inoculazione TIVA medium¹⁵, che contiene TPA, IBMX, Na₃VO₄ e dbcAMP, ha aumentato significativamente la resa dei melanociti primari isolati dai tessuti del prepuzio¹⁶. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo protocollo è significativamente più efficiente nell'aumentare la resa dei melanociti¹⁶. Pertanto, questo protocollo descrive in dettaglio il nuovo metodo utilizzando tessuti per la pelle adulti basati su uno studio precedente¹⁶ al fine di promuovere la sua applicazione nella ricerca biologica di base e applicata.

Protocollo

L'uso dei tessuti adulti del prepuzio in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana (No.2015120401, data: 12 maggio 2015).

NOTA: Eseguire tutte le procedure seguenti in un ambiente sterile per evitare contaminazioni di cellule e colture.

1. Preparativi

1. Raccogliere tessuti di prepuzio adulti freschi da interventi chirurgici di circoncisione in tubi da 15 mL contenenti 10 mL di salina buffer fosfato (PBS) e conservarli in 4 gradi centigradi.
   NOTA: Separare i tessuti come descritto di seguito entro 24 h dopo l'escissione.
2. Preparare reagenti e mezzi di coltura.
   1. Preparare il 3% p/S (penicillina/streptomycin) come soluzione di lavaggio. Mescolare 50 mL di PBS con 1,5 mL di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 mg/L) (P/S).
   2. Preparare la soluzione di terminazione (soluzione di neutralizzazione) per la neutralizzazione della digestione enzymatica. Supplemento 1% P/S, 10% siero bovino fetale (FBS) in mezzo DMEM.
   3. Preparare i melanociti medi alla cultura TIVA: la F12 di Ham; 10% FBS; 1x P,S-glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA); 1 x 10^-4 M 3-isobutyl-1-metil xanthine (IBMX); 1 - M Na₃VO₄; 1 x 10^-3 M N-6,2'-O-dibutyryladenosine-3,5'-cofofottofa (dbcAMP).

2. Il metodo convenzionale

1. Pretrattamento dei tessuti cutanei
   1. Sciacquare ogni tessuto prepuzio adulto una volta con 10 mL di 75% di etanolo (alcool) per 30 s, quindi risciacquare due volte con 10 mL di soluzione di lavaggio (3% P/S), per 5 min ciascuno.
      NOTA: Lavare i tessuti del prepuzio con 10 mL di PBS all'inizio se c'è molto sangue. Tutti i lavatori sono preparati in 100 mm piatti di coltura cellulare.
   2. Raschiare ogni tessuto del prepuzio con una lama chirurgica per rimuovere i tessuti adiposi sottocutanei e i tessuti connettivi sciolti nella copertura di un piatto di coltura cellulare da 100 mm.
      NOTA: Utilizzare un bisturi per raschiare via gli strati di grasso fino a quando rimangono solo l'epidermide sottile e il denso derma.
   3. Trasferire ogni prepuzio adulto in un altro piatto di coltura 100 mm con il derma verso il basso.
      NOTA: Tagliare ogni tessuto prepuzio adulto in strisce larghe 3-4 mm utilizzando una lama del bisturi per rendere il lavoro dispase più efficiente.
   4. Aggiungere 2,5 mg/mL di dispase ad ogni piatto di coltura da 100 mm con tessuti adulti di prepuzio e incubare per 16-20 h a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Ogni grammo di tessuto viene digerito con 10 mL di soluzione dispasi.
2. Separazione dell'epidermide dal tessuto prepuzio adulto
   1. Dopo la digestione per 16-20 h, separare l'epidermide dal derma utilizzando una pinzetta. Afferrare un lato del bordo dermico del tessuto con una pinzetta e la posizione corrispondente della parte epidermica con un'altra pinzetta e staccare delicatamente l'epidermide.
   2. Lavare l'epidermide 3x con la soluzione di lavaggio (3% P/S), quindi trasferire l'epidermide in un tubo.
   3. Immergere l'epidermide aggiungendo 5 mL di 0,05% di trypsin nel tubo e incubare in un bagno d'acqua per 30 min a 37 .
      NOTA: Agitare il tubo per assicurarsi che l'epidermide sia completamente sommersa prima dell'incubazione.
3. Raccolta e coltura di cellule primarie
   1. Aggiungere un volume uguale di soluzione di terminazione (10% FBS, 1% P/S in DMEM) per neutralizzare la trippsina e pipetta la soluzione su e giù 10-15 volte per separare le cellule epidermiche.
   2. Passare la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 50 mL attraverso un filtro a rete da 100 m per rimuovere i detriti.
   3. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
   4. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di inoculazione TIVA medio per riutilizzare le cellule.
   5. Semina le cellule risospese in un piatto di coltura di 100 mm.
   6. Cultura in un incubatore a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂.
   7. Cambiare il mezzo ogni 2 giorni.
   8. Passare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza.

