Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético

Resumen

Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.

Resumen

La exploración del potencial terapéutico de las células madre mesenquimales depende de la facilidad de aislamiento, la potencia hacia la diferenciación y la confiabilidad y robustez de la fuente. Describimos aquí un protocolo gradual para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano (uMSC), su inmunofenotipado y la propagación de dichos cultivos en varios pasajes. En este procedimiento, la viabilidad de las uMSCs es alta porque no hay digestión enzimática. Además, la eliminación de los vasos sanguíneos, incluidas las arterias del cordón umbilical y la vena, garantiza que no haya contaminación de las células de origen endotelial. Usando citometría de flujo, las uMSCs tras el aislamiento son CD45⁻CD34⁻, lo que indica una ausencia de células del linaje hematopoyético. Es importante destacar que expresan marcadores de superficie clave, CD105, CD90 y CD73. Tras el establecimiento de cultivos, este artículo describe un método eficiente para inducir la diferenciación en estas uMSC en el linaje del músculo esquelético. Un análisis detallado de la progresión miogénica en uMSCs diferenciadas revela que las uMSCs expresan Pax7, un marcador para progenitores miogénicos en las etapas iniciales de diferenciación, seguido de la expresión de MyoD y Myf5, y, finalmente, un marcador de diferenciación terminal, la cadena pesada de miosina (MyHC).

Introducción

Se ha acreditado que el cordón umbilical humano posee un reservorio robusto de células madre mesenquimales, que actualmente se están explorando para terapias regenerativas debido a sus robustas tasas de proliferación y diferenciación, propiedades inmunomoduladoras y capacidad para generar células a partir de las tres capas germinales¹. El tejido del cordón umbilical consta de múltiples compartimentos como la sangre del cordón umbilical, el subendotelio de la vena umbilical y la gelatina de Wharton (WJ), que en sí misma abarca tres regiones indistintas: la zona perivascular, la zona intervascular y el subamnio o el revestimiento del cordón umbilical (CL)². Si bien las uMSC pueden aislarse de todas estas regiones diferentes y expresar ampliamente los marcadores clave de MSC, no hay claridad sobre si estos compartimentos contienen la misma población de uMSC o muestran diferencias en sus potencias de diferenciación³. Por lo tanto, los protocolos para el aislamiento de uMSC requieren una mayor precisión en su modo y región de aislamiento, la caracterización robusta de los potenciales de diferenciación y, finalmente, un análisis comparativo de diferentes compartimentos del cordón.

En este contexto, pocos estudios han demostrado diferencias en los potenciales proliferativos y diferenciativos de uMSC entre las diferentes partes del cordón. De estos, los análisis comparativos entre uMSCs aislados de las regiones CL y WJ revelaron un mayor potencial proliferativo en uMSCs derivados de CL ^3,4. En un estudio separado, las uMSC derivadas de WJ tuvieron un mejor desempeño en los ensayos de proliferación en comparación con las células perivasculares (HUCPV)⁵. Al examinar las diferencias entre las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical y las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical desprovistas de contaminación vascular, se informó la expresión diferencial de los marcadores clave de MSC entre los dos compartimentos, así como el aumento de las tasas de proliferación en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical⁶.

De los varios estudios que examinan los potenciales de diferenciación de las uMSC principalmente en tejidos del linaje mesodermo, como los linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos, muy pocos han proporcionado protocolos detallados para la diferenciación miogénica y la caracterización posterior, así como análisis comparativos entre varios compartimentos del cordón umbilical. En este contexto, hemos desarrollado un protocolo robusto de diferenciación muscular y hemos observado que las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical muestran capacidades de diferenciación miogénica superiores en comparación con la sangre del cordón umbilical⁶. Aquí, se detalla un protocolo paso a paso para el aislamiento de uMSC de todo el tejido del cordón umbilical desprovisto de células asociadas con la vasculatura, su caracterización y su diferenciación en el linaje miogénico.

Protocolo

El uso de tejido del cordón umbilical en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCR), el Comité de Ética Institucional, el Instituto traslacional de Ciencia y Tecnología de la Salud (IEC-THSTI), el Comité de Ética Institucional del Hospital Civil, Gurugram, Haryana, y el Comité Institucional de Bioseguridad, THSTI. Las muestras de tejido del cordón humano se recolectaron de partos a término en el momento del nacimiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. Todos los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices y reglamentos pertinentes.

1. Aislamiento de las MSC del tejido del cordón umbilical

1. En el momento del parto, corte al menos 5 cm de cordón, preferiblemente más cerca de la placenta, y esterilize el cordón frotando la superficie externa con etanol al 70%. Transfiera el pedazo de tejido del cordón umbilical secuencialmente de un tubo de recolección de 50 ml que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) a otro que contiene el mismo. Transportar el tubo de recolección que lleva el nombre del sujeto en hielo al laboratorio dentro de 1 h.
   NOTA: Para un estudio más amplio, podría ser útil codificar las muestras para permitir su seguimiento a lo largo del estudio. Es importante destacar que a todo el personal que maneja tejidos humanos se le debe ofrecer el régimen completo de la vacuna contra la hepatitis B.
2. En el laboratorio, encienda los rayos UV durante 25 minutos en la campana BSL-2 para esterilizar los instrumentos y pipetas en autoclave antes de su uso.
3. Transfiera la pieza de tejido del cordón umbilical del tubo de recolección a un plato tratado con cultivo de tejido de 10 cm² que contenga PBS enriquecido con 5 g/L de glucosa, 50 μg/ml de gentamicina, 2,5 μg/ml de anfotericina B, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (esquemático de la Figura 1).
4. Usando un bisturí, corte el tejido del cordón verticalmente a lo largo de su eje longitudinal para obtener dos piezas medio cilíndricas. Debido a la torsión del cordón umbilical y la superficie mucoide, fije el tejido con un par de fórceps sostenidos en la otra mano.
5. En este punto, observe las arterias umbilicales y la vena y retire los vasos sanguíneos usando un bisturí para rasparlos en una dirección desde la superficie. Enjuague el tejido del cordón umbilical una vez más en PBS para eliminar toda la sangre residual asociada con el tejido. Asegúrese de que el raspado sea suave para preservar la integridad de las células en el WJ que rodea los vasos.
6. Picar cada mitad del tejido del cordón en fragmentos de 0,5 cm^{de tamaño 3} y colocar los fragmentos con la superficie luminal hacia abajo en el plato. Incubar el plato brevemente durante 10 min en una cámara humidificada a 37 °C que contenga un 5% de CO₂.
7. Después de la incubación, inunde el plato que contiene los trozos de tejido del cordón umbilical con 20 ml de medio que contenga MEM Alpha Modification sin L-glutamina, ribo- y desoxirribonucleósidos, suero bovino fetal al 15% (no inactivado por calor) y 50 μg / ml de gentamicina. Agregue el medio de crecimiento suavemente a lo largo de los lados para evitar que los explantes de tejido se desalojen de su orientación. Agregue el exceso de medio para dar cuenta de una fracción que será absorbida por los explantes de tejido durante la incubación.
8. Después de 3 días de incubación, agregue medio fresco a los cultivos. Asegúrese de que los cultivos estén protegidos de los golpes y el movimiento de los explantes mientras manipula los platos.
9. Después de 1 semana, retire los fragmentos de tejido individualmente usando fórceps estériles y deseche usando bolsas de riesgo biológico apropiadas para su eliminación. Conserve el medio existente y agregue 10 ml de medio de crecimiento fresco. Reemplace el medio de crecimiento cada 4 días hasta que las colonias individuales alcancen una confluencia del 70%.
   NOTA: Es probable que las células no se distribuyan uniformemente en todo el plato, ya que habrá colonias proliferativas individuales que deben ser monitoreadas para la confluencia con el tiempo. Generalmente, dentro de un mes, un plato de 10 cm² genera suficientes células para dividirse en un plato separado.
10. Cosechar las células adherentes usando solución de tripsina/EDTA (1x 0.25% de tripsina y 0.02% de EDTA en Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar la suspensión celular a 470 × g durante 5 min a 25 °C y resuspendir el pellet celular en medio de crecimiento.

2. Inmunofenotipado y propagación de uMSCS

1. Proceder al inmunofenotipado una vez que las células adherentes hayan alcanzado un 50%-60% de confluencia y estén bien diseminadas. No realice análisis de marcadores MSC en cultivos totalmente confluentes, ya que esto tiende a causar una regulación a la baja de los marcadores MSC clave.
2. Después de la tripsinización, distribuya una suspensión celular de 1 × 10⁶ células/ml en tubos FACS (1 × 10⁵ células/tubo) y tiñe con anticuerpos adecuados ligados a fluoróforos (todos dilución 1:50) en combinación: sin teñir; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo común); controles de isotipo para cada fluoróforo. Registre un número total de eventos de al menos 10,000 en el citómetro de flujo para su posterior análisis.
   NOTA: Dado que las celdas se analizan para cada marcador de superficie por separado, no es necesario cerrar los subconjuntos de celdas.
3. Además de los marcadores anteriores, confirme la presencia de marcadores de superficie positivos y negativos en las líneas uMSC creadas a partir de muestras individuales de tejido del cordón umbilical (Tabla 1).
4. Analizar las células marcadas por citometría de flujo y determinar el porcentaje de células CD105⁺CD90⁺ y CD105⁺CD73⁺ . Analice las células CD105⁺ y CD34⁻CD45⁻ por separado.

3. Diferenciación de uMSCs en músculo esquelético

1. Recubrir las placas de cultivo de tejidos con 0,01% de colágeno y 20 μg/ml de laminina en PBS. Cubra estas placas durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente.
2. Placa uMSCs a una densidad de 10.000 células/cm² en medio de crecimiento.
3. Cuando las células sean 70% confluentes, aspire el medio de crecimiento y enjuague los cultivos 2x con PBS. Añadir medio de diferenciación miogénica (M1) compuesto por DMEM + 5% de suero de caballo + 0,1 μM de dexametasona + 50 μM de hidrocortisona a las uMSCs. Para la determinación de la cinética de la progresión miogénica, agregue medio M1 cada dos días a los cultivos.
4. Para determinar la cinética de la progresión miogénica, analice las uMSC para la expresión de Pax7, MyoD, Myogenin y MyHC a los 2 días, 4-5 días, 6-7 días y 10-14 días, respectivamente.

Resultados

El éxito del aislamiento de las uMSC del tejido del cordón umbilical es del >95%, a diferencia de las bajas tasas de éxito de la sangre total del cordón umbilical. Tras el aislamiento exitoso de las uMSC, el análisis FACS revela que todas las células son CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. Sin embargo, en el análisis comparativo, las uMSC aisladas de la sangre del cordón umbilical muestran poblaciones heterogéneas, en las que una proporción de células muestra CD34 ⁺

Discusión

Pasos críticos
Un paso crítico en este protocolo es la recolección de tejido en condiciones asépticas, desde el momento de la entrega hasta el mantenimiento de cultivos estériles, durante toda la propagación. Durante la recolección del cordón, es esencial que el cordón no toque ninguna superficie no esterilizada y se frote externamente con etanol al 70% antes de la recolección en tubos que contengan PBS suplementado con antibióticos. Es importante limitar el tiempo entre la recolección del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL