Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Resumen

Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.

Resumen

Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.

Introducción

Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos¹. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a la misma célula) y trans- (ligando unido a la célula vecina)². Además, los GAG también desempeñan funciones críticas como elementos estructurales en tejidos como la membrana basal glomerular^3,el glicocáliz endotelial vascular⁴ y el glicocáliz epitelial pulmonar^5,y en tejidos conectivos como el cartílago^6.

La longitud de las cadenas de polisacáridos GAG varía sustancialmente según su contexto biológico y puede ser dinámicamente alargada, escindida y modificada por un sistema regulador enzimático altamente complejo⁷. Es importante destacar que la longitud de las cadenas de polímeros GAG contribuye sustancialmente a su afinidad de unión por los ligandos y, posteriormente, a su función biológica^8,9. Por esta razón, la determinación de la función de un GAG endógeno requiere la apreciación de su tamaño. Desafortunadamente, a diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, existen muy pocas técnicas fácilmente disponibles para detectar y medir los GAG, lo que históricamente ha resultado en una investigación relativamente limitada sobre los roles biológicos de esta diversa familia de polisacáridos.

Este artículo describe cómo aislar y purificar los GAG de la mayoría de los tejidos biológicos y, también, describe cómo usar la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para evaluar la longitud de los polímeros aislados con un buen grado de especificidad. A diferencia de otros enfoques glucómicos altamente complejos (y a menudo basados en espectrometría de masas), este método se puede emplear utilizando equipos y técnicas de laboratorio estándar. Este enfoque práctico puede, por lo tanto, ampliar la capacidad de los investigadores para determinar el papel biológico de los GAG nativos y su interacción con ligandos contextualmente importantes.

Protocolo

Todas las muestras biológicas analizadas en este protocolo se obtuvieron de ratones, bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado.

