Анализ синовиальной жидкости для выявления остеоартроза

Резюме

Анализ синовиальной жидкости при проходящей, поляризованной и компенсированной световой микроскопии используется для оценки воспалительной или невоспалительной природы образца с помощью простых шагов. Это особенно полезно при остеоартрите для обнаружения кристаллов кальция и выявления более тяжелой подгруппы остеоартрита.

Аннотация

Анализ синовиальной жидкости (СФ) важен для диагностики остеоартрита (ОА). Макроскопические и микроскопические признаки, включая общее и дифференциальное количество лейкоцитов (WBC), помогают определить невоспалительную природу SF, которая является отличительной чертой ОА. У пациентов с ОА лейкоциты в образцах СФ обычно не превышают 2000 клеток на микролитр, а процент воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, очень низок или отсутствует. Кристаллы кальция часто встречаются в СФ, собранных у пациентов с ОА. Хотя их роль в патогенезе ОА остается неясной, они были связаны с легким воспалительным процессом и более тяжелым прогрессированием заболевания. В последнее время кристаллы кальция были описаны как на ранних, так и на поздних стадиях ОА, что указывает на то, что они могут играть жизненно важную роль в диагностике различных клинических подмножеств ОА и фармакологического лечения. Общая цель анализа СФ при ОА двоякая: установить невоспалительную степень СФ и выделить присутствие кристаллов кальция.

Введение

Остеоартрит (ОА) является сложным и многофакторным хроническим заболеванием суставов, общая распространенность которого, по оценкам, составляет 16% у пациентов в возрасте 15 лет и старше и 23% у пациентов в возрасте 40 лет и старше¹ года. Ожидается, что заболеваемость ОА увеличится из-за старения населения и увеличения факторов риска, таких как ожирение и метаболический синдром².

Среди основных проблем, связанных с ОА, - сложность диагностики заболевания на ранних стадиях и доступные в настоящее время методы лечения, ограниченные обезболиванием и симптоматическими препаратами медленного действия (SYSADOA), такими как гликозаминогликаны. Диагноз ОА основывается на клинических симптомах и результатах визуализации. Однако отсутствие корреляции между этими двумя оценками может привести к многолетней задержке постановки диагноза ОА и начала лечения². ОА характеризуется дегенеративными процессами и вялотекущим воспалением, которые можно легко исследовать с помощью анализа синовиальной жидкости (СФ). SF - это вязкий плазматический диализат, богатый гиалуроновой кислотой, который смазывает суставную щель, обеспечивает хрящ питательными веществами и кислородом, а также удаляет метаболические отходы. SF также действует как амортизатор, тем самым защищая суставы во время напряжения и деформации³.

Анализ SF является простым и надежным методом, который всегда должен выполняться во время первичной оценки пациентов с симптомами опорно-двигательного аппарата и выпотом в суставах³. Рекомендации Американского колледжа ревматологии, Британского общества ревматологии и других включают SF-анализ в число диагностических тестов на ревматические заболевания, которые необходимо проводить в основном при оценке острого моноартрита ^4,5. Общее и дифференциальное количество лейкоцитов, полученное при анализе SF, дает представление о патологическом процессе, происходящем в суставе, тем самым классифицируя степень воспаления. Идентификация патогенных кристаллов, таких как кристаллы мононатриевого урата (MSU) и пирофосфата кальция (CPP), в поляризованном свете, имеет жизненно важное значение для диагностики и лечения кристаллического артрита (например, подагры и псевдоподагры). Кроме того, наличие микроорганизмов предполагает диагноз септического артрита.

Кристаллы кальция часто встречаются в образцах, взятых у пациентов с ОА⁶. Основные кристаллы фосфата кальция (BCP) и CPP были зарегистрированы примерно в 22% и 23% образцов SF, соответственно, у пациентов с ОА⁶. Хотя их роль остается неясной, эти кристаллы были связаны с более тяжелыми формами ОА⁷ и считаются эпифеноменом самого патологического процесса. Кристаллы кальция были обнаружены в 100% образцов тканей пациентов с ОА, перенесших замену коленного сустава⁸. Кроме того, была выдвинута гипотеза о том, что кристаллы кальция могут быть вовлечены в патогенез ОА из-за их воспалительных эффектов, продемонстрированных несколькими исследованиями⁹ и опосредованных, по крайней мере частично, воспалением NLRP3¹⁰.

Совсем недавно кристаллы кальция были описаны как на ранних, так и на поздних стадиях⁶ ОА, что указывает на то, что они могут играть жизненно важную роль в диагностике различных клинических подмножеств ОА и фармакологического лечения.

Общая цель анализа SF двоякая: определить степень воспаления SF и диагностировать кристаллический или септический артрит путем идентификации конкретных кристаллов или микроорганизмов. Это особенно полезный, простой и надежный инструмент в диагностике ОА из-за типичного невоспалительного паттерна с очень низким процентом или отсутствием нейтрофилов.

