Tam Kalınlıkta Kutanöz Termal Yanık ve Enfeksiyonu İncelemek için Sıçan Yanık Modeli

Özet

Yanık hasarı ve enfeksiyonunun klinik senaryosunu taklit eden bir model, yanık araştırmalarını ilerletmek için gereklidir. Mevcut protokol, insanlardakiyle karşılaştırılabilir basit ve tekrarlanabilir bir sıçan yanığı enfeksiyon modeli göstermektedir. Bu, yeni topikal antibiyotik tedavileri geliştirmek için yanık ve yanık sonrası enfeksiyonların incelenmesini kolaylaştırır.

Özet

Yanık indüksiyon metodolojileri sıçan modellerinde tutarsız bir şekilde tanımlanmıştır. Klinik senaryoyu temsil eden tek tip bir yanık yara modeli, tekrarlanabilir yanık araştırması yapmak için gereklidir. Mevcut protokol, sıçanlarda ~% 20 toplam vücut yüzey alanı (TBSA) tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlamaktadır. Burada, yanık yaralanmasını indüklemek için sıçan derisi yüzeyine bir su banyosunda 97 ° C'de ısıtılan^{22.89 cm2} (5.4 cm çapında) bakır çubuk uygulanmıştır. Yüksek ısı iletkenliğine sahip bir bakır çubuk, tam kalınlıkta bir yanık oluşturmak için ısıyı cilt dokusunda daha derine dağıtabildi. Histoloji analizi, dermisin ve deri altı dokusunun tam kalınlık derecesine pıhtılaştırıcı hasar veren zayıflatılmış epidermisi gösterir. Ek olarak, bu model immün disregülasyon ve bakteriyel enfeksiyonlar gibi yanık yaralanmasını takiben hastanede yatan yanık hastalarında gözlenen klinik durumları temsil etmektedir. Model, hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriler tarafından sistemik bakteriyel enfeksiyonu özetleyebilir. Sonuç olarak, bu yazıda, yanık yarası ve enfeksiyonlar için yeni topikal antibiyotik ilaçların geliştirilmesinde önemli yarar sağlayan, immün disregülasyon ve bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere klinik durumları taklit eden, öğrenmesi kolay ve sağlam bir sıçan yanığı modeli sunulmaktadır.

Giriş

Yanık yaralanmaları travmanın en yıkıcı biçimleri arasındadır ve ölüm oranları özel yanık merkezlerinde bile %12'ye ulaşmaktadır ^1,2,3. Son zamanlarda yayınlanan raporlara göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda ~ 486.000 yanık hastası tıbbi bakıma ihtiyaç duyuyor ve yaklaşık 3.500 ölüm 1,2,3,4,5,6. Yanık yaralanması, hastaların bağışıklık sistemi için büyük bir zorluk oluşturur ve iyileşmesi yavaş olan önemli bir açık yara oluşturur ve onları nozokomiyal, fırsatçı bakterilerle kutanöz, pulmoner ve sistemik kolonizasyona duyarlı hale getirir. Bakteriyel enfeksiyon ile birlikte immün disregülasyon yanık hastalarında artmış morbidite ve mortalite ile ilişkilidir⁷.

Bir hayvan yanığı ve enfeksiyon modeli, deri hasarı ve yanık travması ile ilişkili immün baskılanmayı takiben bakteriyel enfeksiyonların patogenezini incelemek için gereklidir. Bu tür modeller, yanık hastalarında bakteriyel enfeksiyonların tedavisi için yeni yöntemlerin tasarlanmasını ve değerlendirilmesini sağlar. Sıçanlar ve insanlar, daha önce belgelenen benzer cilt fizyolojik ve patolojik özelliklerini paylaşırlar⁸. Ek olarak, sıçanların boyutu daha küçüktür, bu da onları daha büyük hayvan modellerinden daha kolay, daha uygun fiyatlı ve tedarik edilmesi ve bakımı daha kolay hale getirir.

Bu özellikler, sıçanları yanıkları ve enfeksiyonları incelemek için ideal bir model hayvan yapar⁹. Ne yazık ki, yanık indüksiyonu tekniği tutarsızdır ve genellikle minimal olarak tanımlanmıştır 10,11,12,13,14. Mevcut protokol, klinik senaryoyu simüle eden ve bağışıklık baskılanmasını ve bakteriyel enfeksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek bir sıçan modelinde tutarlı bir tam kalınlıkta yanık hasarı oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir prosedür geliştirmek üzere tasarlanmıştır.