1. Aislamiento de sulfato de heparán

1. Delipidación de muestras de tejido
   NOTA: La delipidación es un paso opcional para los tejidos ricos en grasa.
   1. Haga una mezcla 1:1 de metanol y diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por muestra; las piezas más grandes de tejido pueden requerir hasta 1 ml.
   2. Coloque cada muestra de tejido en un recipiente de vidrio pequeño con una tapa para la delipidación.
      NOTA: La masa de la muestra puede variar según el tejido de interés y las necesidades experimentales. 50 mg o menos suele ser suficiente para un rendimiento GAG adecuado, pero el usuario final puede requerir cierta optimización.
   3. Añadir 500 μL de la solución de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidrio y mezclar. Asegúrese de que todas las muestras de tejido sólido estén completamente sumergidas en disolvente.
      NOTA: Use pipetas serológicas o tubos cónicos de plástico para mezclar y manipular la solución de metanol/diclorometano; otros plásticos pueden disolverse.
   4. Coloque las muestras en un agitador (en un estante seguro) en una campana de humos químicos y agite suavemente durante 1 h.
   5. Agitar las muestras para mezclar y centrifugar a 17.000 x g durante 5 min a 4 °C.
   6. Pipetee cuidadosamente la fracción de disolvente orgánico (sobrenadante). Esta es la fracción lipídica: no contiene GAG y se puede descartar.
      NOTA: Trate de no perturbar el tejido, ya que se podrían perder piezas pequeñas. Es preferible dejar parte de la capa orgánica en el recipiente de la muestra, en lugar de arriesgarse a la pérdida de la muestra.
   7. Deje la tapa del recipiente de vidrio abierta y deje que se evapore durante la noche en la campana. Cambie el tubo para el siguiente paso, ya que esos tubos no sobrevivirán al procesamiento posterior.
   8. Una vez que la mezcla de disolvente se haya evaporado por completo, proceda a la desintegración mecánica (si la muestra residual es >50 mg) o a la digestión de actinasa E (< 50 mg).
2. Desintegración mecánica de tejido sólido (opcional; para muestras de tejido más grandes)
   NOTA: La mayoría de las piezas más pequeñas de tejido sólido (aproximadamente 50 mg o menos) deben disolverse completamente durante la etapa de digestión. Sin embargo, las muestras más grandes requerirán desintegración mecánica.
   1. Congelación rápida de muestras de interés colocándolas en un tubo de polipropileno de tamaño adecuado y colocando el tubo cerrado en nitrógeno líquido. Deje que la muestra se congele hasta que esté completamente sólida.
   2. Usando un mortero y un mortero limpios, muele las muestras congeladas en una consistencia similar al polvo.
   3. Proceda directamente a la digestión de la Actinasa E (Paso 1.4).
3. Desalúdrico y concentración de muestras
   NOTA: Este es un paso opcional y solo se requiere para muestras de tejido líquido diluido (por ejemplo, líquido de lavado broncoal-alveolar (BALF) o plasma).
   1. Agrupar muestras líquidas en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por replicación biológica o grupo experimental)
   2. Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.
   3. Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
   4. Lave cada columna 3x con 400 μL de agua desionizada y filtrada. Descarta el flujo a través.
   5. Invierta el filtro y gire durante 1 minuto a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
4. Digestión de actinasa E
   NOTA: Este paso es necesario para digerir y, en última instancia, eliminar los contaminantes de proteínas de su muestra.
   1. Mezclar muestras 1:1 con actinasa E recombinante a una concentración deseada de 10 mg/ml. Agregue el volumen apropiado de concentrado tampón de digestión 10x. Concentración final deseada: 0,005 M de acetato de calcio y 0,01 M de acetato de sodio, pH 7,5. Por ejemplo: 190 μL de muestra líquida, 190 μL de 20 mg/ml de actinasa E, 20 μL de acetato de calcio de 0,05 M, acetato de sodio de 0,1 M.
   2. Agitar las muestras suavemente para mezclar, luego digerir durante 48-72 h a 55 °C (hasta 7 días para el tejido entero).
   3. Calentar a 80 °C durante 15-20 min para calentar inactivar la Actinasa E.
   4. Congele la muestra a -80 °C o continúe con el paso 1.5.
5. Desalúdrico y concentración de muestras
   NOTA: Si se anticipa una masa baja del GAG de interés en la muestra biológica, o si es deseable la conservación de reactivos consumibles (es decir, columnas de filtro centrífugo), las muestras se pueden agrupar para producir un solo concentrado por grupo experimental (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).
   1. Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
   2. Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
   3. Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.
   4. Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados (generalmente incluidos con las columnas del filtro centrífugo). Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
6. Desecación
   1. Coloque las muestras disueltas del paso 1.5.5 en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice las muestras como se detalla a continuación.
   2. Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.
   3. Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.
   4. Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos -40 °C, 0,135 Torr)
7. Columna de intercambio catiónico
   1. Resusped muestras desecadas en hasta 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2% (o, si se agrupan muestras, resuspend a un máximo de (400/n) μL, donde n = el número de muestras en la piscina deseada. Use la menor parte posible de la solución detergente.
   2. Equilibrar la columna de intercambio catiónico (IEX) con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   3. Cargue 400 μL de muestras/muestras agrupadas en la columna IEX. Girar durante 5 min a 2.000 x g.
   4. Lavar 3x con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada vez.
   5. Elute 3x con 400 μL de 0,2 M NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta es la fracción de baja afinidad, que se puede conservar para fines de control de calidad si se desea.
   6. Elute 3x con 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta fracción contendrá los glicosaminoglicanos aislados de interés, ¡guárdalo todo!
   7. Para desamar cada fracción eluida, agregue metanol hasta 80 vol% e incube a 4 ° C durante la noche. Girar cada muestra durante 5 min a 2.000 x g. Recupere el residuo sólido ya que este es glicosaminoglicano dessalado seco.
      NOTA: Alternativamente, omita este paso y continúe con el paso 1.8 para desatano el eluida sin metanol.
8. Desalúdrico y concentración de muestras
   1. Si es necesario, agrupar las fracciones eluidas (a partir de 1.7.6) en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).
   2. Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
   3. Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
   4. Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarte el flujo a través. Continúe directamente con el paso 1.9.
9. Digestión de la condroitina
   NOTA: El propósito de este paso es eliminar los GAG que no son de interés para el usuario final. En este caso, la condroitinasa se usa para eliminar la condroitina. En los tejidos utilizados para generar Resultados Representativos (líquido de lavado bronco-alveolar y pulmón entero), la digestión del sulfato de condroitina deja sulfato de heparán como el GAG residual primario. Los usuarios finales pueden necesitar agregar pasos de digestión adicionales dependiendo de sus objetivos experimentales.
   1. Cargue 350 μL de tampón de digestión (50 mM de acetato de amonio con 2 mM de cloruro de calcio ajustado a pH 7.0) a la columna del filtro centrífugo sin tocar la membrana.
   2. Añadir 5 μL de condroitinasa ABC recombinante.
   3. Coloque el tubo de muestras en un horno de 37 °C e incube durante 1 h.
   4. Gire la columna y colóquelos en tubos de recolección debidamente etiquetados. Girar durante 1 min a 2000 x g.
   5. Caliente las muestras a 80 °C durante 15-20 min para inactivar la condroitinasa ABC.
10. Desalúdrico y concentración de muestras
    1. Si es necesario, agrupar las muestras de condroitina digeridas del paso 1.9.5 en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental)
    2. Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
    3. Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
    4. Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.
    5. Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
11. Desecación
    NOTA: En este paso, la desecación es necesaria para que las muestras puedan ser resuspendidas en la menor cantidad posible de agua y tampón corriente.
    1. Coloque las muestras digeridas con condroitina del paso 1.10.5 directamente en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice de la siguiente manera:
    2. Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.
    3. Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.
    4. Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos 40 °C, 0,135 Torr)

2. Electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos aislados y purificados

1. Preparar con antelación las soluciones necesarias para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Tabla 1).
   NOTA: Seleccione el porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución dependiendo del tamaño de los glicosaminoglicanos que se espera que estén en la muestra. Se recomienda un 15% para resolver fragmentos más grandes (más de 30 subunidades disacáridos de longitud); 22% para fragmentos más pequeños (<20 subunidades disacáridos de longitud).
2. Coloque el cassette vacío en el tanque PAGE. Fundir el gel resolunte de la siguiente manera: En un tubo de 15 ml, mezcle 10 ml de solución de gel de resolución, 60 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado) y 10 μL de TEMED (agregue TEMED en último lugar). Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use pipeta para agregar rápidamente la solución de 10 ml anterior al cassette. Superponga con 2 ml de agua desionizada y filtrada y permita que el gel de resolución polimerice durante 30 min.
   NOTA: El siguiente protocolo PAGE se ha optimizado para un sistema PAGE vertical que utiliza casetes de fundición de 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo) y 1,0 mm de grosor con un volumen total de aproximadamente 12 ml. Se pueden utilizar otros sistemas de casetes, pero pueden requerir la optimización por parte del usuario final.
3. Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta y funda el gel de apilamiento de la siguiente manera: en un tubo de 15 ml, mezcle 3 ml de la solución de gel de apilamiento, 90 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado), 3 μL de TEMED (agregue TEMED por último).
4. Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado; llenar cassette hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con la configuración. Deje que el gel de apilamiento polimerice durante 30 min.
5. Una vez que el gel se haya polimerizado, asegúrese de que la tira de cinta se retire de la parte inferior del cassette y vuelva a colocar el cassette en el conjunto del tanque PAGE.
6. Llene las cámaras superior e inferior con amortiguador de cámara superior e inferior, respectivamente.
7. Disolver las muestras secas del paso 1.11.4 en el volumen mínimo necesario de agua desionizada y filtrada (como máximo, el 50% del volumen de los pozos en el gel PAGE). Mezclar 1:1 con el búfer de carga de muestras. Cargue las muestras y las "escaleras" de oligosacáridos HS (ver Tabla 1) en el gel.
8. Pre-ejecutar el gel durante 5 min a 100 V. Luego ejecute el gel a 200 V durante 20-25 min (para un gel resoludor de poliacrilamida al 15%).
   NOTA: Puede ser necesaria cierta optimización del tiempo de ejecución de 200 V. El rojo fenol migra por delante de los oligosacáridos de heparina que son 2 subunidades de polímero de longitud (es decir, grado de polimerización 2 o dp2); El azul de bromofenol migra antes que dp10-dp14. Los mejores resultados se obtienen cuando se aplica el voltaje de tal manera que la banda roja de fenol migra casi, pero no del todo, al fondo del gel. Ajuste el tiempo de ejecución en consecuencia.

