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Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die mikrochirurgischen Schritte zu beschreiben, die erforderlich sind, um eine heterotope Kehlkopftransplantation bei Mäusen durchzuführen. Die Vorteile dieses Mausmodells im Vergleich zu anderen Tiermodellen der Kehlkopftransplantation sind seine Kosteneffizienz und die Verfügbarkeit immunologischer Assays und Daten.
Die heterotope Larynxtransplantation ist zwar ein technisch anspruchsvolles Verfahren, bietet aber im Vergleich zu anderen Tiermodellen mehr wissenschaftliche Analyse und Kostenvorteile. Obwohl diese Technik erstmals 2009 von Shipchandler et al. beschrieben wurde, ist sie nicht weit verbreitet, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten beim Erlernen der mikrochirurgischen Technik und der Zeit, die erforderlich ist, um sie zu beherrschen. Dieses Papier beschreibt die chirurgischen Schritte im Detail sowie mögliche Fallstricke, die es zu vermeiden gilt, um eine effektive Anwendung dieser Technik zu fördern.
In diesem Modell sind die bilateralen Halsschlagadern des Spenderkehlkopfes an die Empfänger-Halsschlagader und die äußere Halsvene anastomosiert, wodurch der Blutfluss durch das Transplantat ermöglicht wird. Der Blutfluss kann intraoperativ durch die Visualisierung der Blutfüllung in den bilateralen Halsschlagadern des Transplantats, der Rötung der Schilddrüsen des Transplantats und der Blutung aus Mikrogefäßen im Transplantat bestätigt werden. Zu den entscheidenden Elementen für den Erfolg gehören die schonende Konservierung der Transplantatgefäße, die richtige Arteriotomie und Venotomie sowie die Verwendung der entsprechenden Anzahl von Nähten an den arteriell-arteriellen und arteriell-venösen Anastomosen, um Gefäße ohne Leckagen zu sichern und Verschlüsse zu verhindern.
Jeder kann dieses Modell mit ausreichender Ausbildung beherrschen und das Verfahren in ca. 3 h durchführen. Bei erfolgreicher Durchführung ermöglicht dieses Modell die einfache und kostengünstige Durchführung immunologischer Studien.
Bei Patienten mit irreparablen Kehlkopfschäden oder Kehlkopfkrebs ist eine totale Laryngektomie oft die einzige Option1. Die totale Laryngektomie lässt Patienten ohne die Fähigkeit, selbstständig zu atmen und zu sprechen, zusätzlich zu sozialer und psychischer Belastung2. Patienten mit Kehlkopfkrebs, die eine totale Laryngektomie benötigen, sind ausgezeichnete potenzielle Kandidaten für eine Kehlkopftransplantation. Während eine menschliche Kehlkopftransplantation im Rahmen irreparabler Kehlkopfschäden durchgeführt wurde, wird bei diesen Patienten derzeit eine Allotransplantation des Kehlkopfes aufgrund der Angst vor einem erneuten Tumorauftreten, der Möglichkeit einer chronischen Abstoßung und von Spendern abgeleiteten Infektionen vermieden3. Immunsuppression ist die Hauptursache für diese Bedenken. Der dramatische Verlust des ersten partiellen Kehlkopftransplantationspatienten aufgrund eines Tumorrezidivs nach konventioneller immunsuppressiver Behandlung ist ein Beweis dafür, dass ein geeignetes immunsuppressives Regime entwickelt werden sollte, bevor weitere Versuche zur Transplantation bei Kehlkopfkrebspatienten unternommen werden 4,5.
Um die Immunantwort des Wirts auf einen transplantierten Kehlkopf besser zu verstehen, wurde 1992 von Strome das erste Kehlkopftransplantationsmodell bei Ratten entwickelt, und 2002 wurden Verbesserungen an der Operationstechnik vorgenommen 6,7. Obwohl dieses Modell für die Untersuchung der Kehlkopftransplantation wirksam ist, führten der Mangel an rattenspezifischen immunologischen Wirkstoffen und die höheren Kosten, die mit Rattenmodellen verbunden sind, 2009 zur Entwicklung eines neuen Mausmodells zur Untersuchung der Kehlkopftransplantation8.
Die Hauptanwendung der beschriebenen Technik besteht darin, verschiedene immunsuppressive Medikamentenregime bei der Kehlkopftransplantation zu untersuchen. Die Verbesserung der derzeitigen immunsuppressiven Therapien könnte den Kandidatenpool erweitern und zu einer sicheren Transplantation bei Krebspatienten führen. Die Vorteile dieses Mausmodells sind seine Kosteneffizienz und die breite Verfügbarkeit immunologischer Daten und Reagenzien.
Teams, die an immunsuppressiven Behandlungsschemata für Kehlkopftransplantationen arbeiten, können diese Methode verwenden, um eine große Menge immunologischer Daten zu sammeln, und verschiedene Medikamentenregime können schnell getestet und verglichen werden. Andere mögliche Behandlungsmodalitäten, die die Immunantwort auf das Transplantat modulieren können, wie Stammzellinjektionen, können ebenfalls mit diesem Modell getestet werden. Schließlich können Experimente entwickelt werden, um langfristige systemische Effekte der Kehlkopftransplantation durch Verlängerung der Nachbeobachtungszeit zu beobachten.
Die hier beschriebene Technik verwendet End-to-Side-Anastomosen, um einen arteriellen und venösen Fluss zu einem heterotopen Kehlkopftransplantat bereitzustellen. Das Transplantat ist ein Laryngotracheoösophageal (LTE) -Komplex, der den Kehlkopf, die Schilddrüsen, die Nebenschilddrüsen, die Luftröhre und die Speiseröhre des Spenders umfasst, wobei die beidseitigen Halsschlagadern und Stiele intakt sind. Eine Spender-Halsschlagader ist zur Empfänger-Halsschlagader anastomosiert und sorgt für den arteriellen Blutfluss, während die andere Spender-Halsschlagader zur äußeren Jugularvene des Empfängers anastomosiert ist und venösen Blutfluss gewährleistet (Abbildung 1).
Mehrere Modifikationen wurden an der Operationstechnik des Rattenmodells vorgenommen, um den Erfolg im Mausmodell sicherzustellen. Zum Beispiel wurde ein inhalatives Anästhetikum anstelle eines injizierbaren Mittels verwendet, um die Kontrolle über die Tiefe der Anästhesie zu erhöhen und Komplikationen zu reduzieren. Kontinuierliches Nähen wird bei der arteriell-arteriellen Anastomose bei Ratten verwendet; Aufgrund der geringeren Größe der Mausgefäße ist dies jedoch technisch schwierig und kann zu einer Verengung des Gefäßlumensführen 7. Dadurch werden im Mausmodell unterbrochene Nähte verwendet, die zu einer verbesserten Gefäßdurchgängigkeit führen. Zusätzlich wird im Rattenmodell der Pedikel der Schilddrüsenarterie superior (STA) seziert und visualisiert. Angesichts der geringeren Größe der STA bei Mäusen könnte diese Dissektion zu einer Schädigung und sogar Durchtrennung der STA führen. Daher wird es im Mausmodell nicht seziert. Stattdessen bleibt die nahe gelegene Faszie erhalten, um sicherzustellen, dass die STA intakt bleibt.
Zu den wichtigsten möglichen Fallstricken dieser Technik gehören die Beschädigung der LTE-Komplexstiele des Spenders, eine falsch dimensionierte Arteriotomie oder Venotomie, ein Gefäßverschluss an den Anastomosestellen oder das Hinterlassen von Lücken an den Anastomosestellen, die Blutungen verursachen können. Um diese Fehltritte zu vermeiden, ist bei der Beschaffung des Spendertransplantats Vorsicht geboten, indem eine Gewebemanschette um den STA-Stiel herum belassen wird. Die Arteriotomie und Venotomie sollte groß genug sein, um den Blutfluss zu ermöglichen, aber klein genug, um ein Auslaufen zu verhindern. Eine angemessene Anzahl von Nähten sollte für die Anastomosen verwendet werden, um Lücken zu schließen, aber nicht zu viele, um die Gefäße zu verschließen.
Wenn Sie mit den mikrochirurgischen Techniken vertraut sind, kann dieses Verfahren in ca. 3 h durchgeführt werden. Dieses Kehlkopftransplantationsmodell kann zuverlässig an Mäusen durchgeführt und zur Untersuchung der Immunantwort des Wirts nach vaskularisierter Komposit-Allotransplantation verwendet werden.
Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. BalbC-Mäuse (10-12 Wochen alt) wurden als Spender verwendet und C57/BL6-Mäuse (10-12 Wochen alt) wurden als Empfänger verwendet, da ihre Haupthistokompatibilitätskomplexe H-2Db bzw. H-2Kb immunologisch inkompatibel sind und daher die Immunantwort auf das Transplantat weiter untersucht werden kann. Alle Instrumente, die während der Operation verwendet wurden, wurden sterilisiert (siehe Ergänzende Abbildung S1 und Ergänzende Abbildung S2), und das Operationsfeld wurde während des gesamten Protokolls gemäß den IACUC-Anweisungen steril gehalten.
1. Spenderchirurgie und Transplantatbeschaffung
2. Transplantatvorbereitung
3. Empfängeroperation und Anastomose der Gefäße
Bestätigung der erfolgreichen Transplantation
Mit dem oben beschriebenen Protokoll ist es möglich, den Blutfluss zum LTE-Komplex zu beurteilen, indem die Pulsation der Spender-Halsschlagader nach Entfernung der Gefäßklemmen beobachtet wird. Die Pulsation ist typischerweise sichtbar, und die sofortige rote Färbung der Spenderarterie bestätigt den aktiven Blutfluss (Abbildung 4A). Wenn die Anastomose nicht wirksam ist, hat die Arterie keine Pulsation, sieht teilweise ...
Die Inzidenz und Prävalenz von Kehlkopfkrebs ist in den letzten drei Jahrzehnten um 12% bzw. 24% gestiegen, und viele dieser Patienten unterziehen sich einer Laryngektomie zur Behandlung10. Dieses Verfahren verschlechtert die Lebensqualität einer Person erheblich, und daher ist eine alternative Behandlung wünschenswert. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation des Kehlkopfes kann die Fähigkeit eines Patienten zu atmen und zu sprechen verbessern; Es ist jedoch noch Forschung erforderlich, b...
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Egehan Salepcis Reise- und Lebenshaltungskosten für die Forschung wurden vom Rat für wissenschaftliche und technologische Forschung der Türkei (TUBITAK) finanziert.
Wir danken Randall Raish für seine hervorragende Videographie und Bearbeitungshilfe.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
DeBakey forceps | |||
Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
Press n' Seal | Glad | 70441 | |
Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
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