Controlli dell'antigene sintetico per l'immunoistochimica

Riepilogo

Questo lavoro documenta un metodo semplice per creare controlli di antigeni sintetici per l'immunoistochimica. La tecnica è adattabile a una varietà di antigeni in una vasta gamma di concentrazioni. I campioni forniscono un riferimento con cui valutare le prestazioni e la riproducibilità intra e inter-test.

Abstract

I saggi di immunoistochimica (IHC) forniscono preziose informazioni sui modelli di espressione proteica, la cui interpretazione affidabile richiede campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. Poiché non sono sempre disponibili controlli appropriati per tessuti o linee cellulari, un metodo semplice per creare controlli IHC sintetici può essere utile. Tale metodo è descritto qui. È adattabile a vari tipi di antigene, tra cui proteine, peptidi o oligonucleotidi, in una vasta gamma di concentrazioni. Questo protocollo spiega i passaggi necessari per creare controlli dell'antigene sintetico, utilizzando come esempio un peptide dal dominio intracellulare (ICD) dell'oncogene eritroblastico umano B2 (ERBB2/HER2) riconosciuto da una varietà di anticorpi diagnosticamente rilevanti. Le diluizioni seriali del peptide HER2 ICD in soluzione di albumina sierica bovina (BSA) vengono miscelate con formaldeide e riscaldate per 10 minuti a 85 °C per solidificare e reticolare la miscela peptide/BSA. Il gel risultante può essere lavorato, sezionato e colorato come un tessuto, producendo una serie di campioni di concentrazioni di antigene note che coprono una vasta gamma di intensità di colorazione.

Questo semplice protocollo è coerente con le procedure di laboratorio di istologia di routine. Il metodo richiede solo che l'utente abbia una quantità sufficiente dell'antigene desiderato. Proteine ricombinanti, domini proteici o peptidi lineari che codificano epitopi rilevanti possono essere sintetizzati localmente o commercialmente. I laboratori che generano anticorpi interni possono riservare aliquote dell'antigene immunizzante come bersaglio di controllo sintetico. L'opportunità di creare controlli positivi ben definiti su una vasta gamma di concentrazioni consente agli utenti di valutare le prestazioni dei test intra e interlaboratorio, ottenere informazioni sulla gamma dinamica e la linearità dei loro saggi e ottimizzare le condizioni di analisi per i loro particolari obiettivi sperimentali.

Introduzione

L'immunoistochimica (IHC) consente il rilevamento sensibile e specifico, spazialmente preciso di antigeni bersaglio in sezioni di tessuto fissate in formalina, incorporate in paraffina (FFPE). Tuttavia, i risultati della colorazione IHC possono essere influenzati da più variabili, tra cui il tempo di ischemia calda e fredda, la fissazione dei tessuti, il pretrattamento dei tessuti, la reattività e la concentrazione degli anticorpi, la chimica di rilevamento del saggio e i tempi di reazione¹. Di conseguenza, le prestazioni riproducibili e l'interpretazione delle reazioni IHC richiedono un controllo rigoroso di queste variabili e l'uso di campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. I controlli frequentemente utilizzati includono tessuti incorporati in paraffina o linee cellulari in coltura conosciute da analisi indipendenti per esprimere l'antigene di interesse, ma tali campioni non sono sempre disponibili¹. Inoltre, i livelli di espressione degli antigeni bersaglio nei tessuti e nei controlli delle linee cellulari sono generalmente compresi solo qualitativamente e possono essere variabili. I controlli contenenti concentrazioni riproducibili e note con precisione dell'antigene bersaglio possono aiutare nell'ottimizzazione delle condizioni di reazione IHC. Un metodo generale, adattabile a una varietà di tipi di antigene in un intervallo fisiologicamente rilevante di concentrazioni per creare campioni sintetici di controllo IHC, è stato descritto dagli autori². Un protocollo dettagliato è fornito qui per la creazione e l'uso di questo tipo di standard.

Controlli appropriati sono essenziali per la valida interpretazione dei saggi IHC ^1,3,4. Tessuti, cellule coltivate e substrati rivestiti di peptidi sono stati impiegati come controlli IHC in base alle esigenze specifiche dei ricercatori. I vantaggi e le limitazioni inerenti all'uso dei tessuti come controlli IHC sono stati ampiamente discussi ^1,4. Per molti anticorpi, è possibile scegliere controlli appropriati tra tessuti normali selezionati contenenti popolazioni cellulari che esprimono l'antigene bersaglio in un ampio intervallo dinamico. I controlli tissutali sono meno adatti quando l'antigene bersaglio non è ben caratterizzato per quanto riguarda il sito di espressione o l'abbondanza, o quando gli antigeni potenzialmente a reazione incrociata sono co-espressi nelle stesse cellule o siti tissutali. In questi contesti, blocchi di linee cellulari in coltura che esprimono l'antigene di interesse possono essere utili. Per fornire ulteriori prove della specificità del bersaglio, le linee cellulari possono essere progettate per sovra-o sotto-esprimere antigeni bersaglio. Ad esempio, tale approccio è stato recentemente utilizzato per valutare una varietà di saggi anti-PD-L1 utilizzando un microarray tissutale di linee cellulari isogeniche che esprimono una gamma di antigene PD-L1⁵. Le limitazioni pratiche all'uso di routine dei blocchi di linee cellulari includono il costo e il tempo necessari per produrre un numero di cellule sufficiente e il fatto che l'espressione di alcuni antigeni potrebbe non essere coerente in modo affidabile, anche all'interno delle linee cellulari clonali⁶. I peptidi sintetici sono una terza opzione per i controlli IHC per gli anticorpi che riconoscono gli epitopi lineari corti. Steven Bogen e colleghi hanno pubblicato ampiamente sull'uso di peptidi accoppiati alla superficie di vetrini ^7,8 e perle di vetro⁹. Uno studio di questo gruppo ha dimostrato che l'analisi quantitativa dei controlli IHC basati su peptidi potrebbe rilevare la variazione del processo di colorazione mancata dalla valutazione qualitativa dei controlli tissutali analizzati in parallelo¹⁰. Mentre gli standard che utilizzano antigeni basati su perline potrebbero essere ampiamente applicabili, molti dettagli sono proprietari degli autori, limitando l'adozione diffusa.

Un altro approccio agli standard IHC incorpora antigeni bersaglio in gel proteici creati artificialmente. Questo concetto è stato dimostrato per la prima volta da Per Brandtzaeg nel 1972 in uno studio in cui il normale siero di coniglio è stato polimerizzato usando glutaraldeide¹¹. Piccoli blocchi del gel risultante sono stati poi immersi per 1-4 settimane in soluzioni contenenti gli antigeni immunoglobuline di interesse a varie concentrazioni. Dopo la fissazione dell'alcol e l'incorporazione della paraffina, è stato dimostrato che sezioni dei controlli risultanti si coloravano con intensità corrispondenti al logaritmo delle soluzioni antigeniche in cui erano state immerse. Successivamente, i ricercatori hanno preparato coniugati di glutaraldeide di aminoacidi specifici in BSA diluito o soluzioni omogenee cerebrali come controlli positivi negli studi di microscopia immuno-elettronica^12,13. Lavori più recenti hanno studiato l'uso di gel a base di soluzioni proteiche fissate alla formaldeide come surrogati del tessuto FFPE nell'analisi di spettrometria di massa¹⁴. Un altro lavoro recente ha studiato la struttura e le proprietà dei gel formati riscaldando soluzioni di albumina sierica umana o bovina a varie concentrazioni e pH¹⁵. Questi autori hanno scoperto che l'albumina sierica forma tre tipi di gel che differiscono per elasticità meccanica, conservazione della struttura secondaria e capacità di legame con gli acidi grassi a seconda delle condizioni sperimentali. Insieme, questi documenti dimostrano la fattibilità generale dell'approccio qui impiegato. Le soluzioni proteiche di composizione definita creano gel simili a tessuti che possono essere ulteriormente elaborati, sezionati e colorati utilizzando metodi istologici di routine.

Questo protocollo descrive la formazione di un controllo IHC sintetico a base di albumina sierica bovina (BSA) polimerizzata con calore e formaldeide. I gel possono incorporare un'ampia varietà di antigeni, tra cui proteine a lunghezza intera, domini proteici e peptidi lineari, nonché antigeni non proteici tra cui oligonucleotidi². Questa dimostrazione utilizza un antigene di esempio un peptide lineare che codifica per gli amminoacidi C-terminal 16 della proteina umana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (vedi Tabella dei materiali). Questa sequenza include gli epitopi riconosciuti da tre anticorpi diagnosticamente rilevanti disponibili in commercio, tra cui il reagente policlonale Herceptest (ENPEYLGLDVP) e gli anticorpi monoclonali CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (vedi Tabella dei materiali)¹⁶.

Il metodo qui dimostrato impiega reagenti prontamente disponibili utilizzando processi e tecniche familiari a qualsiasi laboratorio di istologia praticante. La limitazione più significativa è la necessità di identificare e acquistare gli antigeni bersaglio, che può essere realizzato in molti casi a un costo relativamente modesto. Poiché questi controlli sintetici sono di composizione completamente definita e realizzati con metodi semplici, possono essere implementati in molti laboratori con risultati riproducibili. Il loro uso può facilitare la valutazione oggettiva e quantificabile dei risultati della colorazione IHC e consentire una maggiore riproducibilità intra e interlaboratorio.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione madre e degli strumenti

1. Preparare 20 mL di una soluzione BSA al 25% p/v mescolando 5 g di polvere di BSA in 14 mL di PBS, pH 7,2 in un tubo conico da 50 mL fino a disperdersi uniformemente. Vortice se necessario per disperdere la polvere BSA.
   1. Conservare la soluzione per una notte a 4 °C per consentire la completa dissoluzione. Regolare il volume finale a 20 ml con PBS per creare una soluzione stock al 25% p/v.
2. Preparare 20 mL di una soluzione di BSA al 31,3% p/v mescolando 6,26 g di polvere di BSA in 13 mL di PBS, pH 7,2 in un tubo conico da 50 mL fino a disperdersi uniformemente. Conservare la soluzione per una notte a 4 °C per consentire la completa dissoluzione. Regolare il volume finale a 20 ml con PBS per creare una soluzione stock al 31,3% p/v.
3. Preriscaldare un blocco di calore a 85 °C.
   NOTA: Il protocollo seguente crea gel peptidici / BSA con volumi di 1,26-1,4 mL formati in tubi microcentrifuga da 1,5 mL. Per utilizzare volumi più piccoli, ad esempio, quando le scorte di antigene sono limitate, preparare i gel in tubi PCR e utilizzare un termociclatore impostato a 85 °C come blocco termico.
4. Verificare che la miscela BSA/formaldeide formi un gel come previsto mescolando 700 μL di soluzione BSA al 25% con 700 μL di formaldeide al 37%. Mescolare bene pipettando su e giù 5 volte entro 5-10 s. Evitare di creare bolle d'aria.
   ATTENZIONE: La formaldeide concentrata è tossica; utilizzare con le opportune precauzioni di sicurezza.
5. Immediatamente dopo aver miscelato le soluzioni di BSA e formaldeide, posizionare il tubo di microcentrifuga chiuso in un blocco termico a 85 °C per 10 minuti. Rimuovere il tubo dal blocco di calore e lasciarlo raffreddare. Confermare che il gel si è formato come previsto.

2. Preparazione e diluizione dei peptidi

1. Ottenere 5-20 mg di peptide liofilizzato della sequenza desiderata.
   NOTA: Gli amminoacidi C-terminal 16 del dominio intracellulare ERBB2 umano riconosciuti da 4B5 sono TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
   1. Aggiungere 4 aminoacidi al N-terminus, acetil-YGSG, e C-terminus, GSGC-amide per facilitare il cross-linking del peptide a BSA e fornire spaziatura tra la molecola BSA e l'epitopo peptidico.
      NOTA: La sequenza completa è: acetil-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide.
   2. Se lo si desidera, utilizzare altre sequenze di amminoacidi N- e C-terminali per estendere l'epitopo peptidico del nucleo.
      NOTA: L'impatto delle diverse sequenze varia a seconda delle diverse combinazioni anticorpo/epitopo. L'aggiunta del peptide C-terminale riduce il legame di alcuni anticorpi agli epitopi C-terminali. In questi casi, omettere questa sequenza.
   3. Confermare che i peptidi provenienti da fonti commerciali sono forniti al >95% di purezza, la cui composizione è confermata dall'analisi HPLC e dalla spettrometria di massa.
2. Calcolare i volumi necessari per le soluzioni stock peptidiche 5x (1,25 E-2 M). Facendo riferimento alla Tabella 1, colonne C-E, inserire i valori per il peso molecolare dell'antigene (g/mole), la percentuale di purezza dell'antigene (0-100) e la massa dell'antigene (mg).
   NOTA: Il volume di solvente (in μL) per risospese il campione per ottenere una soluzione madre di 1,25 E-2 M è 800 x peso molecolare dell'antigene x percentuale purezza dell'antigene/massa dell'antigene.
   1. Preparare ed etichettare chiaramente otto tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
      NOTA: I tubi conterranno 5x stock di peptidi in un solvente, 1x brodo peptidico in un solvente, cinque diluizioni seriali 10x da 2,5 E-4 M a 2,5 E-8 M peptide / BSA / formaldeide gel e un gel di controllo negativo contenente BSA / formaldeide privo di antigene aggiunto. Tutti i campioni di gel sembrano identici. Quando si preparano più serie di diluizioni peptidiche contemporaneamente, fare attenzione a etichettare e identificare correttamente tutti i tubi e le cassette di elaborazione. Utilizzare tubi microcentrifuga codificati a colori e cassette di elaborazione ove possibile per ridurre al minimo l'errata identificazione.
3. Preparare una soluzione madre peptidica 5x a 1,25 E-2 M risospendendo l'intera massa di peptide liofilizzato (20 mg per i peptidi ERBB2) in 60 μL del solvente appropriato.
   NOTA: in questo esempio, la dimetilformammide (DMF) è stata aggiunta direttamente al contenitore del fornitore.
   1. Ispezionare la soluzione per assicurarsi che il peptide sia completamente disciolto. Se necessario, aggiungere ulteriore solvente e/o sonicare il campione fino a completa dissoluzione del peptide, facendo attenzione a non superare il volume calcolato nella Tabella 1 per il 5x stock peptidico.
      ATTENZIONE: DMF è tossico; utilizzare con le opportune precauzioni.
      NOTA: A seconda della sequenza di amminoacidi e della corrispondente idrofobicità e carica, i peptidi possono essere solubili in DMF, dimetilsolfossido (DMSO), acqua pura o soluzioni diluite di acido acetico, acido formico o bicarbonato di ammonio. Le caratteristiche peptidiche possono essere calcolate utilizzando una varietà di strumenti online¹⁷. Alcuni fornitori di peptidi possono suggerire solventi appropriati per sequenze specifiche.
   2. Aggiungere solvente se necessario per portare il volume del 5x peptido stock al volume finale calcolato nella Tabella 1. Vortice per 5 s e centrifuga a temperatura ambiente a 5000 x g per 5 s. Le soluzioni peptidiche possono essere conservate a -80 °C.
4. Facendo riferimento alla Tabella 2, Colonna C, preparare 150 μL di 1x soluzione madre peptidica (2,5 E-3 M) diluendo 30 μL del 5x stock peptidico in 120 μL di solvente (DMF questo esempio). Vortice per 5 s e centrifuga a temperatura ambiente a 5000 x g per 5 s.
5. Facendo riferimento alla Tabella 2, Colonna D, preparare 700 μL di 5 soluzione peptidica/BSA E-4 M (Diluizione 1) diluendo 140 μL di 1x stock peptidico in 560 μL di BSA/PBS al 31,3%, pH 7,2. Vortice per 5 s e centrifuga a temperatura ambiente a 5000 x g per 5 s.
   NOTA: La concentrazione finale di BSA di questa soluzione è del 25% (p/v).
6. Facendo riferimento alla Tabella 2, Colonne E-H, preparare quattro successive diluizioni seriali 10x del 5 peptide E-4 M/BSA stock aggiungendo 70 μL di soluzione peptidica/BSA a 630 μL di 25% BSA/PBS, pH 7,2. Vortice per 5 s e centrifuga a temperatura ambiente a 5000 x g per 5 s.
   NOTA: Dopo questo passaggio, ci saranno cinque diluizioni seriali 10 volte del peptide (da 5 E-4 M a 5 E-8 M) nel 25% di BSA / PBS, pH 7,2. I primi quattro campioni conterranno 630 μL. L'ultimo campione conterrà 700 μL.
7. Facendo riferimento alla Tabella 2, Colonna I, preparare un campione BSA a controllo negativo contenente 700 μL di BSA/PBS al 25%, pH 7,2 (Figura 1A).

3. Preparazione di gel peptidici BSA

1. Verificare che il blocco termico o il termociclatore sia stabile a 85 °C.
2. Fare riferimento alla Tabella 3, Colonne B-E. Lavorando un campione alla volta, aggiungere al primo campione BSA/peptide al 25% (Diluizione 1) 630 μL di formaldeide al 37%. Mescolare bene pipettando su e giù 5 volte entro 5-10 s. Evitare di creare bolle d'aria.
   ATTENZIONE: La formaldeide concentrata è tossica; utilizzare con le opportune precauzioni di sicurezza.
   1. Dopo aver miscelato le soluzioni peptidiche/BSA e formaldeide, posizionare il tubo microcentrifuga chiuso in un blocco termico a 85 °C per 10 minuti.
      NOTA: Mescolare accuratamente la soluzione di peptide BSA e la formaldeide, ma non spendere più di 10 s per pipettare la miscela prima di mettere il campione sul fuoco. Poiché la reticolazione della formaldeide inizia immediatamente, il gel può formarsi in modo diverso se la procedura viene variata per campioni diversi. La concentrazione finale di BSA in questi gel è del 12,5% (p/v). Concentrazioni finali di BSA inferiori al 10% possono produrre gel che non si solidificano; concentrazioni finali di BSA superiori al 16% possono produrre gel più fragili e difficili da sezionare dopo la lavorazione.
   2. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.2.1 per ciascuna delle diluizioni 2-4.
   3. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.2.1 per la diluizione 5, ma aggiungere 700 μL di formaldeide al 37%, un volume pari ai 700 μL di soluzione di antigene BSA.
   4. Fare riferimento alla tabella 3 colonna Colonna G; ripetere i passaggi 3.2 e 3.2.1 per il campione di controllo negativo, aggiungendo 700 μL di formaldeide al 37%, un volume pari ai 700 μL di soluzione BSA a controllo negativo.
3. Rimuovere i tubi dal blocco di calore dopo 10-12 min. Il tempo di riscaldamento dovrebbe essere il più coerente possibile per ciascun campione. Lasciare raffreddare i gel sul banco per 5-10 minuti (Figura 1B).
4. Utilizzando una spatola da laboratorio monouso pulita e flessibile, rimuovere il campione di gel in un unico pezzo dal tubo di microcentrifuga e metterlo in un contenitore sigillato contenente almeno 15 ml di formalina tamponata neutra (NBF), utilizzando un contenitore separato di NBF per ciascun campione.
   1. In alternativa, tagliare il fondo del tubo della microcentrifuga con una nuova lama di rasoio a bordo singolo e spingere il gel fuori dal fondo con aria o una sonda adatta (Figura 1C-G).
      NOTA: I gel solidificati di formaldeide/BSA possono rimanere nei tubi microcentrifuga a temperatura ambiente fino a 24 ore. Lasciare i gel nel tubo della microcentrifuga per più di 24 ore può farli diventare fragili e più difficili da elaborare e sezionare.

4. Tagliare, elaborare e incorporare gel BSA

1. Tagliare il cono gel in dischi cilindrici di circa 5 mm di spessore usando un rasoio a bordo singolo pulito (Figura 1H,I). Avvolgere i dischi in un involucro per biopsia, posizionando un disco gel più grande in una cassetta (da utilizzare nello studio pilota nella fase 5) e i dischi gel rimanenti insieme in una seconda cassetta (Figura 2A, E) per l'uso nella costruzione di microarray tissutali (TMA) nella fase 6. Posizionare i dischi di gel avvolti in cassette di lavorazione dei tessuti chiaramente etichettate.
   1. Posizionare i gel cassettati in almeno 15 ml di NBF al 10% per campione di gel prima della lavorazione, utilizzando un contenitore separato di NBF per ciascun campione. I gel possono rimanere in NBF al 10% per 6-48 ore.
2. Elaborare i gel in un processore tissutale istologico automatizzato, seguendo un ampio programma tissutale con pressione e vuoto. Ogni passaggio richiede 1 ora: 10% NBF, 70% etanolo, 95% etanolo (ripetere due volte), 100% etanolo (ripetere due volte), xileni (ripetere tre volte), paraffina a 60 °C (ripetere tre volte).
   NOTA: per gli sperimentatori che scelgono di elaborare i campioni manualmente, seguire la stessa sequenza di reagenti e tempi.
3. Al termine dell'elaborazione del campione, rimuovere le cassette dal processore tissutale e spostarle nel centro di incorporamento della paraffina.
4. Scartare i gel dall'involucro della biopsia e incorporare i gel nella paraffina. Per ogni campione, incorporare un disco di gel in un piccolo stampo di 15 mm x 15 mm (Figura 2B-D) e i dischi di gel rimanenti insieme in un secondo stampo più grande (Figura 2F-H). Il primo blocco con un campione sarà utilizzato per testare il gel peptidico in uno studio pilota. Il secondo blocco può essere utilizzato per la costruzione di TMA.

5. Valutazione pilota della serie di diluizione peptidica

1. Per ogni serie di diluizione peptidica, pianificare la creazione di due vetrini contenenti un totale di 6 sezioni separate: una sezione da ciascuno dei cinque campioni della serie di diluizione, più una sezione dal campione di controllo negativo solo BSA.
   1. Sul primo vetrino, tagliare una sezione spessa 4 μm da ciascuno dei blocchi più piccoli contenenti un disco di gel con le tre più alte concentrazioni di peptidi (da 2,5 E-4 M a 2,5 E-6 M).
   2. Su una seconda diapositiva, tagliare una sezione di 4 μm di spessore da ciascun blocco con le due concentrazioni peptidiche più basse (2,5 E-7 M e 2,5 E-8 M) e una sezione dal blocco di controllo solo BSA. Registrare l'ordine dei campioni sulle diapositive.
      NOTA: Aspettatevi che i gel incorporati nella paraffina taglino senza intoppi, producendo sezioni uniformi senza frammentazione, strappo o artefatto chiacchierone. Se particolari campioni di gel incorporati in paraffina sono difficili da sezionare, immergere brevemente la faccia del blocco in acqua distillata ghiacciata prima di sezionare. Se necessario, sperimentare diversi tempi di ammollo o con soluzioni diverse (ad esempio, acqua di ammoniaca).
   3. Dopo il sezionamento, asciugare i vetrini a temperatura ambiente (circa 23 °C) per 24 ore seguiti da 60 °C per 30 minuti.
2. Macchiare i due vetrini preparati per ogni peptide con l'anticorpo desiderato secondo i protocolli IHC standard.
   NOTA: La concentrazione primaria di anticorpi sul vetrino utilizzata per il monoclonale di coniglio 4B5 in questa dimostrazione è stata di 1,5 ug/ml.
   1. Aspettatevi di vedere un segnale relativamente uniforme all'interno di ogni sezione di gel, con i diversi campioni di gel che mostrano un intervallo di intensità del segnale corrispondente alle diluizioni peptidiche.
3. Se i risultati dello studio pilota sono soddisfacenti, costruire un TMA dai blocchi donatori di gel contenenti diverse concentrazioni di antigene peptidico, come descritto nelle fasi successive del protocollo.

6. Costruzione TMA in gel BSA

1. Costruisci un microarray tissutale contenente nuclei duplicati di 1 mm di diametro da blocchi di donatori contenenti solo gel BSA e gel BSA contenenti tutte e cinque le diluizioni del peptide ERBB2.
   NOTA: Se lo si desidera, includere gel BSA contenenti le stesse cinque diluizioni di un peptide non bersaglio come ulteriori controlli negativi. Se lo si desidera, includere nuclei di linee cellulari rappresentative che esprimono ERBB2 come controlli positivi.
2. Tagliare sezioni spesse 4 μm del TMA e macchiare con 1,5 ug/mL di monoclonale di coniglio anti-ERBB2/HER2/neu 4B5 (vedi Tabella dei materiali) secondo i protocolli standard di laboratorio.
3. Valutare l'intensità della macchia risultante qualitativamente mediante ispezione o quantitativamente mediante scansione e analisi di immagini digitali (Figura 3A,B).
   NOTA: poiché l'analisi delle immagini digitali non è al centro di questo protocollo, questi passaggi vengono lasciati al lettore per eseguire in base alle proprie preferenze.

Risultati

I peptidi devono dissolversi completamente in un solvente appropriato a temperatura ambiente per formare una soluzione otticamente chiara. Se il particolato visibile è ancora presente dopo 30-60 minuti, può essere utile aggiungere ulteriori volumi del solvente originale o di un solvente alternativo non superiore al volume previsto della soluzione madre peptidica 5x calcolata nella Tabella 1. Allo stesso modo, la soluzione combinata peptide/BSA deve rimanere traslucida (Figura 1A

Discussione

Questo metodo consente all'utente di creare campioni uniformi di composizione nota e concentrazione di antigene come standard nelle reazioni IHC, utilizzando materiali e tecniche familiari alla maggior parte dei laboratori di istologia. Il passo più cruciale è identificare l'epitopo a cui si lega l'anticorpo di interesse. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un antigene peptidico lineare dall'ICD ERBB2/HER2. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per formare gel BSA contenenti oligonucleotidi, etichette fluore...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088