3. Protocolo de tinción de plata

1. Prepare todas las soluciones necesarias para la tinción de plata con anticipación (Tabla 2).
   NOTA: No toque directamente el gel PAGE hasta que se haya teñido, desarrollado y colocado en solución de parada. En su lugar, manipule el gel con herramientas limpias de plástico o vidrio. El manejo directo del gel dará como resultado distorsiones de huellas dactilares y otros artefactos visibles en el gel después de la tinción.
2. Una vez que se complete la ejecución, desmonte el cassette y extraiga el gel en un recipiente limpio y mediano-grande lleno de agua desionizada y filtrada.
   NOTA: Para evitar manipular directamente el gel, use la punta de la pipeta u otro objeto de plástico para pelar suavemente el gel del cassette mientras está sumergido en agua. El gel puede ser frágil: manipule con cuidado.
   1. Deseche el agua. Manche el gel en solución de tinción azul alciano durante 5 min.
   2. Deseche la mancha azul alcense. Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alciano.
   3. Deje que se desmanche en agua desionizada y filtrada durante la noche en el balancín. Asegúrese de que haya un gran volumen de agua desionizada y filtrada para garantizar que cualquier mancha residual se lave completamente del gel durante la noche.
   4. Gel de lavado en metanol al 50% (40 min en total, solución de cambio 2-3x).
   5. Lavar el gel en agua desionizada y filtrada durante 30 min. Deseche el agua y repita 3 veces más durante un total de 2 h, reemplazando el agua cada vez.
   6. En un recipiente fresco y limpio, manche el gel durante 30 minutos en solución de tinción de nitrato de plata.
   7. Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces en agua desionizada y filtrada para eliminar completamente la solución de tinción de plata.
   8. Lavar durante 30 min en agua desionizada y filtrada. Deseche el agua y repita 2x durante un total de 90 minutos, reemplazando el baño de agua cada vez.
   9. Deseche el agua y agregue la solución en desarrollo.
   10. Una vez que se agrega la solución en desarrollo, observe cuidadosamente el gel y observe la aparición de bandas. Dependiendo de la calidad de la mancha y la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos.
   11. Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lávese brevemente con la solución de parada.
   12. Deseche el lavado de la solución de parada y reemplácelo con una solución de parada fresca. Dejar remojar durante 1 h en un balancín o agitador.
   13. Lavar en agua desionizada y filtrada durante la noche (sin embargo, el gel se puede tomar una imagen inmediatamente después de detener el lavado de la solución).

Resultados

El azul alciano se utiliza para teñir GAGs sulfatados ¹⁰; esta señal se amplifica mediante el uso de una mancha de plata posterior ¹¹. La Figura 1 proporciona una demostración visual del proceso de desarrollo de tinción de plata. Como se demostró, la señal azul alcense que representa los GAG separados por electroforesis se amplifica a medida que el agente en desarrollo penetra en el gel de poliacrilamida. Por lo general, el proceso de des...

Discusión

Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG ^8,9,14. Por esta razón, es importante que los investig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable