Sterilizzazione con radiazioni gamma a basso dosaggio per innesti tracheali decellularizzati

Riepilogo

Ottenere la sterilizzazione è essenziale per il trapianto di tessuto tracheale. Qui presentiamo un protocollo di sterilizzazione che utilizza l'irradiazione gamma a basso dosaggio che è completamente tollerato dagli organi.

Abstract

Uno dei principali aspetti chiave per garantire che un trapianto si evolva correttamente è la sterilità del terreno. Il trapianto tracheale decellularizzato comporta l'impianto di un organo che era originariamente a contatto con l'ambiente, quindi non essendo sterile fin dall'inizio. Mentre il protocollo di decellularizzazione (attraverso l'esposizione di detergenti [2% di sodio dodecilsolfato], agitazione continua e shock osmotici) è condotto in linea con misure asettiche, non prevede la sterilizzazione. Pertanto, una delle sfide principali è garantire la sterilità prima dell'impianto in vivo . Sebbene esistano protocolli di sterilizzazione con radiazioni gamma stabiliti per i materiali inorganici, non esistono tali misure per i materiali organici. Inoltre, i protocolli in vigore per i materiali inorganici non possono essere applicati ai materiali organici, poiché la dose di radiazioni stabilita (25 kGy) distruggerebbe completamente l'impianto. Questo articolo studia l'effetto di una dose di radiazioni aumentata in una trachea di coniglio decellularizzata. Abbiamo mantenuto l'intervallo di dosaggio (kGy) e testato dosi aumentate fino a trovare la dose minima alla quale si ottiene la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose, ne abbiamo studiato gli effetti sull'organo, sia istologicamente che biomeccanicamente. Abbiamo determinato che mentre 0,5 kGy non hanno raggiunto la sterilità, dosi di 1 kGy e 2 kGy lo hanno fatto, con 1 kGy, quindi, essendo la dose minima necessaria per ottenere la sterilizzazione. Gli studi microscopici non hanno mostrato cambiamenti rilevanti rispetto agli organi non sterilizzati. Le caratteristiche biomeccaniche assiali non sono state affatto alterate ed è stata osservata solo una leggera riduzione della forza per unità di lunghezza che l'organo può tollerare radialmente. Possiamo quindi concludere che 1 kGy raggiunge la completa sterilizzazione della trachea di coniglio decellularizzata con effetti minimi, se non nulli, sull'organo.

Introduzione

La sterilizzazione di un impianto è un requisito fondamentale per la sua vitalità; Infatti, le protesi che si sono dimostrate efficaci sono quelle impiantate in zone sterili (vasi sanguigni, cuore, ossa, ecc.) ¹. La trachea ha due superfici: una superficie a contatto con l'ambiente esterno, che quindi non è sterile, e una superficie verso il mediastino, che è sterile. Pertanto, dal momento in cui la trachea viene estratta, non è un organo sterile. Nonostante il successivo processo di decellularizzazione venga effettuato in condizioni di massima sterilità, non si tratta di una fase di sterilizzazione². L'impianto di materiale estraneo comporta di per sé un rischio di infezione dovuto al microambiente probatterico che produce³e un rischio fino allo 0,014% di trasmissione della malattia dal donatore al ricevente, anche se il materiale è stato sterilizzato⁴. Per garantire una corretta vascolarizzazione della trachea, in quasi tutti i protocolli sperimentali di trapianto, viene prima sottoposto a impianto eterotopico ^5,6,7 in una zona sterile (muscolo, fascia, omento, sottocutaneo^, ecc.); Questo perché l'impianto di un elemento non sterile in questo mezzo porterebbe all'infezione dell'area³.

Ci sono una serie di possibili strategie per ottenere un impianto sterile. L'uso di CO₂supercritico ha raggiunto la sterilizzazione terminale ^8,9. Altri metodi, come la radiazione ultravioletta o il trattamento con sostanze come acido peracetico, etanolo, perossido di ossigeno e acqua elettrolizzata, hanno ottenuto percentuali di successo diverse nella sterilizzazione, quasi sempre a seconda dei loro dosaggi, ma hanno dimostrato di influenzare le caratteristiche biomeccaniche degli impianti. In effetti, alcune sostanze, come l'ossido di etilene, possono modificare sostanzialmente la struttura della matrice impiantata e possono persino causare effetti immunogenici indesiderati. Per questo motivo, molte di queste strategie non possono essere applicate ai modelli biologici 2,10,11,12,13.