3. Il nuovo metodo

NOTA: La procedura per la preparazione e la digestione dei tessuti nel nuovo metodo è la stessa descritta in precedenza per il metodo convenzionale, l'unica differenza è che le celle fresche isolate vengono risospese in 10 mL del supporto TIVA contenente 10 - M Y-27632.

1. Due giorni dopo la seeding, sostituire il supporto con il normale supporto TIVA senza Y-27632. Dopo di che, le condizioni di coltura sono le stesse tra i metodi nuovi e convenzionali.

4. Cellula che passa

1. Rimuovere il supporto TIVA e sciacquare due volte ogni piatto di coltura con PBS.
2. Aggiungere 2 mL di 0,05% di trypsin per piatto di coltura cellulare da 100 mm.
   NOTA: Agitare il piatto per garantire un adeguato contatto tra gli enzimi digestivi e il fondo del piatto.
3. Digerire in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 2 min.
4. Utilizzare un microscopio per controllare le cellule e assicurarsi che la maggior parte delle cellule si sia dissociata dal piatto di coltura cellulare.
   NOTA: Toccare delicatamente il piatto per rilasciare le celle per arrotondare e galleggiare nella soluzione. Prolungare il tempo di digestione se la maggior parte delle cellule non ha sospeso dopo la maschiatura, ma non più di 5 min in più.
5. Trasferire i melanociti in un tubo da 15 mL dopo aver neutralizzato l'attività della trypsin aggiungendo 2 mL di soluzione di terminazione. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
6. Risospendere ogni pellet cellulare con 10 mL di TIVA medio dopo aver rimosso lentamente il supernatante, e quindi contare il numero di melanociti.
7. Piatto di circa 1 x 10⁶ melanociti in 10 mL di TIVA medio per 100 mm cell coltura piatto.
8. Rinnovare il mezzo di coltura cellulare ogni 48 h.

Risultati

Nella figura 1 viene illustrato un diagramma schematico che confronta i metodi convenzionali e quelli nuovi. La procedura per la preparazione e la digestione dei tessuti con il nuovo metodo è la stessa della procedura per il metodo convenzionale, l'unica differenza è che le cellule isolate vengono risospese in 10 mL di mezzo TIVA in presenza di 10 -M Y-27632. Due giorni dopo la seeding, sostituire il supporto con il normale supporto TIVA senza Y-27632. Il metodo convenzionale di isolare i ...

Discussione

Il protocollo qui descritto si basava su una recente pubblicazione¹⁶. Occorre prestare attenzione ai seguenti passi critici per ottenere i migliori risultati con il nuovo metodo. In primo luogo, una separazione di successo dell'epidermide e del dermide è fondamentale. Tagliare i tessuti adulti di prepuzio in strisce larghe 3-4 mm utilizzando una lama del bisturi per rendere il dispase lavorare più a fondo e facilmente per separare l'epidermide dal derma. In secondo luogo, quando si separano ques...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation