Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Riepilogo

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Abstract

I modelli murini geneticamente modificati (GEM) per il glioblastoma multiforme umano (GBM) sono fondamentali per comprendere lo sviluppo e la progressione dei tumori cerebrali. A differenza dei tumori xenotrapianti, nei GEM, i tumori sorgono nel microambiente nativo in un topo immunocompetente. Tuttavia, l'uso di GEM GBM negli studi di trattamento preclinico è impegnativo a causa delle lunghe latenze tumorali, dell'eterogeneità nella frequenza delle neoplasie e dei tempi di sviluppo del tumore di grado avanzato. I topi indotti tramite iniezione ortotopica intracranica sono più trattabili per gli studi preclinici e mantengono le caratteristiche dei tumori GEM. Abbiamo generato un modello di tumore cerebrale ortotopico derivato da un modello GEM con aberrazioni Rb, Kras e p53 (TRP), che sviluppa tumori GBM che mostrano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa analoga al GBM umano. Le cellule derivate dai tumori GEM GBM vengono iniettate per via intracranica in topi riceventi wild-type, con ceppo abbinato e riproducono tumori di grado IV, bypassando così il lungo periodo di latenza tumorale nei topi GEM e consentendo la creazione di coorti ampie e riproducibili per studi preclinici. Le caratteristiche altamente proliferative, invasive e vascolari del modello TRP GEM per GBM sono ricapitolate nei tumori ortotopici e i marcatori istopatologici riflettono i sottogruppi di GBM umano. La crescita del tumore è monitorata da scansioni MRI seriali. A causa della natura invasiva dei tumori intracranici nei modelli immunocompetenti, seguire attentamente la procedura di iniezione qui descritta è essenziale per prevenire la crescita del tumore extracranico.

Introduzione

Il glioblastoma (GBM; glioma di grado IV) è il tumore cerebrale più comune e maligno e le terapie attuali sono inefficaci, con una sopravvivenza mediana di 15 mesi¹. Modelli preclinici affidabili e accurati che rappresentano le complesse vie di segnalazione coinvolte nella crescita e nella patogenesi del tumore cerebrale sono essenziali per accelerare i progressi nella valutazione di nuovi regimi terapeutici per GBM. I modelli murini in cui le linee cellulari di tumore cerebrale umano sono impiantate per via sottocutanea in topi immunocompromessi non riflettono l'ambiente immunitario nativo dei tumori cerebrali, né possono essere utilizzati per valutare la capacità delle terapie di attraversare la barriera emato-encefalica². Idealmente, i modelli murini preclinici dovrebbero anche riprodurre fedelmente l'istopatologia GBM umana, incluso l'alto livello di invasività nel parenchima circostante³. Sebbene i modelli murini geneticamente modificati (GEM) sviluppino tumori nel contesto di un sistema immunitario intatto, sono spesso necessari schemi di allevamento complicati e i tumori possono svilupparsi lentamente e in modo incoerente⁴. I modelli di allotrapianto derivati da GEM sono più adatti per studi terapeutici preclinici, in cui sono necessarie grandi coorti di topi portatori di tumore in un lasso di tempo più breve.

In un precedente rapporto, abbiamo descritto un modello murino ortotopico GBM derivato direttamente dai tumori GEM. La tumorigenesi nel GEM è iniziata da eventi genetici in popolazioni cellulari (principalmente astrociti) che esprimono la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), che provocano la progressione verso GBM. Questi TRP GEM ospitano un transgene TgGZT121 (T), che esprime T121 dopo l'esposizione alla Cre ricombinasi guidata da GFAP. L'espressione della proteina T121 determina la soppressione dell'attività della proteina Rb (Rb1, p107 e p103). La co-espressione di un transgene Cre guidato da GFAP (GFAP-CreERT2) mira all'espressione degli astrociti adulti dopo induzione con tamoxifene. I topi TRP ospitano anche un Kras mutante Cre-dipendente (Kras^G12D; R) allele, per rappresentare l'attivazione della via del recettore tirosin-chinasi, e sono eterozigoti per la perdita di Pten (P)^5,6. Aberrazioni geniche concomitanti nelle reti del recettore tirosin-chinasi (RTK), PI3K e RB sono implicate nel 74% della patogenesi GBM⁷. Pertanto, le vie primarie di segnalazione alterate nel GBM umano sono rappresentate dalle mutazioni ingegnerizzate nei topi TRP, in particolare nei tumori GBM, in cui vengono attivati bersagli a valle condivisi di RTK⁵.

Il modello ortotopico singeneico derivato da GEM è stato convalidato come modello che riassume le caratteristiche dei tumori cerebrali umani, tra cui l'invasività e la presenza di biomarcatori di sottotipo, da utilizzare come piattaforma per valutare le terapie antitumorali mirate a percorsi aberranti nel GBM. Le cellule sono state coltivate da tumori raccolti dal cervello TRP e reimpiantate nel cervello di topi abbinati al ceppo, utilizzando apparecchiature stereotassiche per l'iniezione intracranica nella corteccia. Questo modello murino ortotopico preclinico ha sviluppato tumori GBM altamente cellulari, invasivi, pleomorfi con un alto tasso mitotico e mostravano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa, come osservato per GBM umano. I volumi e la crescita del tumore sono stati misurati mediante risonanza magnetica (MRI) in vivo .

In questo rapporto, descriviamo la tecnica ottimale per l'iniezione intracranica di cellule GBM primarie o linee cellulari nel cervello di topo wild-type, usando i tumori TRP come esempio. Lo stesso protocollo può essere adattato per topi immunocompromessi e altre linee cellulari GBM. Vengono forniti suggerimenti cruciali per evitare insidie comuni, come la preparazione non ottimale delle cellule o la perdita di cellule nel sito di iniezione, e per utilizzare correttamente l'apparecchiatura stereotassica per garantire la riproducibilità e l'affidabilità del modello. Per scopi traslazionali, convalidiamo il modello mediante rilevamento MRI della crescita del tumore cerebrale in animali vivi, caratterizzazione istologica e presentiamo un esempio di trattamento nei topi portatori di tumore.

Protocollo

Il protocollo di studio qui descritto è stato approvato dal NCI presso il Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick è accreditato da AAALAC International e segue la politica del servizio sanitario pubblico per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La cura degli animali è stata fornita secondo le procedure delineate nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).

1. Preparazione delle cellule per l'iniezione

NOTA: Le cellule primarie del tumore cerebrale di topo (MBR) utilizzate per questo modello sono state originariamente isolate da topi TRP GEM indotti da tamoxifene, come descritto in El Meskini et ^al.5. I dettagli sulla preparazione delle cellule possono essere trovati in questo riferimento.

1. Eseguire i seguenti passaggi utilizzando la tecnica sterile in un armadio di biosicurezza.
2. Coltura di cellule tumorali cerebrali primarie in vitro fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale.
3. Raccogliere le cellule in tripsina allo 0,25% e, una volta che si sono staccate, diluirle con terreno di crescita per inattivare la tripsina.
4. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 400 x g e lavare con mezzi senza siero. Ripeti una volta prima di contare.
5. Contare le celle manualmente o con un contatore automatico delle celle. Risospendere le cellule in metilcellulosa sterile al 5% in 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata, sulla base di un volume di iniezione finale di 2 μL. La concentrazione cellulare desiderata può variare in base alla linea cellulare e al modello di tumore cerebrale. Per le celle GBM GEM TRP, iniettiamo 2 μL di una soluzione 25 x 10⁶ cellule/ml o 50.000 cellule.

2. Ceppo di topo

1. Allevare o acquistare un ceppo di topo appropriato che corrisponda allo sfondo del ceppo delle cellule tumorali cerebrali. Per le cellule TRP, utilizzare topi B6D2F1 / J di 9 settimane (da un incrocio tra femmine C57BL / 6J [B6] e maschi DBA / 2J [D2]) come destinatari di cellule tumorali.

3. Allestimento dell'area chirurgica

NOTA: Tutte le fasi chirurgiche sono condotte utilizzando la tecnica asettica in un ambiente pulito e igienizzato. Scrub e dispositivi di protezione individuale, compresa una maschera, devono essere indossati dal chirurgo. Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati a caldo prima dell'uso.

1. Posizionare i protettori della superficie sotto l'apparecchio stereotassico e sul piano di lavoro.
2. Collegare il tubo in vinile dalla macchina per anestesia alla porta IN della piattaforma di anestesia gassosa dell'apparecchio stereotassico e un altro tubo alla porta OUT.
3. Collegare il display digitale a una fonte di alimentazione e all'apparecchio.
4. Collegare il controller della micropompa (Figura 1A) a una fonte di alimentazione e collegare la micropompa (Figura 1A) al braccio manipolatore dell'apparecchio (vedere anche le istruzioni del produttore).
5. Impostare la micropompa su 5,6 nL/s per l'iniezione di volume di 2.000 nL.
6. Accendere lo sterilizzatore a sfere calde.
7. Collegare il termoforo del mouse al regolatore di temperatura e collegarlo a una fonte di alimentazione. Posiziona il piatto sulla piattaforma del palcoscenico. Impostare la temperatura della piastra a 37 °C.
8. Caricare una siringa di precisione da 30 G, facendo attenzione a non introdurre bolle. Inserire lo stantuffo e inserire l'ago. Assicurarsi di afferrare l'ago solo dal mozzo. Premere lo stantuffo fino a quando una goccia della miscela di cellule di metilcellulosa eroga attraverso l'ago. Pulire l'ago con un tampone per la preparazione di alcol al 70% strofinando accuratamente i lati dell'ago o posizionando una garza sterile sul piano di lavoro e asciugandola. Fare attenzione a non piegare o rompere l'ago.
9. Collegare la siringa di precisione alla micropompa e ruotare il braccio del manipolatore lontano dal palco, per evitare lo spostamento dell'ago della siringa prima di posizionare il mouse sul palco.

4. Preparare il topo per la chirurgia

1. Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con il vaporizzatore isoflurano impostato al 2,5%, o secondo le linee guida istituzionali. Accendere il flusso di isoflurano al naso.
2. Trasferire il mouse sull'apparecchio stereotassico e fissarlo al nosecone, con i denti superiori posizionati sul supporto del nosecone (Figura 1B, 9). Stringere la manopola sul naso per fissare (Figura 1B). Garantire un livello appropriato di anestesia eseguendo un pizzico del dito del piede per verificare il riflesso.
   1. Monitorare le orecchie, i piedi e le mucose per il colore (rosa) per garantire un'adeguata ossigenazione. Inoltre, monitorare la frequenza respiratoria (un aumento o una diminuzione potrebbe indicare la necessità di regolare i livelli di isoflurano).
3. Inserire le barre auricolari (Figura 1B) in entrambe le orecchie e stringere la manopola per fissare la testa.
4. Applicare un unguento per gli occhi per lubrificare gli occhi mentre il topo è sotto anestesia.
5. Utilizzare una pinza curva per strappare i peli sulla testa del topo in un'area circa il 150% più grande dell'incisione pianificata, per garantire condizioni asettiche adeguate.
6. Iniettare 0,5-1 mg/kg di buprenorfina SR analgesia per via sottocutanea o utilizzare un altro analgesico approvato dal protocollo.
7. Posizionare la sonda rettale del topo per monitorare la temperatura interna e prevenire l'ipotermia dovuta all'anestesia. Mantenere la temperatura corporea del mouse tra 36,5 e 38,5 °C.
8. Sanificare il campo chirurgico utilizzando cerchi verso l'esterno, alternando uno scrub chirurgico e l'etanolo tre volte.
9. Usando una pinza per tirare la pelle tesa, praticare un'incisione di circa 1 cm con la lama di bisturi, iniziando tra gli occhi. Il bregma dovrebbe essere visibile attraverso l'incisione.
   NOTA: Per una corretta tecnica sterile, toccare il sito chirurgico solo con le punte degli strumenti sterilizzati e posizionare le punte degli strumenti solo su una superficie sterile (come l'interno di un pacco utensili in autoclave).
10. Utilizzare l'estremità in legno dell'applicatore con punta in cotone per raschiare via il tessuto connettivo in eccesso e quindi l'estremità in cotone di un altro applicatore per asciugare.