Преимущества перед альтернативными методами
SF-анализ состоит из простых процедур, которые включают общее и дифференциальное количество лейкоцитов и поиск кристаллов. Ручной подсчет клеток, выполняемый опытными лаборантами ^3,11, остается золотым стандартом цитологического анализа синовиальных и других жидкостей организма. Однако из-за ограниченности, занимающей много времени, а также изменяемости этого метода между и внутри наблюдателя автоматические счетчики клеток постепенно заменили ручной подсчет в крупных рутинных клинических лабораториях, где анализаторы крови и мочи были адаптированы для проведения анализа SF^11,12. Тем не менее, ручной подсчет дает некоторые преимущества в определенных условиях: (1) в амбулаторных условиях, чтобы вовремя получить общее и дифференциальное значение лейкоцитов; (2) для идентификации типов клеток, таких как цитофагоцитарные мононуклеарные (Reiter) клетки или негемопоэтические клетки, такие как синовиоциты, которые автоматические счетчики не могут распознать; (3) когда образец слишком мал для обработки прибором; (4) создание местных лабораторных реестров, которые легко доступны для исследовательских целей. Еще одним преимуществом ручного подсчета является обескровленное окрашивание, метод, который позволяет дифференцировать клетки очень быстро и сразу после подготовки предметного стекла. Напротив, традиционные окрашивания, такие как процедуры Райта и Майя-Грюнвальда-Гимзы, требуют высушенных на воздухе мазков SF и времени для окрашивания клеток¹³. Несмотря на то, что эти методы окрашивания не подходят для чувствительных ко времени рутинных анализов, они выявляют более подробные клеточные популяции в образце, включая эритроциты, базофилы, эозинофилы, полиморфноядерные лейкоциты, лимфоциты и тромбоциты.

Наконец, рутинный SF-анализ кристаллов выполняется с использованием простой методики, основанной на поляризованной световой микроскопии, которая обеспечивает быстрые результаты¹⁴. Альтернативные методы, такие как сканирование и электронная микроскопия, дают более точные и чувствительные результаты, но их использование в повседневной клинической практике нецелесообразно из-за высокой стоимости и трудоемкой подготовки и анализа образцов.

протокол

Настоящий протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике Университетской больницы Падуи. СФ собирали с согласия пациента из коленных суставов пациентов, получавших терапевтический артроцентез по поводу выпота в суставах при их первичном обращении в клинику или в ответ на вспышку артрита. Противопоказаниями к процедуре были: коагулопатия, антикоагулянтные препараты, поражения кожи, дерматит или целлюлит, покрывающий сустав. Все образцы СФ были деидентифицированы.

1. Подготовка синовиальной жидкости

1. Образцы SF, собранные во время артроцентеза опухших суставов¹⁵ , переносят в пробирку, содержащую антикоагулянт (предпочтительно ЭДТА; см. Таблицу материалов), и во вторую пробирку, не содержащую добавки (рис. 1).
2. При подозрении на инфекцию асептически переносят часть образца SF (~ 1 мл) в культуральные флаконы для микробиологического тестирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекцию можно заподозрить как в результате клинических признаков (тяжелая опухоль, долор, калор, functio laesa, а иногда и лихорадка), так и макроскопического появления SF (помутнение, цвет). В этом случае врач назначает микробиологический анализ, который проводит микробиологическая лаборатория.
3. Проведите SF-анализ (шаги 2-5), как только образец будет собран.

2. Макроскопическое исследование

ПРИМЕЧАНИЕ: Макроскопическая оценка образцов SF состоит из субъективных, качественных и полуколичественных оценок. Эталонных стандартных шкал не существует, контрольные образцы не используются.

1. Аннотируйте объем SF, выраженный в миллилитрах. Определите цвет образца, который может варьироваться от бледного до темно-желтого. Зафиксируйте наличие крови.
2. Определите степень четкости, наблюдая за образцом в контровом свете и определяя легкость чтения печатной страницы через жидкостную трубку (рис. 2А).
3. Оцените вязкость, капнув образец из одноразовой пипетки. Образование длинной нити или капли указывает на хорошую или плохую вязкость соответственно (рис. 2B).
4. Оцените наличие твердых частиц, включая фрагменты тканей или фибрин, наблюдая за образцом через пробирку и в контровом свете.

3. Микроскопическое исследование

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопический анализ SF состоит из цитологического исследования, включая общее и дифференциальное количество лейкоцитов (WBC) и поиск кристаллов.

1. Определите общее количество ячеек, выполнив следующие действия.
   1. Определяют общее количество лейкоцитов в СФ, собранных в пробирке ЭДТА, с помощью гемоцитометра (см. Таблицу материалов).
   2. Наберите 0,5 мкл SF из пробирки ЭДТА с помощью пипетки Malassez-Potain (отметка 0,5; см. Таблицу материалов) (дополнительный рисунок 1). Той же пипеткой наберите 9,5 мкл 0,1% раствора метиленового синего (отметка 11). Окончательное разбавление – 20-кратное.
   3. Смешайте пипетку путем легкой инверсии, выбросьте первые капли и влейте синовиальную жидкость + раствор метиленового синего в счетную камеру.
   4. Посчитайте ячейки в двух последовательных квадратах из девяти, и умножьте полученное число на 100 (упрощенная формула; Дополнительный рисунок 2). Экспрессируйте лейкоциты как количество лейкоцитов на кубический миллиметр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Упрощенная формула: лейкоциты (Н/^мм3) = количество подсчитанных клеток в двух последовательных квадратах х 100.
   5. Классифицировать СФ по общему количеству лейкоцитов в соответствии с ранее опубликованными отчетами^16,17 (табл. 1).
2. Выполните дифференциальный подсчет ячеек.
   1. Определите процентное содержание полиморфноядерных (ПМН) клеток, моноцитов и лимфоцитов с помощью суправитального или традиционного окрашивания^13,18.
   2. Для супривитального окрашивания поместите одну маленькую каплю SF в центр готового к использованию предметного стекла, предварительно покрытого крезильным фиолетовым и метиленовым синим (дополнительный рисунок 3; см. Таблицу материалов).
   3. Накройте покровным стеклом и капните каплю погружного масла для микроскопа.
   4. Подготовьте высушенный на воздухе мазок SF для традиционного окрашивания (менее подходящего для рутинного анализа). Положите маленькую каплю SF в конце чистого слайда. Используя второй предметный стеколь или покровное стекло, распределите его вдоль предметного стекла движением вперед. Дайте мазку высохнуть на воздухе.
   5. Окрашивание образца в соответствии со стандартной процедурой Майя-Грюнвальда-Гимзы¹⁸.
   6. Осмотрите предметное стекло под объективом погружения в масло (1,000x).
   7. Подсчитайте 100 последовательных клеток и различите полиморфноядерные клетки, моноциты и лимфоциты (рис. 3, дополнительный рис. 4).
   8. Выразите общее количество в каждой категории в процентах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения точных результатов цитологические исследования должны быть выполнены сразу после сбора SF или в течение 24-48 часов после артроцентеза при правильном хранении (4 ° C).

4. Обнаружение кристаллов

1. Определяют наличие патологических кристаллов с помощью поляризованного светового микроскопа, оснащенного дополнительным поляризационным фильтром и красным компенсатором¹⁹ (см. Таблицу материалов).
2. Выполните подготовку предметного стекла для обнаружения кристаллов.
   1. Тщательно очистите предметное стекло оптической бумагой или мягкой бумагой, пропитанной этанолом. Нанесите небольшую каплю SF на предметное стекло.
   2. Накройте покровным стеклом и поместите предметное стекло под микроскоп.
3. Определите кристаллы.
   1. Сфокусируйте предметное стекло под микроскопом, используя объектив с малым увеличением. Внимательно изучите слайд под ярким полем с 40-кратным объективом. Загляните внутрь и снаружи клеток.
   2. Идентифицируйте кристаллы по их размеру и форме (например, ромбовидные, игольчатые, палочковидные).
   3. Вставьте поляризационный фильтр между источником света и образцом. Поворачивайте поляризатор до тех пор, пока его оптическая ось не станет перпендикулярной анализатору (расположенному над объективами), чтобы создать темный фон.
   4. После того, как двулучепреломляющий кристалл идентифицирован, вставьте компенсатор между поляризатором и образцом и переместите его параллельно или перпендикулярно оптической оси кристалла.
   5. Наблюдайте за цветом, выявленным кристаллом (таблица 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы МГУ имеют игольчатую форму, ярко двулучепреломляющие в темном поле и имеют желто-оранжевый цвет, когда их ось параллельна компенсатору. И наоборот, они синие при перпендикулярном расположении (отрицательный знак) (табл. 2; Рисунок 4). Кристаллы CPP представляют собой палочковидные или ромбоидные кристаллы, слабо двулучепреломляющие при поляризованном свете и имеющие синий или желтый цвет, когда они выровнены параллельно или перпендикулярно оси компенсатора (положительный знак) соответственно (табл. 2; Рисунок 5).

5. Окрашивание ализарином в красный цвет

1. Приготовьте 2% раствор ализарина красного S (рН 4,1-4,3), профильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм и храните вдали от света.
   1. Для приготовления предметного стекла смешайте каплю СФ с таким же объемом раствора ализарина красного (1:1) на чистом предметном стекле. Накройте покровным стеклом и осмотрите при 400-кратном увеличении.
   2. Определите кристаллы под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест положительный, когда под проходящим светом видны яркие, темно-красные осадки с круглой формой и концентрическими слоями. В поляризованном свете они кажутся сильно двулучепреломляющими²⁰ (рис. 6).

Результаты

Крупные суставы, пораженные ОА, часто опухают и производят значительное количество SF, которые дренируются с помощью артроцентеза¹⁵. Макроскопические характеристики SF, оцениваемые сразу после артроцентеза, по существу включают количество, цвет, прозрачность и вязкост?...

Обсуждение

При ОА SF-анализ помогает определить характеристики заболевания с помощью простых шагов: общего и дифференциального количества лейкоцитов и поиска кристаллов, включая CPP и BCP. Кроме того, обнаружение кристаллов МГУ может выявить важные сопутствующие заболевания.

Несмотр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation