Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Resumo

O organoide cerebral derivado do iPSC é uma tecnologia promissora para modelar in vitro as patologias do sistema nervoso e o rastreamento de drogas. Essa tecnologia surgiu recentemente. Ainda está em sua infância e ainda tem algumas limitações não resolvidas. Os protocolos atuais não permitem que a obtenção de organoides seja consistente o suficiente para a descoberta de drogas e estudos pré-clínicos. O amadurecimento dos organoides pode levar até um ano, pressionando os pesquisadores a lançar múltiplos processos de diferenciação simultaneamente. Impõe custos adicionais para o laboratório em termos de espaço e equipamentos. Além disso, organoides cerebrais geralmente têm uma zona necrosada no centro, que sofre de deficiência de nutrientes e oxigênio. Assim, a maioria dos protocolos atuais utiliza um sistema circulante para o meio cultural para melhorar a nutrição.

Enquanto isso, não há sistemas dinâmicos baratos ou bioreatores para o cultivo organoide. Este artigo descreve um protocolo para a produção de organoides cerebrais em minirepartores caseiros compactos e baratos. Este protocolo permite a obtenção de organoides de alta qualidade em grandes quantidades.

Introdução

Modelos derivados do iPSC humano são amplamente utilizados nos estudos de distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos¹. Na última década, modelos de tecido cerebral 3D, os chamados organoides cerebrais, essencialmente complementaram as culturas neuronais 2D tradicionais². Os organoides recapitulam até certo ponto a arquitetura 3D do cérebro embrionário e permitem uma modelagem mais precisa. Muitos protocolos são publicados para a geração de organoides representando diferentes regiões cerebrais: córtex cerebral^3,4,5, cerebelo⁶, cérebro médio, cérebro, hipotálamo^7,8,9e hipocampo¹⁰. Houve vários exemplos de uso de organoides para estudar doenças do sistema nervoso humano¹¹. Além disso, os organoides foram implementados em descobertas de medicamentos¹² e utilizados em estudos de doenças infecciosas, incluindo SARS-Cov-2^13,14.

Os organoides cerebrais podem atingir até vários milímetros de diâmetro. Assim, a zona interna do organoide pode sofrer de hipóxia ou desnutrição e eventualmente se tornar necrosada. Portanto, muitos protocolos incluem bioreatores especiais^8,shakers ou sistemas microfluidos¹⁵. Esses dispositivos podem exigir grandes volumes de mídia de cultura celular cara. Além disso, o custo desses equipamentos geralmente é alto. Alguns bioreatores consistem em muitas partes mecânicas que os tornam difíceis de esterilizar para reutilização.

A maioria dos protocolos sofre do "efeito lote"¹⁶, que gera variabilidade significativa entre organoides obtidos a partir de iPSCs idênticos. Essa variabilidade dificulta o teste de drogas ou estudos pré-clínicos que requerem uniformidade. O alto rendimento de organoides suficientes para selecionar organoides de tamanho uniforme pode resolver parcialmente este problema.

O fator tempo também é um problema significativo. Matsui et al. (2018) mostraram que os organoides cerebrais requerem pelo menos seis meses para atingir a maturidade¹⁷. Trujillo et al. (2019) também demonstraram que a atividade eletrofisiológica ocorreu apenas em organoides após seis meses de cultivo¹⁸. Devido ao longo tempo de maturação organoide, os pesquisadores frequentemente lançam uma nova diferenciação antes de completar a anterior. Múltiplos processos paralelos de diferenciação exigem despesas adicionais, equipamentos e espaço de laboratório.

Recentemente desenvolvemos um mini bioreator que resolve principalmente os problemas mencionados acima^{de 19}. Este bioreator caseiro consiste em uma placa de Petri ultra-baixa ou não tratada com um botão plástico no centro. Este botão plástico evita a aglomeração de organoides e sua conglutinação no centro da placa de Petri, que é causada pela rotação do agitador. Este artigo descreve como este mini bioreator caseiro barato e simples permite gerar organoides cerebrais de alta qualidade em grandes quantidades.

Protocolo

NOTA : Utilize técnica estéril em todo o protocolo, excluindo as etapas 1.2 e 1.3. Aqueça todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de aplicar em células ou organoides. Cultivar células em uma incubadora de CO₂ a 37 °C em 5% de CO₂ em 80% de umidade. O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Transformando placas de Petri em mini bioreatores

1. Corte tubos de centrífugas estéreis de 15 mL em anéis de 7-8 mm de altura; autoclave os anéis.
2. Quebre a baixa adesão, placas de Petri não tratadas ou microbiológicas em migalhas. Dissolva cerca de 1 g de migalhas plásticas em 10 mL de clorofórmio durante a noite para preparar plástico líquido.
   ATENÇÃO: Trabalhe em um capô de fumaça.
3. Verifique se o plástico líquido resultante é viscoso o suficiente para a pipetação; sua queda retém uma forma esférica e não se espalha na superfície. Se for muito líquido, adicione mais migalhas de plástico. Se for grosso, adicione clorofórmio.
4. Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra-baixa estéril de 6 cm. Existem duas maneiras igualmente adequadas, conforme detalhado abaixo.
   1. Coloque o anel de plástico autoclavado no centro e solte o plástico líquido no interior do anel.
   2. Sem nenhum anel de plástico, deixe cair o plástico líquido no centro da placa de Petri.
5. Deixe os pratos abertos por 2-3 h em uma capa de fluxo laminar até que sequem completas. Trate os pratos secos com radiação ultravioleta por 15-20 min.

2. Indução da diferenciação neuronal dos iPSCs

1. Cultivar iPSCs no meio para células-tronco pluripotentes até 75-90% de confluência em placas de Petri de 35 mm pré-revestidas com uma matriz composta por proteínas extracelulares.
2. Prepare o meio A-SR. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.
3. Aspire o meio de cultivo e adicione 2 mL de meio A-SR no dia 0 de diferenciação.
4. Prepare o meio A (ver Tabela 2).
5. Cultivar células em média A por duas semanas entre os dias 2 e 14, meio refrescante em pratos petri a cada dois dias.

3. A formação de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais no dia 14

1. No dia 14, faça esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais usando uma placa de cultura especial de 24 poços contendo aproximadamente 1.200 microwells em cada poço(Figura 2C). Acompanhe o procedimento abaixo.
   NOTA: Nesta fase de diferenciação, uma placa de Petri de 35 mm geralmente contém 3 - 3,5 x 10⁶ células precursoras neuroepitheliais. Assim, uma placa de Petri de 35 mm com células precursoras neuroepitenelianas é suficiente para 3 - 4 poços de placa de cultura de 24 poços com microwells.
2. Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells: Para cada poço, adicione 1 mL de média A. Centrífuga brevemente a 1.300 x g por 5 min em rotor de balde balançando equipado com porta-placas. Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells.
3. Prepare o meio B (Tabela 3).
4. Remover o meio da placa de Petri com células precursoras neuroefitelais; lavar as células com 2 mL de DMEM/F12. Para o descolamento celular, trate as células com 1,5 mL de solução EDTA de 0,48 mM preparada em PBS. Controle o desprendimento celular sob o microscópio.
5. Colhe as células em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 no tubo para lavar as células. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Remova as células supernascidas e resuspendes em 2 mL de média B.
6. Verifique a concentração e viabilidade celular por staining Trypan Blue e um hemócitometro. Calcule o volume de suspensão necessário para conter 1 x 106 células viáveis no total.
7. Transfira a suspensão celular contendo 1 x 10⁶ células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Adicione b médio até 2 mL em cada poço, células de pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes, e centrífuga brevemente 100 x g por 1 min para capturar células nos microwells.
   NOTA: O número de células por poço não deve exceder 1 x 10⁶. Caso contrário, esferoides de microwells vizinhos se fundem.
8. Verifique sob o microscópio que as células são distribuídas uniformemente em microwells. Reincidente a pipetação e a centrifugação se as células forem distribuídas de forma irregular.
9. Incubar a placa durante a noite para permitir que as células se acumulem em esferoides.

4. Obtenção e cultivo de organoides

1. Na manhã seguinte (dia 15), verifique a qualidade dos esferoides sob o microscópio. Certifique-se de que são transparentes e suaves, se saudáveis(Figura 2A,B). Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mL, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2-3 minutos e, em seguida, remova o sobrenante.
2. Adicione aos esferoides 2 mL da matriz descongelada durante o mesmo tempo no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mL de B médio. Pipeta suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 min a 100 x g.
   NOTA: Não exceda o tempo e a velocidade da centrifugação para evitar a agregação irreversível de esferoides.
4. Remova o supernatante. Adicione ao tubo 2 mL de B médio, pipeta suavemente. Divida a suspensão esferoide entre dois mini bioreatores, cada um contendo 4 mL de médio B. Coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 cm para evitar a evaporação da água e para evitar contaminação.
5. Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a uma taxa de rotação de 70-75 rpm.
6. No dia 16, prepare o meio C (Tabela 4).
7. Transfira os organoides para tubo de 15 mL. Por 5 min, deixe-os cair para o fundo, aspirar o supernante, adicionar 5 mL de C médio. Devolva os organoides para os mini bioreatores.
   NOTA: Tenha cuidado para não perder os esferoides, que são transparentes e pouco visíveis.
8. Cultivar esferoides em C médio por duas semanas, refrescando o meio a cada dois dias. Ao final dessas duas semanas, deixe cerca de 100 esferoides por mini bioreator para o cultivo seguinte. Congele eferóides excessivos em um meio de congelamento em nitrogênio líquido.
9. No dia 30, prepare o meio D (Tabela 5).
10. Mude o cultivo médio para médio D, que é um meio de maturação. Atualize o meio de cultivo a cada 2-3 dias durante três semanas e use o médio D sem BDNF e GDNF.

Resultados

O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo incluiu cinco mídias nas quais os iPSCs se diferenciaram em organoides cerebrais durante pelo menos um mês. A diferenciação foi iniciada, então os iPSCs atingiram a confluência de 75-90% (Figura 2A,B). Os primeiros sinais de diferenciação em relação aos neurônios foram observados nos dias 10-11 do cultivo do iPSC no médio A, quando as células começaram a se agrupar em "ros...

Discussão

O protocolo descrito tem duas etapas cruciais que permitem a geração de organoides de alta qualidade de tamanho uniforme. Primeiro, os organoides crescem a partir de esferoides que são quase idênticos no número celular e na maturidade celular. Em segundo lugar, os bioreatores caseiros fornecem a cada organoide um ambiente uniforme, onde organoides não se aglomeram ou se mantêm unidos.

A qualidade celular e o estado de maturação celular são essenciais para a execução do protocolo. ?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010