5. Iniezione cellulare

1. Riportare il braccio manipolatore con l'attacco della siringa sopra il mouse, serrando la manopola per fissarla. Utilizzare le manopole X e Y sul piano orizzontale per spostare il supporto della siringa sul bregma. Abbassare l'ago usando la manopola Z per confermare la posizione del bregma. Impostare la console di lettura digitale su zero.
2. Utilizzare le manopole X e Y e la corrispondente lettura digitale per spostare l'ago nella posizione desiderata. Per la posizione della corteccia corticale, le coordinate appropriate sono 3 mm posteriormente, 2 mm lateralmente a destra al bregma e 2 mm di profondità dalla dura madre. Utilizzare la manopola Z per spostare l'ago sulla superficie del cranio.
3. Forare un foro nel cranio usando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G attaccato. Posizionare la smussatura dell'ago verso la siringa e l'ago di precisione da 30 G e ruotare con attenzione il braccio manipolatore verso il lato. Usando il pollice e il dito, far rotolare l'ago avanti e indietro lentamente con una leggera pressione fino a quando la punta dell'ago perfora appena il cappuccio cranico.
4. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal foro dell'ago. Riposizionare il braccio del manipolatore nella posizione appropriata con l'ago della siringa di precisione caricato sopra il foro. Allineare la punta dell'ago con il foro, utilizzando la manopola Z per abbassare l'ago fino alla durata del cervello e impostare la console di lettura digitale a zero.
5. Utilizzando la manopola Z, abbassare l'ago di 1 mm, quindi attendere 1 minuto. Ripetere l'operazione fino a raggiungere la profondità desiderata (2 mm come indicato).
   NOTA: L'ago viene abbassato lentamente per evitare ulteriori danni al tessuto cerebrale circostante e al riflusso della soluzione cellulare.
6. Avviare la micropompa, quindi monitorare per assicurarsi che la pompa si fermi quando sono stati iniettati 2 μL. Questo processo dovrebbe richiedere circa 6 minuti alla velocità indicata. Quindi, attendere 1 minuto prima di spostare l'ago.

6. Rimozione dell'ago e chiusura della ferita

1. Sollevare l'ago di 1 mm e attendere 1 minuto. Ripetere fino a quando l'ago è completamente libero dal cranio.
2. Se necessario, utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal sito di iniezione.
3. Utilizzando l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone, prendere un piccolo pezzo di cera ossea (~ 1 mm) e modellarlo in un cono. Mettilo nell'apertura del cranio, spingendo la cera nel foro.
4. Pinze termiche usando uno sterilizzatore di perline e usarle per sciogliere la cera rimanente sul cranio e levigarlo.
5. Posizionare circa due gocce di soluzione di bupivacaina (anestetico) nell'incisione e utilizzare una pinza per tirare insieme i bordi della pelle.
6. Tirare la pelle tesa e posizionare una o due clip per ferite per chiudere la pelle.
7. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante in un'area priva di correnti d'aria e osservare attentamente il mouse. Consentire al topo di svegliarsi completamente dall'anestesia, riprendendo la normale attività, prima di riportarlo all'alloggio normale.
8. Controllare quotidianamente il topo dopo la procedura chirurgica e somministrare la gestione del dolore, secondo le linee guida istituzionali.
   1. Se la buprenorfina SR (Fase 4.6) viene utilizzata per l'analgesia, la formula a rilascio prolungato dura 72 ore. Ripetere l'iniezione solo se è presente dolore o disagio visibile dopo 72 ore. Se eseguiti correttamente, i topi si riprendono bene dalle iniezioni intracraniche e non è necessaria un'ulteriore analgesia.
   2. Rimuovere le graffette 7-10 giorni dopo l'intervento.
9. Monitorare la crescita del tumore mediante imaging di animali vivi (MRI).
   1. Eutanasia dei topi quando vengono raggiunti endpoint umani (cioè, se l'animale perde il 20% del peso corporeo o diventa ipotermico).
   2. A causa della natura invasiva di questi tumori cerebrali, osservare i topi per sintomi neurologici, come andatura irregolare, paralisi parziale, rotazione o inclinazione della testa. Eutanasia di un topo se si osserva uno qualsiasi di questi segni clinici di crescita tumorale avanzata.

Risultati

I topi iniettati con cellule tumorali cerebrali devono essere monitorati quotidianamente per segni di crescita tumorale come convulsioni, atassia o perdita di peso. La crescita del tumore cerebrale può anche essere monitorata mediante risonanza magnetica a intervalli regolari. Le scansioni MRI settimanali consentono la visualizzazione dell'aumento del carico tumorale all'interno del cervello e le misurazioni del volume del tumore (Figura 1C). In particolare, i tumori TRP mostrano una cresci...

Discussione

I modelli preclinici sono essenziali per la valutazione di nuovi bersagli terapeutici e nuove strategie di trattamento nel GBM. I modelli murini geneticamente modificati per GBM hanno il vantaggio di insorgenza del tumore nel sito autoctono, ma spesso con una lunga latenza e una crescita tumorale imprevedibile¹³. I tumori del modello GEM mostrano una latenza di 4-5 mesi e la finestra temporale ideale per l'imaging, il reclutamento e il trattamento è variabile tra i singoli topi. Il modello ortoto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T