Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.

Abstract

L'organoide cerebrale derivato da iPSC è una tecnologia promettente per la modellazione in vitro delle patologie del sistema nervoso e lo screening farmacologico. Questa tecnologia è emersa di recente. È ancora agli inizi e ha alcune limitazioni ancora irrisolte. Gli attuali protocolli non consentono di ottenere organoidi sufficientemente coerenti per la scoperta di farmaci e studi preclinici. La maturazione degli organoidi può richiedere fino a un anno, spingendo i ricercatori a lanciare più processi di differenziazione contemporaneamente. Impone costi aggiuntivi per il laboratorio in termini di spazio e attrezzature. Inoltre, gli organoidi cerebrali hanno spesso una zona necrotica al centro, che soffre di carenza di nutrienti e ossigeno. Quindi, la maggior parte dei protocolli attuali utilizza un sistema circolante per il terreno di coltura per migliorare la nutrizione.

Nel frattempo, non ci sono sistemi dinamici economici o bioreattori per la coltivazione di organoidi. Questo documento descrive un protocollo per la produzione di organoidi cerebrali in mini bioreattori fatti in casa compatti ed economici. Questo protocollo consente di ottenere organoidi di alta qualità in grandi quantità.

Introduzione

I modelli umani derivati da iPSC sono ampiamente utilizzati negli studi sui disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo¹. Negli ultimi dieci anni, i modelli di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, hanno essenzialmente completato le tradizionali colture neuronali 2D². Gli organoidi ricapitolano in una certa misura l'architettura 3D del cervello embrionale e consentono una modellazione più precisa. Molti protocolli sono pubblicati per la generazione di organoidi che rappresentano diverse regioni del cervello: corteccia cerebrale^3,4,5,cervelletto^6,mesencefalo,encefalo, ipotalamo^7,8,9e ippocampo^10. Ci sono stati diversi esempi di utilizzo di organoidi per studiare le malattie del sistema nervoso umano¹¹. Inoltre, gli organoidi sono stati implementati nelle scoperte di farmaci¹² e utilizzati in studi di malattie infettive, tra cui SARS-Cov-2^13,14.

Gli organoidi cerebrali possono raggiungere fino a diversi millimetri di diametro. Quindi, la zona interna dell'organoide può soffrire di ipossia o malnutrizione e alla fine diventare necrotica. Pertanto, molti protocolli includono bioreattori speciali⁸, scuotitori o sistemi microfluidici¹⁵. Questi dispositivi possono richiedere grandi volumi di costosi supporti di coltura cellulare. Inoltre, il costo di tali apparecchiature è solitamente elevato. Alcuni bioreattori sono costituiti da molte parti meccaniche che li rendono difficili da sterilizzare per il riutilizzo.

La maggior parte dei protocolli soffre dell'"effetto batch"¹⁶, che genera una variabilità significativa tra gli organoidi ottenuti dalle iPSC identiche. Questa variabilità ostacola i test antidroga o gli studi preclinici che richiedono uniformità. L'alta resa di organoidi sufficiente per selezionare organoidi di dimensioni uniformi può parzialmente risolvere questo problema.

Anche il fattore tempo è un problema significativo. Matsui et al. (2018) hanno dimostrato che gli organoidi cerebrali richiedono almeno sei mesi per raggiungere la maturità¹⁷. Trujillo et al. (2019) hanno anche dimostrato che l'attività elettrofisiologica si è verificata negli organoidi solo dopo sei mesi di coltivazione¹⁸. A causa del lungo tempo di maturazione degli organoidi, i ricercatori spesso lanciano una nuova differenziazione prima di completare la precedente. Molteplici processi paralleli di differenziazione richiedono spese aggiuntive, attrezzature e spazio di laboratorio.

Abbiamo recentemente sviluppato un mini bioreattore che risolve principalmente i problemi sopra menzionati¹⁹. Questo bioreattore fatto in casa è costituito da un'adesione ultra-bassa o da una capsula di Petri non trattata con una manopola di plastica al centro. Questa manopola in plastica impedisce l'affollamento degli organoidi e la loro conglutinazione al centro della capsula di Petri, causata dalla rotazione dello shaker. Questo documento descrive come questo mini bioreattore fatto in casa economico e semplice consente di generare organoidi cerebrali di alta qualità in grandi quantità.

Protocollo

NOTA: utilizzare la tecnica sterile in tutto il protocollo, esclusi i passaggi 1.2 e 1.3. Riscaldare tutti i mezzi di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli a cellule o organoidi. Coltivare le cellule in un incubatore a CO₂ a 37 °C in 5% CO₂ su 80% di umidità. Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Trasformare le piastre di Petri in mini bioreattori

1. Tagliare tubi centrifughi sterili da 15 ml in anelli di 7-8 mm di altezza; autoclave gli anelli.
2. Rompere le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in briciole. Sciogliere circa 1 g di briciole di plastica in 10 ml di cloroformio durante la notte per preparare la plastica liquida.
   ATTENZIONE: Lavorare in una cappa aspirante.
3. Controllare che la plastica liquida risultante sia abbastanza viscosa per il pipettaggio; la sua goccia mantiene una forma sferica e non si diffonde sulla superficie. Se è molto liquido, aggiungi altre briciole di plastica. Se è spesso, aggiungere cloroformio.
4. Crea una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione da 6 cm. Ci sono due modi ugualmente adatti, come dettagliato di seguito.
   1. Metti l'anello di plastica autoclavata al centro e lascia cadere la plastica liquida all'interno dell'anello.
   2. Senza alcun anello di plastica, far cadere la plastica liquida al centro della capsula di Petri.
5. Lasciare i piatti aperti per 2-3 ore in una cappa a flusso laminare fino a quando l'asciugazione completa. Trattare i piatti essiccati con radiazioni ultraviolette per 15-20 minuti.

2. Induzione della differenziazione neuronale delle iPSC

1. Coltivare iPSC nel mezzo per cellule staminali pluripotenti fino al 75-90% di confluenza in piastre di Petri da 35 mm precoate con una matrice costituita da proteine extracellulari.
2. Preparare A-SR medio. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.
3. Aspirare il terreno di coltivazione e aggiungere 2 ml di terreno A-SR al giorno 0 di differenziazione.
4. Preparare il mezzo A (vedi Tabella 2).
5. Coltivare le cellule nel mezzo A per due settimane dai giorni 2-14, mezzo rinfrescante nelle piastre di Petri a giorni alterni.

3. La formazione di sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali al giorno 14

1. Al giorno 14, produrre sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali utilizzando una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti contenente circa 1.200 micro pozzetti in ciascun pozzetti (Figura 2C). Seguire la procedura indicata di seguito.
   NOTA: In questa fase di differenziazione, una capsula di Petri da 35 mm di solito contiene 3 - 3,5 x 10⁶ cellule precursori neuroepiteliali. Pertanto, una capsula di Petri da 35 mm con cellule precursori neuroepiteliali è sufficiente per 3 - 4 pozzi di piastra di coltura a 24 pozzi con microwell.
2. Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti: per ogni pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno A. Centrifugare brevemente a 1.300 x g per 5 minuti in rotore a benna oscillante dotato di supporto per piastre. Controlla al microscopio che non ci siano bolle nei microwell.
3. Preparare il mezzo B (Tabella 3).
4. Rimuovere il mezzo dalla capsula di Petri con cellule precursori neuroepiteliali; lavare le cellule con 2 ml di DMEM/F12. Per il distacco cellulare, trattare le cellule con 1,5 mL di soluzione edTA da 0,48 mM preparata in PBS. Controllare il distacco cellulare al microscopio.
5. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di DMEM/F12 nel tubo per lavare le cellule. Centrifuga a 200 x g per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e resuspend in 2 mL di mezzo B.
6. Controllare la concentrazione cellulare e la vitalità mediante la colorazione Trypan Blue e un emocitometro. Calcolare il volume di sospensione necessario per contenere 1 x 10⁶ celle vitali in totale.
7. Trasferire la sospensione cellulare contenente 1 x^{10 6} cellule in ciascun pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con micro pozzetti. Aggiungere il mezzo B fino a 2 ml in ciascun pozzo, pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte e centrifugare brevemente 100 x g per 1 minuto per catturare le cellule nei micropzzetti.
   NOTA: il numero di celle per pozzo non deve superare 1 x 10⁶. Altrimenti, gli sferoidi dei microwell vicini si fondono.
8. Controllare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in microwell. Ripetere il pipettaggio e la centrifugazione se le cellule sono distribuite in modo non uniforme.
9. Incubare la piastra durante la notte per consentire alle cellule di aggregarsi in sferoidi.

4. Ottenimento e coltivazione di organoidi

1. La mattina successiva (giorno 15), controlla la qualità degli sferoidi al microscopio. Assicurarsi che siano trasparenti e lisci, se sani (Figura 2A,B). Raccogliere con cura gli sferoidi da ciascun pozzo in un tubo da 15 ml, lasciare precipitare gli sferoidi per gravità per 2-3 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere agli sferoidi 2 mL della matrice scongelata durante lo stesso tempo sul ghiaccio. Mescolare delicatamente per pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
3. Per lavare l'eccesso di matrice, aggiungere al tubo 8 mL di media B. Pipetta delicatamente, quindi centrifugare il tubo per 1 minuto a 100 x g.
   NOTA: Non superare il tempo e la velocità di centrifugazione per evitare l'aggregazione irreversibile di sferoidi.
4. Rimuovere il surnatante. Aggiungere al tubo 2 mL di media B, pipettare delicatamente. Dividere la sospensione sferoidale tra due mini bioreattori, ciascuno contenente 4 ml di media B. Posizionare i mini bioreattori in una capsula di Petri da 15 cm per evitare l'evaporazione dell'acqua ed evitare la contaminazione.
5. Metti la capsula di Petri con mini bioreattori su uno shaker orbitale. Coltivare gli organoidi ad una velocità di rotazione di 70-75 giri/min.
6. Il giorno 16, preparare il mezzo C (Tabella 4).
7. Trasferire gli organoidi in tubo da 15 ml. Per 5 minuti, lasciarli cadere sul fondo, aspirare il surnatante, aggiungere 5 ml di C medio. Restituire gli organoidi nei mini bioreattori.
   NOTA: Fare attenzione a non perdere gli sferoidi, che sono trasparenti e appena visibili.
8. Coltivare sferoidi in C medio per due settimane, rinfrescando il mezzo ogni due giorni. Alla fine di queste due settimane, lasciare circa 100 sferoidi per mini bioreattore per la successiva coltivazione. Congelare gli sferoidi eccessivi in un mezzo di congelamento in azoto liquido.
9. Il giorno 30, preparare il mezzo D (Tabella 5).
10. Cambia il terreno di coltivazione in medio D, che è un mezzo di maturazione. Aggiornare il mezzo di coltivazione ogni 2-3 giorni per tre settimane, quindi utilizzare il mezzo D senza BDNF e GDNF.

Risultati

Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo includeva cinque media in cui le iPSC si differenziavano in organoidi cerebrali per almeno un mese. La differenziazione è stata avviata quindi le iPSC hanno raggiunto la confluenza del 75-90% (Figura 2A,B). I primi segni di differenziazione verso i neuroni sono stati osservati nei giorni 10-11 della coltivazione di iPSC nel mezzo A, quando le cellule hanno iniziato a raggruppar...

Discussione

Il protocollo descritto ha due passaggi cruciali che consentono la generazione di organoidi di alta qualità di dimensioni uniformi. In primo luogo, gli organoidi crescono da sferoidi che sono quasi identici nel numero di cellule e nella maturità cellulare. In secondo luogo, i bioreattori fatti in casa forniscono a ciascun organoide un ambiente uniforme, in cui gli organoidi non si affollano o si attaccano insieme.

La qualità cellulare e lo stato di maturazione cellulare sono essenziali per ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010