La strategia di sterilizzazione più studiata e accettata è quella stabilita dalla norma ISO 11737-1:2006 per la sterilizzazione di dispositivi medici impiantati nell'uomo, con una dose di radiazioni gamma di 25 kGy. Tuttavia, questo regolamento si concentra solo sulla sterilizzazione di elementi inerti e non biologici^14,15. Inoltre, le dosi di radioterapia nel trattamento radicale del carcinoma sono inferiori di tre ordini di grandezza rispetto a quelle utilizzate per sterilizzare i dispositivi medici¹. Con questo in mente, possiamo concludere che tale dose non solo ucciderebbe il microbiota, ma distruggerebbe e altererebbe radicalmente la struttura biologica dell'impianto. C'è anche la possibilità che generi lipidi residui al momento della degradazione, che possono potenzialmente essere citotossici e accelerare la degradazione enzimatica dello scaffold 13,14,15,16,17, anche quando si utilizzano dosi basse come ^1,9 kGy e con danni direttamente proporzionali alla dose di radiazioni ricevuta ¹⁷.

Pertanto, l'obiettivo di questo lavoro è cercare di identificare la dose di radiazioni che consente di ottenere un impianto sterile con effetti nocivi minimi causati dall'irradiazione 2,18,19. La strategia che abbiamo seguito prevedeva l'irradiazione di trachee decellularizzate e irradiate a diverse dosi aumentate all'interno di un intervallo di kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy, ecc.), fino a raggiungere una coltura negativa. Ulteriori test sono stati effettuati per quelle dosi che hanno raggiunto colture negative, al fine di confermare la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose minima per ottenere la sterilizzazione, è stato controllato l'impatto strutturale e biomeccanico dell'irradiazione sulla trachea. Tutte le metriche sono state confrontate con le trachee di coniglio native di controllo. La sterilizzazione del costrutto è stata poi testata in vivo impiantando le trachee nei conigli bianchi della Nuova Zelanda.

Protocollo

La direttiva europea 20170/63/UE per la cura e l'uso degli animali da laboratorio è stata rispettata e il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Valencia (Legge 86/609/CEE e 214/1997 e Codice 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 del Governo di Valencia, Spagna).

1. Decellularizzazione tracheale

NOTA: Il metodo di decellularizzazione è stato riportato altrove²⁰.

1. Eutanasia di conigli bianchi neozelandesi maschi adulti donatori (Oryctolagus cuniculus) del peso di 3,5-4,1 kg con 133 mg/kg di pentobarbital sodico, utilizzando un'iniezione di 200 mg/ml attraverso la vena marginale dell'orecchio.
2. Garantendo condizioni asettiche, eseguire una cervicotomia longitudinale centrale, sezionare i muscoli cervicali e avvicinarsi alla trachea. Sezionare l'organo circonferenzialmente e longitudinalmente. Infine, transetto sotto il primo anello e appena sopra la carena.
3. Con un bisturi, sezionare le trachee in pezzi di 2 cm. Con le forbici, rimuovere il tessuto connettivo circostante e lo strato di mucosa interna⁶.
4. Immergere i campioni in 12 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente il 2% di sodio dodecilsolfato (SDS), il 5% di penicillina-streptomicina e il 5% di amfotericina B.
5. Sottoporre le trachee ad agitazione costante con un agitatore magnetico a 400 giri / min per 5 settimane a temperatura ambiente. Sostituire settimanalmente la soluzione di decellularizzazione dopo uno shock osmotico di 2 ore, mediante immersione della trachea in acqua distillata.
6. Criogenetizzare i campioni utilizzando una miscela da 12 ml di siero bovino fetale (FBS) all'80% e dimetilsolfossido (DMSO) al 20% in un contenitore di congelamento a -80 °C.
7. Quando le trachee verranno utilizzate (dopo 13-15 giorni), scongelarle a bagnomaria a 37 °C e lavarle immergendole in PBS al termine dello scongelamento.

2. Sterilizzazione

1. Irradiamento
   1. Introdurre i lotti di quattro pezzi tracheali di 2 cm ciascuno in un matraccio da 20 mL di metacrilato in un matraccio di coltura T25 riempito con PBS fino a raggiungere un volume totale di 30 ml. Fare attenzione a prevenire la formazione di bolle, che potrebbero causare la diffusione di energia nell'interfaccia aria-liquido.
   2. Condurre l'irradiazione utilizzando un acceleratore lineare, con fotoni di un'energia nominale di 10 MV che appiattiscono fasci liberi di filtri. Applicare un'intensità di dose di 2.400 unità di monitoraggio al minuto all'isocentro, ponendo le trachee ad una distanza sorgente-superficie di 100 cm da irradiare, con una profondità di campo di 2,5 cm per un campo di radiazione di 10 cm x 10 cm - in modo da coprire l'intero contenitore - corrispondente ad una dose di 24 Gy/min.
   3. Aumentare le dosi con ogni lotto di quattro pezzi; quattro pezzi saranno sottoposti a 0,5 kGy, da quattro a 1 kGy, da quattro a 2 kG, ecc., Fino al raggiungimento della sterilizzazione.
2. Cultura
   1. Introdurre i pezzi in 30 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con FBS inattivato al 10% senza antibiotici o antimicotici.
   2. Coltivarli in un incubatore tissutale standard a 37 °C e 5% di CO 2 per₂ settimane e ispezionarli ogni 24 ore.
      NOTA: I parametri di contaminazione sono cambiamenti nel pH del terreno di coltura e, di conseguenza, cambiamenti nel colore e nella torbidità del terreno. Le trachee sono state raccolte da lagomorfi privi di germi, che non erano malati e, quindi, ci si aspettava che fossero privi di batteri anaerobici nelle loro trachee.

3. Analisi istologica

NOTA: Macchiare i pezzi usando ematossilina ed eosina²¹, tricroma di Masson e orceina²².

1. Colorazione DAPI
   1. Determinare la vitalità tissutale utilizzando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo). Questa colorazione blu-fluorescente si lega fortemente alle regioni ricche di adenina e timina nelle sequenze di DNA e quindi consente di visualizzare il DNA tramite microscopia a fluorescenza.
   2. Incorporare i campioni di tessuto nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
   3. Tagliare i campioni usando un criostato.
   4. Lavare il campione da tingere tre volte in acqua distillata per rimuovere l'OCT. Posizionare in un mezzo di montaggio che includa una soluzione 30 nM di DAPI.
   5. Visualizza la fluorescenza utilizzando la microscopia a fluorescenza.
2. Analisi del contenuto di DNA
   1. Tagliare segmenti di trachea lunghi circa 3 mm usando un bisturi.
   2. Incubare per 2 ore in proteinasi K (Tabella dei materiali).
   3. Estrarre il DNA con un kit di estrazione del DNA, seguendo le istruzioni del produttore.
   4. Per mezzo della spettrofotometria, determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260/280 utilizzando uno spettrofotometro.
   5. Misurare la dimensione dei campioni di DNA estratti utilizzando la cromatografia capillare con un bioanalizzatore.

4. Studio biomeccanico

NOTA: La resistenza tracheale alle forze longitudinali e trasversali viene misurata mediante prove di trazione assiale e di compressione radiale²³.

1. Misurazione tracheale
   1. Misurare la lunghezza tracheale, lo spessore della parete e il diametro esterno utilizzando una pinza Vernier.
   2. Calcola i valori medi di tre misurazioni casuali di ciascuna delle variabili.
   3. Nei test di compressione radiale, calcolare il diametro anteroposteriore rilevando il punto in cui la piastra entra in contatto con il campione.
   4. Eseguire tutti i test a temperatura ambiente.
2. Prove di trazione
   1. Eseguire prove di trazione su una macchina di prova universale (UTM) per la trazione con controllo dello spostamento della macchina di prova universale (UTM), dotata di un carico di 100 N (risoluzione della forza 0,1 N, 0,001 mm di posizione e 0,1 s). La macchina di prova è dotata di sensori di forza e posizione, ed è collegata ad un computer con software appositamente progettato dal produttore²³.
   2. Registra i dati ogni 0,4 s ed esporta in un foglio di calcolo.
   3. Costruire ganasce di trazione adattate al calibro medio delle trachee di coniglio da tubi cavi in polivinilcloruro (PVC) cristallino monostrato puro e atossico con un diametro esterno di 1 cm e uno spessore della parete di 1,5 mm.
   4. Sezione le condotte in segmenti lunghi 3 cm.
   5. Praticare 12 fori preformati per la sutura termino-terminale, a 2 mm dal bordo delle ganasce e separati da una distanza di 2,5 mm, per evitare distorsioni dovute alle suture.
   6. Attaccare i tubi di vetro in PVC alla trachea del coniglio mediante anastomosi termino-terminale con una sutura continua attraverso fori preformati alternati (ogni 5 mm), a 2 mm di distanza dal bordo della trachea e con una sutura monofilamento di nylon 6-0.
   7. Allungare tutti i pezzi con una velocità di spostamento di 5,0 mm/min.
   8. Registrare le variabili massima sollecitazione (σ max, in N/mm²) e deformazione (ε_max, senza unità), insieme all'energia immagazzinata per unità di volume tracheale (W/Vol, in mJ/mm) e al modulo di Young (E, in MPa).
3. Test di compressione radiale
   1. Eseguire test di compressione radiale su un UTM desktop di compressione, dotato di una cella di carico da 15 N (risoluzione forza 0,001 N, posizione 0,001 mm e tempo 0,1 s) per ottenere dati di forza (N), posizione (mm) e tempo (s). Registra i dati ed esporta su foglio di calcolo a intervalli di 0,5 s.
   2. Posizionare le trachee con la zona membranosa appoggiata sulla piastra inferiore. La piastra sale gradualmente verso la piastra superiore ad una velocità costante di 5 mm/min.
   3. Calcolare ogni unità per unità di lunghezza del campione (f in N/mm), rigidità (R in Mpa·mm) e l'energia per unità di superficie (W / S in mJ / mm²) necessaria per occludere completamente la trachea.

5. Tecnica chirurgica

NOTA: La tecnica chirurgica è stata ampiamente riportata altrove²⁰.

1. Posizionare uno stent sterile in PVC intraluminale, di dimensioni 14 Fr (che gli consenta di scivolare liberamente senza comprimere le pareti), con un margine di 3-4 mm a ciascuna estremità.
2. Fissare lo stent con un singolo punto monofilamento di nylon 6-0 attraverso lo spazio intercartilagineo della prima cartilagine.
3. Procedere ad anestetizzare i conigli.
   1. Pre-medicare i soggetti (conigli bianchi neozelandesi maschi di 3,65-4,05 kg) con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) con un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg xilazina).
   2. Rasare la zona di incisione fuori dalla zona operatoria e pulire l'area chirurgica per rimuovere i capelli.
   3. Somministrare analgesici più profilassi antibiotica: 0,05 mg/kg di buprenorfina intramuscolare e 10 mg/kg di enrofloxacina.
   4. Metti un catetere venoso nella vena dell'orecchio marginale di ciascun coniglio.
   5. Indurre l'anestesia con un bolo endovenoso di 10 mg/kg di propofol.
   6. Monitorare i segni vitali dell'animale utilizzando un elettrocardiogramma a tre derivazioni, pulsossimetria e misurazione della pressione non invasiva. Ogni 30 minuti, applicare siero fisiologico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   7. Verificare il piano anestetico utilizzando il metodo del pizzicamento della punta.
   8. Mantenere l'anestesia con isoflurano inalato all'1,5%-2% della concentrazione alveolare minima senza perdere la ventilazione spontanea e fornire supporto termico al coniglio con una piastra riscaldante.
4. Disinfettare la zona di incisione più volte con un movimento circolare con uno scrub a base di iodio. In condizioni asettiche in ogni momento e con materiale sterile, praticare un'incisione toracica centrale longitudinale di 3 cm e raccogliere lembi peduncolari bilaterali composti da fascia pettorale e una componente muscolare.
5. Avvolgere le trachee con il lembo in quattro conigli, uno su ciascun emitorace (quindi, un totale di otto trachee).
6. Quando l'intervento è completato, invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano.
7. Periodo post-chirurgico
   1. Tenere gli animali in sala operatoria fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia. Quando si sono completamente ripresi, riportateli nel loro ambiente con altri conigli.
   2. Trattare i conigli con antibiotici (0,5 ml/kg di enrofloxacina al 2,5%) e analgesici (5 mg/ml di meloxicam; 0,05 ml/kg di metacam) ogni 24 ore per 5 giorni.
   3. Lasciare gli impianti in situ per il tempo desiderato.
   4. Prima dell'eutanasia, premedicare i conigli con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) e un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg di xilazina). Quindi eutanasia i conigli con 133 mg / kg di pentobarbital sodico usando un'iniezione di 200 mg / ml attraverso la vena dell'orecchio marginale e raccogliere le trachee.
   5. Eseguire test biomeccanici e istologici sulle trachee.

6. Analisi statistica

1. Regolare tutti i modelli con il metodo bayesiano sul software R, versione 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
2. Analizzare le variabili di studio, ad eccezione di f e R, utilizzando più modelli di regressione lineare.
3. Per le variabili f e R , applicare modelli di regressione lineare mista. In questi modelli, oltre alle variabili di interesse legate al trattamento e alla condizione di ogni trachea, introdurre la percentuale di occlusione come effetto monotono e un termine indipendente per trachea come fattore casuale.

Risultati

Decellularizzazione
La colorazione DAPI mostra l'assenza di DNA e nessun valore di DNA superiore a 50 ng è stato rilevato in nessuna delle trachee mediante elettroforesi, con tutti i frammenti più piccoli di 200 bp²⁰.

Coltura microbica
Due degli otto pezzi sottoposti a 0,5 kGy hanno mostrato un cambiamento di colore in meno di 1 settimana. Nessuno dei pezzi irradiati a 1 kGy e 2 kGy ha mostrato alcun cambiamento di colore (

Discussione

Esistono diverse strategie di sterilizzazione. La CO₂supercritica penetra completamente nei tessuti, acidificando il mezzo e decostruendo il doppio strato fosfolipidico cellulare con semplice eliminazione mediante depressurizzazione dell'impianto ^8,14,25. È stata utilizzata anche la radiazione ultravioletta ed è stata pubblicata la sua efficacia nella trachea dei roditori, sebbene ci siano solo pochi rapporti in let...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003