Protokol

Tüm prosedürler, Kuzey Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve belirlenen yönergelere uygun olarak yürütüldü. Deneyler için 7-9 haftalık erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanları (250-300 g) kullanıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve su ad libitumuna serbest erişim ile 12 saat: 12 saat açık-karanlık döngüsünde barındırıldı. Çalışmaya başlamadan önce her zaman kurumsal veterinerinizle birlikte analjezik bir plan hakkında çalışın.

1. Sıçanları yanık yaralanması için hazırlama

1. Hayvanları yanıktan 24 saat önce yanık yaralanmasına hazırlayın.
2. Sıçanı, solunum yavaşlayana kadar bir indüksiyon odasında% 100 oksijende% 5 izofluran ile 5 dakika (akış hızı: 2 L / dak) anestezi yapın.
3. Sıçan derinlemesine uyuşturulduktan sonra (tüm uzuvlarda ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermez), sıçanı yüzüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına doğru hareket ettirin ve izofluranı bir burun konisinden bakım için oksijende% 1.5'e düşürün.
4. Anesteziden sonra ve işlem sırasında korneanın kurumasını önlemek için, pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak her iki gözün kornealarına göz kayganlaştırıcısı uygulayın.
5. Sıçanın sırt bölgesini elektrikli bir makas makinesi kullanarak tıraş edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve omuz bıçaklarından kuyruğun tabanına kadar büyük bir dikdörtgen halinde mümkün olduğunca fazla kılı çıkarın (Şekil 2A).
6. Gevşek tüyleri silmek için tıraş edilen bölgeyi tuzlu suya batırılmış bir mendille temizleyin. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak tıraş edilen bölgeye epilasyon losyonu uygulayın ve ~ 3 dakika bekletin.
   NOT: Referans alınan epilasyon losyonunun 3 dakikadan fazla uygulanması ciltte kırmızı döküntülere neden olacaktır.
7. Losyonu çıkarmak ve cilt tahrişini önlemek için bölgeyi iki kez ıslak gazlı bez süngerle silin.
8. İzofluranı kapatın, burun konisini çıkarın ve sıçanı kurtarma kafesine yerleştirin.
   NOT: Kurtarma kafesine bir ısıtma yastığı yerleştirin.
9. Ertesi günün yanık prosedürü için kurtarılan hayvanı temiz bir muhafaza kafesine aktarın (sıçanın anesteziden iyileşmesi ~ 10-15 dakika sürebilir).

2. Sıçanlarda yanık yaralanmasına neden olmak

1. Yanma gününde, su banyosu sıcaklığını 97 ° C'ye ayarlayın ve dört bakır çubuğun tümünü yerleştirin (her biri 420 g; Şekil 1) Çubukların düzgün bir şekilde ısınmasına izin vermek için yanma deneyinden 1 saat önce su banyosunda.
   NOT: Çubuklar suya batırılmalıdır. Deneyden önce bir termometre kullanarak dijital sıcaklık göstergesinin doğruluğunu kontrol edin.
2. Bölüm 1'de belirtildiği gibi sıçanı anestezi altına alın.
3. Sıçan tüm uzuvlarda ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğinde, bakım için oksijende% 1.5 izofluran ile eğilimli bir konumda bir ısıtma yastığına yerleştirin (Şekil 2A).
4. Ağrı yönetimi için intraperitoneal (i.p.) yoldan morfin ( 20 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin⁶.
5. Su banyosundaki suyun sıcaklığını kontrol edin. Zamanlayıcıyı ayarlayın ve ısıya dayanıklı eldivenleri giyin.
6. Su banyosundan ısıtılmış bir bakır çubuğu çıkarın ve yanığı indüklemek için sıçanın dorsum bölgesine 7 s dokunun.
   NOT: Isı kaybını en aza indirmek için su banyosu ile hayvan arasında minimum bir mesafe (10-15 cm) tutun ve yanığı indüklerken çubuklara baskı uygulamayın (yani, temas yerçekimi ile korunmalıdır).
7. Yanık bölgesi başına bir çubuk kullanarak, yaklaşık% 20 TBSA tam temaslı yanık üretmek için birbiri ardına dört yanık uygulayın (Şekil 2B).
8. Yanıktan sonra, laktasyonlu Ringer çözeltisinin (0.1 mL / g vücut ağırlığı) i.p. enjeksiyonu ile hayvanı yeniden canlandırın.
   NOT: Sıçanları canlandırmak için vücut ısısı ayarlı laktasyonlu bir zil çözeltisi kullanın.
9. İzofluranı kapatın, burun konisini çıkarın ve sıçanı iyileşme için ısı paspasının üzerine yerleştirin.

3. Bakteriyel inokulum ve enfeksiyonun hazırlanması

1. Pseudomonas aeruginosa PAO1 ve Staphylococcus aureu'nunATCC25923'ün dondurulmuş örneğini, yanık deneyinden 2 gün önce Muller Hinton Agar (MHA) plakalarına çizin.
2. Ertesi gün, plakadan tek bir yetişkin bakteri kolonisi seçin ve bir aşılama döngüsü kullanarak, plakadan hafifçe kazıyın. Daha sonra, 10 mL Muller Hinton Suyu (MHB) ve kültürü bir inkübatör çalkalayıcıda 37 ° C'de gece boyunca aşılamak için kültür tüpüne yerleştirin.
3. Yanık ve enfeksiyon gününde, kültürü 5 dakika boyunca 4.000 × g'de santrifüj yapın. Pelet normal salin (% 0.9 NaCl çözeltisi) ile yıkayın.
4. Bakteriyel peleti tuzlu suda yeniden askıya alın ve 0.1 OD 600nm'ye kadar seyreltin (₆₀₀ nm'de optik yoğunluk). Bu bakteriyel süspansiyonun 200 μL'sini alarak ve istenen 2 × 10⁷ CFU / mL'lik bakteriyel inokulumu elde etmek için 800 μL salin ile karıştırarak bakteriyel inokülumu seyreltin.
5. Önceki adımda hazırlanan 50 μL P. aeruginosa veya S. aureu'nun inokülumunu(enfeksiyon dozu 1 × 10⁶ CFU) yanıktan 15 dakika sonra anestezi altına alın, yanık yarasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde deri altından 29 G'lık bir iğne kullanarak enjekte edin.
6. Yanık yarasını enfekte ettikten sonra, sıçanı iyileşme için ısıtma yastığına yerleştirin. Hayvan iyileştikten sonra (~ 15-20 dakika), temiz bir kafeste saklayın.
   NOT: Yanık yaralanmasından sonra, kafes başına bir sıçan barındırın. Kolay çiğneme için su ıslak yiyecek peletleri kullanın ve kolay erişim için kafes zeminine yerleştirin.
7. Ağrı yönetimi için kafesteki su şişelerini morfin çivili suyla (0.4 mg / mL) doldurun.
   NOT: Oral Morfin, insan yanığı hastalarındaki klinik durumu yansıtır. Bu çalışma, birçok kez veteriner personeline danıştıktan sonra bu deneyleri insan yanığı hastalarıyla karşılaştırılabilir tutmak için oral morfin kullanmıştır. Deney boyunca içme ve kilo günlükleri tutuldu. Tüm prosedürler sırasında aynı içme sistemini kullanın. Buprenorfin gibi diğer analjezikler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına göre deri altından / intraperitoneal olarak uygulanabilir.
8. İzleme kontrol listesini doldurun ve deney boyunca hayvanları sıkıntı veya hastalık açısından yakından izleyin.

4. Yanık yaralanmasının değerlendirilmesi

1. Yanık yaralanmasından hemen sonra deri yanığı yaralanmasını morfolojik olarak renk ve marj açısından değerlendirin.
2. Yanık yarasının yapısını ve epitel boşluğunu görselleştirmek için yanmış cildi hematoksilin ve eozin (H&E) ile lekeleyin¹⁵ (numune işleme için bkz. adım 5.6).

5. Sıçan örneklerinin sonradan işlenmesi ve bakteri sayımı

1. Sıçanı aşırı dozda anestezi ile yanma sonrası 24, 48 ve 72 saatte ötenazileştirin.
2. Kardiyak ponksiyon yoluyla sıçanlardan kan örnekleri alın ve bunları mini bir toplama tüpünde toplayın.
   1. Yanık indüksiyonunun konakçı bağışıklık sistemi üzerindeki etkisini belirlemek için kan örneklerinden tam kan sayımlarını analiz edin.
3. Ötanazi sırasında cilt, deri altı dokusu, kas, akciğer ve dalak toplayın.
   NOT: H&E boyama için cildin bir kısmını (~1 cm × 1 cm; ~200-300 mg ağırlığında) ve bakteriyel numaralandırma için başka bir kısmını saklayın.
4. Dokuları 10 mL'lik bir toplama tüpünde toplayın ve bakteri sayımı için buz üzerinde normal saline yerleştirin.
5. Doku ağırlığını normal salin ile normalleştirin ve bir doku homojenizatörü kullanarak numuneleri homojenleştirin (bkz.
   1. Doku homojenatlarını normal salinle seri olarak seyreltin.
   2. P. aeruginosa ile enfekte sıçanlardan toplanan örnekler için setrimidli agar plakaları üzerindeki her doku örneğinin seyreltilmemiş homojenatının plakası ve her doku örneğinin tüm seyreltimlerinin plakaları 100 μL'dir.
      NOT: S. aureus ile enfekte olmuş sıçanlardan toplanan numuneleri kaplamak için mannitol agar plakaları kullanın.
   3. Plakaları 37 ° C'de bir inkübatörde 16-18 saat boyunca inkübe edin.
   4. Ertesi gün, plakalardaki bakteri kolonilerini sayın, CFU / mL sayısını elde etmek için seyreltme oranıyla çarpın ve CFU / g dokusunu hesaplamak için dokunun ağırlığı ile normalleştirin.
   5. Farklı organlardaki bakteri sayımlarını farklı örnekleme zaman noktalarında çizmek için veri analiz yazılımı kullanın.
6. Yara yapısını ve epitel boşluğunu görselleştirmek için yanmış cildin H&E boyamasını gerçekleştirin.
   1. Makas ve dişli forseps kullanarak, yanık bölgesinden 1 cm x 1 cm'lik bir cilt yamasını kesin ve oda sıcaklığında 48 saat boyunca bir fiksatif (% 10 nötr tamponlu formalin, NBF) içine daldırın.
      NOT: Tüm dokuların fiksatif içine tamamen daldırıldığından emin olmak için kabı döndürün, fiksatif hacmi doku hacminin 30 katıdır.
   2. Cilt dokusunu oda sıcaklığında 72 saat boyunca% 70 (v / v) etanol ile dehidre edin.
   3. Bölümleri kesmek ve H&E 15 ile lekelemek için kurumuş numuneleri parafin bloklarda^işleyin.
   4. 40x objektif kullanarak lekeli slaytları bir slayt tarayıcıda dijital olarak görüntüleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   5. Taranan görüntüyü yazılım kullanarak analiz edin (analiz için görüntünün işlenmesi için Ek Dosya 1'e bakın; Malzeme Tablosu'na bakın).
   6. Epidermis, dermis, deri altı dokusu ve iskelet kasının durumunu değerlendirmek için lekeli cilt bölümünün tüm alanlarını inceleyin.

Sonuçlar

Burada sunulan protokol oldukça tekrarlanabilir ve sıçanlarda üçüncü derece, tam kalınlıkta yanık hasarı ile sonuçlanmıştır. Yanık indüksiyonundan sonra yanık yarası mumsu beyaz görünür (Şekil 2B). Yanık yaralanmasının rengi, 72 saatlik yanma sonrası boyunca beyazdan kahverengiye değişmiştir (Şekil 2B-E).

Histolojik analiz, tam kalınlıkta bir yanığı doğruladı (der...

Tartışmalar

Yanık yaralanmasının patofizyolojisini incelemek için çeşitli yanık modelleri sunulmuştur 8,12,16,17. Bu çalışmada, hastalarda enfekte bir yanık travmasını simüle etmek için tam kalınlıkta bir yanığı indüklemek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmek için bir sıçan modeli kullandık. İnsan koşullarını taklit etmek için hayvan modeli olarak sıçan?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm