Ablazione laser mirata nell'embrione di Saccharina latissima

Riepilogo

La distruzione di cellule specifiche nell'embrione è un potente strumento per studiare le interazioni cellulari coinvolte nel destino cellulare. Il presente protocollo descrive le tecniche per l'ablazione laser di cellule bersaglio nell'embrione precoce dell'alga bruna Saccharina latissima.

Abstract

In Saccharina latissima, l'embrione si sviluppa come un foglio cellulare monostrato chiamato lamina o lama. Ogni cellula embrionale è facile da osservare, facilmente distinguibile dai suoi vicini e può essere presa di mira individualmente. Per decenni, l'ablazione laser è stata utilizzata per studiare lo sviluppo degli embrioni. Qui è stato sviluppato un protocollo per l'ablazione laser cellulare specifica per i primi embrioni dell'alga bruna S. latissima. Il lavoro presentato comprende: (1) la preparazione di embrioni di Saccharina , con una descrizione dei parametri critici, comprese le condizioni di coltura, (2) le impostazioni di ablazione laser e (3) il monitoraggio della successiva crescita dell'embrione irradiato utilizzando la microscopia time-lapse. Inoltre, vengono forniti dettagli sulle condizioni ottimali per il trasporto degli embrioni dalla piattaforma di imaging al laboratorio, che possono influenzare profondamente il successivo sviluppo dell'embrione. Le alghe appartenenti all'ordine Laminariales mostrano modelli di embriogenesi simili a Saccharina; questo protocollo può quindi essere facilmente trasferito ad altre specie in questo taxon.

Introduzione

L'ablazione laser è stata utilizzata per decenni per studiare lo sviluppo dell'embrione. L'irradiazione delle cellule embrionali con un raggio laser consente di monitorare il potenziale rigenerativo e la modifica del lignaggio cellulare durante l'embriogenesi e studiare l'impatto dell'ablazione mirata sulla divisione cellulare e sul destino cellulare. Gli organismi modello utilizzati nei metodi di ablazione laser sono tipicamente animali, come insetti ^1,2, nematodi ^3,4, vertebrati ^5,6 e occasionalmente piante ^7,8. Inoltre, un approccio di micro-ablazione laser è stato utilizzato sull'alga marrone Fucus nel 1994 e nel 1998 per dimostrare il ruolo della parete cellulare nella fotopolarizzazione dell'embrione precoce ^9,10.

Le alghe brune appartengono al gruppo Stramenopiles, divergente alla radice dell'albero eucariotico 1,6 miliardi di anni fa. Di conseguenza, sono filogeneticamente indipendenti da altri organismi multicellulari, come animali e piante¹¹. Saccharina latissima appartiene all'ordine Laminariales, più comunemente noto come alghe, e sono tra i più grandi organismi sulla terra, raggiungendo dimensioni di oltre 30 m. Saccharina sp. è una grande alga utilizzata per molte applicazioni come alimenti e mangimi, e i suoi polisaccaridi sono estratti per l'uso nelle industrie agricole, farmacologiche e cosmetiche in tutto il mondo^{12, 13}. La sua coltivazione, principalmente in Asia e più recentemente in Europa, richiede la preparazione di embrioni negli incubatoi prima di rilasciare il novellame in mare aperto. Come tutte le alghe, ha un ciclo di vita bifasico composto da una fase gametofita microscopica, durante la quale un gametofito aploide cresce e produce gameti per la fecondazione, e una fase sporofita macroscopica diploide, in cui una grande lama planare si sviluppa dalla sua tenuta attaccata al fondo marino o alle rocce. Lo sporofito rilascia spore aploidi alla maturità, completando così il ciclo di vita 14,15,16.

S. latissima presenta alcune interessanti caratteristiche morfologiche¹⁷. Il suo embrione si sviluppa come un foglio planare monostrato 15,18,19 prima di acquisire una struttura multistrato che coincide con l'emergere di diversi tipi di tessuto. Inoltre, Laminariales è uno dei pochi taxa di alghe brune i cui embrioni rimangono attaccati al loro tessuto gametofito materno (Desmarestiales e Sporochnales fanno anche¹⁵). Questa caratteristica offre l'opportunità di studiare il ruolo del tessuto materno in questo processo di sviluppo e confrontare i meccanismi di controllo materno nelle alghe brune con quelli negli animali e nelle piante.

Questo articolo presenta il primo protocollo completo per l'ablazione laser in un embrione di alghe precoce. Questo protocollo che coinvolge la tecnica UV ns-pulsed provoca la distruzione specifica di singole cellule embrionali per studiare i loro rispettivi ruoli durante l'embriogenesi. La procedura offre un approccio affidabile per studiare le interazioni cellulari e il destino cellulare durante l'embriogenesi nei Laminariales.

Protocollo

1. Produzione di Saccharina latissima gametophytes

1. Raccogliere sporofite mature di S. latissima dallo stato selvatico come precedentemente descritto^20,21. Assicurarsi che gli sporofiti selezionati siano privi di epifite (piccoli organismi visibili sulla superficie della lama) o parassiti interni (che si trovano nelle aree sbiancate o macchie sulla lama) .
2. Utilizzando un bisturi, tagliare la parte più scura al centro della lama (tessuto fertile che produce spore²²) in 1-5 pezzi quadrati (1 cm²), evitando eventuali macchie sbiancate, se presenti.
3. Rimuovere eventuali epifite rimanenti pulendo delicatamente i pezzi tagliati con il retro di un bisturi e un po 'di carta assorbente.
4. Mettere i pezzi puliti in un piatto di vetro pieno di acqua di mare naturale sterile (vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti per rilasciare spore dopo il rapporto²² precedentemente pubblicato.
5. Rimuovere i pezzi della lama e filtrare l'acqua di mare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere detriti o organismi indesiderati.
6. Diluire le spore nel filtrato ad una concentrazione di 20-40 spore/mL in piastre di Petri di plastica²².
7. Posizionare la soluzione di spore in un armadio di coltura (vedere Tabella dei materiali) configurato con le condizioni di coltura ottimali (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D).
8. Lascia che le spore germoglino e si sviluppino in gametofiti.
   NOTA: La germinazione delle spore è visibile dopo 2 giorni nell'armadio e la prima divisione cellulare delle cellule gametofite di solito avviene entro le seguenti 48 ore.
9. Sostituire il terreno di coltura dopo 5 giorni con acqua di mare naturale microfiltrata arricchita con una soluzione provasoli 0,5x (NSW1/2) (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Per evitare di ripetere questi passaggi, è possibile selezionare specifici gametofiti maschili e femminili e propagarli vegetativamente per diversi mesi. I gametofiti rimangono vegetativi se coltivati sotto luce rossa (4 μE.m-2.s-1 con una lunghezza d'onda di almeno 580 nm)²³ nelle stesse condizioni di coltura sopra descritte (fase 1.7).

2. Frammentazione e induzione dell'oogenesi

1. Raccogli gametofiti con un raschietto cellulare.
2. Usando un piccolo pestello di plastica, schiacciare i gametofiti raccolti in un tubo da 1,5 ml in pezzi a 4-5 celle.
3. Riempire il tubo con 1 mL NSW1/2 (passo 1.9).
4. Aggiungere 2,5 μL della soluzione di gametofita frantumata in 3 mL di acqua di mare naturale arricchita con 1x soluzione di Provasoli (NSW) e metterli in una capsula di Petri.
   NOTA: una capsula di Petri con fondo di vetro da 25 mm è consigliata per una più facile manipolazione.
5. Mettere i piatti preparati in un armadietto di coltura e indurre la gametogenesi a 13 °C sotto luce bianca con un'intensità di 24 μE.m-2.s-1 (luce fioca, fotoperiodo 16:8 L:D).
   NOTA: La prima gametangia (oogonia femminile e archegonia maschile) può essere osservata dopo 5 giorni. Il maschio è iper-ramificato con piccole cellule, e la femmina è composta da cellule più grandi che formano lunghi filamenti^15,22. Le prime uova vengono osservate ~ 10 giorni dopo e la prima divisione degli zigoti di solito avviene entro i successivi 2 giorni.
6. Sei giorni dopo aver osservato le prime uova, trasferire i piatti in condizioni di luce bianca più brillante: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D, ancora a 13 °C.

3. Acquisizione di immagini per la selezione degli embrioni per l'ablazione e il monitoraggio della crescita successiva

1. Immagine dell'intera capsula di Petri per (ri)localizzare gli embrioni selezionati durante la fase di ablazione (non è necessario restituire il piatto al microscopio oculare) e monitorare il successivo sviluppo degli embrioni selezionati.
   NOTA: utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita (vedere Tabella dei materiali) per l'imaging (Figura 1) e l'ablazione laser è descritta nel passaggio 5.
2. Posiziona la capsula di Petri sul palco e orientala con un segno visivo (ad esempio, disegna una linea con un pennarello permanente).
3. Usa l'obiettivo 10x/0.45 per concentrarti su un embrione. Registrare la posizione dei quattro punti cardinali della capsula di Petri.
4. Avviare la scansione dei riquadri. Acquisisci immagini trasmesse/fluorescenti dell'intera capsula di Petri a bassa risoluzione: 256 x 256 pixel, un tempo di permanenza in pixel di 1,54 μs con scansione bidirezionale e uno zoom digitale di 0,6x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dell'1,2%.
   NOTA: il tempo di scansione per un'intera capsula di Petri da 2,5 cm è di ~ 6 minuti per 225 tessere (Figura 2). Qui, il laser a 561 nm è stato utilizzato per la trasmissione e l'imaging a fluorescenza. Il segnale di fluorescenza è stato raccolto tra 580-720 nm sui fotomoltiplicatori confocali (PMT) e la luce trasmessa è stata raccolta sul PMT trasmesso. Il laser a 561 nm può anche monitorare la clorofilla in questa fase, ma non è necessario perché aiuta solo a distinguere correttamente il rumore del segnale e gli organismi.
5. Salvare l'immagine di scansione dei riquadri e tenerla aperta nella finestra del software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali).
6. Cambia l'obiettivo, non rimuovere la capsula di Petri.
   NOTA: l'obiettivo acqua 40x/1.2 è stato spostato sul lato dello stadio in modo che il mezzo di immersione (acqua) potesse essere aggiunto all'obiettivo senza spostare la capsula di Petri dalla sua posizione iniziale.
7. Naviga attraverso l'immagine di scansione delle tessere acquisita in precedenza per selezionare l'embrione appropriato. Una volta che un embrione è stato identificato su questa immagine, spostare lo stadio nella posizione esatta dell'embrione e acquisire immagini trasmesse / fluorescenti di quell'embrione ad alta risoluzione.
   NOTA: impostazioni ad alta risoluzione: 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel di tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dello 0,9%.
8. Annotare l'immagine di scansione delle tessere per ogni embrione candidato all'ablazione laser (Figura 2B) e procedere alla fase di ablazione laser.

4. Calibrazione laser

1. Calibrare il laser e sincronizzare il software di acquisizione delle immagini con il software del driver laser nella modalità "Click & Fire" e un laser pulsato a 355 nm.
   NOTA: questo passaggio è fondamentale per garantire una perfetta sincronizzazione tra la posizione del cursore del mouse nel software del driver laser (vedere Tabella dei materiali) con la posizione nell'immagine live del software di acquisizione.
2. Aprire il pacchetto software laser-driver e fare clic su Live nel pacchetto software di acquisizione immagini.
3. Sincronizzare entrambi i pacchetti software facendo clic su Avvia acquisizione nel pacchetto software laser-driver. L'immagine dal vivo viene ora registrata anche nel software del driver laser UV.
4. Definisci un'area di interesse (AOI) facendo clic sul pulsante Scegli AOI e facendo clic sui bordi dell'immagine (destra, sinistra, in alto e in basso) nel pacchetto software del driver laser UV.
   NOTA: dopo questa fase di calibrazione, le impostazioni per la dimensione dei pixel, il formato dell'immagine e lo zoom nel pacchetto software di acquisizione devono rimanere costanti.
5. Selezionare un'area vuota sul piatto e abbassare il livello dello stadio a 20 μm sotto il piano focale del campione per mettere a fuoco il fondo di vetro.
6. Impostare il laser di ablazione e le traiettorie laser di imaging facendo clic su Avvia calibrazione e scegliere Calibrazione manuale.
7. Selezionare una potenza laser sufficientemente alta da vedere un punto nero al centro dell'immagine dal vivo corrispondente al foro nel coperchio di vetro (tutte le persiane devono essere aperte).
8. Clicca su questo punto nero centrale con il cursore del mouse e clicca su 18 punti aggiuntivi proposti dal software per completare la procedura di allineamento.
9. Controllare la calibrazione nella "modalità Click & Fire" sullo stesso coverslip.
   NOTA: la calibrazione laser dipende dai parametri di imaging. Una volta calibrato il laser, assicurarsi che i parametri di imaging (ad esempio, 512 x 512 pixel, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x) non siano cambiati.

5. Ablazione laser

1. Seleziona un embrione di interesse. Avviare una registrazione time-lapse nel software di acquisizione delle immagini.
2. Acquisire immagini trasmesse/fluorescenza con un obiettivo 40x/1,2 W ad alta risoluzione (cioè 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel dwell time con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione allo 0,9%). Acquisisci la registrazione time-lapse alla massima velocità.
3. Eseguire lo zoom indietro dell'area all'inizio della registrazione time-lapse. Ingrandire l'AOI.
4. Utilizzare la funzione "Click & Fire" del software laser-driver per applicare l'irradiazione dannosa sulla cellula di interesse nell'embrione. Utilizzare i seguenti parametri: trasmissione laser al 45% (corrispondente a un massimo di 40 μW) e durata dell'impulso di 1 ms (fase 4).
   NOTA: si consiglia la registrazione video durante la ripresa laser.
5. Sotto 688 nm, monitorare l'espulsione di cloroplasti autofluorescenti dal citoplasma.
6. Se il contenuto della cella rimane nella cella, utilizzare nuovamente la funzione "Click & Fire" per aumentare le dimensioni della violazione nella cella. Ripetere, mantenendo il numero di scatti al minimo fino a quando la maggior parte del contenuto della cella non è stata rilasciata.
7. Interrompere la registrazione del time-lapse dopo che l'embrione si è stabilizzato (cioè, non è possibile rilevare ulteriori movimenti intracellulari (~ 1-5 min).
8. Aggiornare l'annotazione sull'immagine di scansione dei riquadri, se necessario.

6. Monitoraggio della crescita degli embrioni irradiati

NOTA: il monitoraggio viene effettuato per diversi giorni.

1. Determinare il tasso di sopravvivenza monitorando il numero di embrioni che si sviluppano dopo l'ablazione laser e confrontarli con quelli che muoiono.
   NOTA: Alcuni embrioni muoiono immediatamente dopo l'ablazione per vari motivi. Un tasso di mortalità elevato e rapido è di solito un segno di parametri laser inappropriati o di un'esposizione più alta / più lunga allo stress durante l'esperimento o il successivo trasporto.
2. Determinare il ritardo di crescita misurando la lunghezza degli embrioni sparati al laser ogni giorno e confrontandolo con embrioni intatti.
   NOTA: Il tasso di crescita degli organismi laser-shot è generalmente più lento di quello degli organismi non trattati. Tuttavia, alcune impostazioni laser (inappropriate) possono inibire la crescita per più di una settimana, con la crescita che riprende dopo.
3. Scopri il danno adiacente monitorando la reazione delle cellule adiacenti alle cellule ablate. In alcuni casi, la depressurizzazione post-scoppio può causare lo scoppio delle cellule vicine.
4. Verificare la presenza di contaminazioni da microbi. Monitorare la crescita di microalghe e batteri nel mezzo. Se nel piatto è presente un livello insolito di microbi, scartarlo e ripetere il protocollo dal passaggio 2 o dal passaggio 3.
   NOTA: Dopo l'ablazione laser, gli embrioni di S. latissima danneggiati sono già molto stressati e ulteriori stress esterni possono causare un aumento della mortalità. Focolai batterici o virali sono possibili perché gli embrioni trattati non possono crescere in condizioni astoniche.
5. Controllare lo sviluppo globale degli organismi shot studiando il fenotipo e comprendendo il ruolo nello sviluppo della regione bersaglio.

Risultati

I gametofiti di S. latissima sono stati coltivati e la gametogenesi è stata indotta a produrre zigoti ed embrioni. Dodici giorni dopo l'induzione della gametogenesi, gli embrioni sono stati sottoposti ad ablazione laser. Qui, l'esperimento mirava a valutare il ruolo di cellule specifiche nello sviluppo complessivo degli embrioni di S. latissima . La cellula più apicale, la cellula più basale e le cellule mediane sono state prese di mira. Dopo la scansione delle piastrelle, l'intera capsula di Petri (...

Discussione

L'ablazione laser cellulare locale consente l'ablazione temporale e spaziale con un alto livello di precisione. Tuttavia, la sua efficienza può essere ostacolata dalla non accessibilità delle cellule bersaglio; ad esempio, tutte le cellule sono di un embrione tridimensionale. Questo protocollo è stato sviluppato sull'embrione dell'alga Saccharina latissima, che sviluppa una lamina monostrato in cui tutte le cellule possono essere facilmente distinte e distrutte individualmente con un raggio laser.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version