Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Resumen

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Resumen

Las plantas micoheterótrofas presentan una de las formas más extremas de dependencia micorrícica, habiendo perdido totalmente su capacidad autótrofa. Tan esencial como cualquier otro recurso vital, los hongos con los que estas plantas se asocian íntimamente son esenciales para ellas. De ahí que algunas de las técnicas más relevantes en el estudio de especies micoheterótrofas sean las que permiten la investigación de hongos asociados, especialmente aquellos que habitan en raíces y órganos subterráneos. En este contexto, se aplican comúnmente técnicas para identificar hongos endófitos dependientes e independientes del cultivo. El aislamiento de endófitos fúngicos proporciona un medio para identificarlos morfológicamente, analizar su diversidad y mantener los inóculos para aplicaciones en la germinación simbiótica de semillas de orquídeas. Sin embargo, se sabe que existe una gran variedad de hongos no cultivables que habitan en los tejidos vegetales. Por lo tanto, las técnicas de identificación molecular independientes del cultivo ofrecen una cobertura más amplia de la diversidad y abundancia de especies. El objetivo de este artículo es proporcionar el apoyo metodológico necesario para iniciar dos procedimientos de investigación: uno dependiente de la cultura y otro independiente. En cuanto al protocolo dependiente del cultivo, se detallan los procesos de recolección y mantenimiento de muestras de plantas desde los sitios de recolección hasta las instalaciones de laboratorio, junto con el aislamiento de hongos filamentosos de órganos subterráneos y aéreos de plantas micoheterótrofas, el mantenimiento de una colección de aislados, la caracterización morfológica de las hifas mediante la metodología de cultivo de portaobjetos y la identificación molecular de hongos mediante la extracción total de ADN. Abarcando metodologías independientes del cultivo, los procedimientos detallados incluyen la recolección de muestras de plantas para análisis metagenómicos y la extracción total de ADN de órganos de plantas aclorofílicas utilizando un kit comercial. Por último, también se sugieren protocolos de continuidad (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa [PCR], secuenciación) para los análisis, y aquí se presentan técnicas.

Introducción

Los hongos endófitos son, por definición, aquellos que habitan en el interior de los órganos y tejidos de las plantas en infecciones discretas (es decir, sin causar daño a su huésped)^1,2. Estos hongos pueden interactuar de forma neutra o beneficiosa con las plantas hospederas, pueden conferir resistencia a patógenos y condiciones ambientales desfavorables, y pueden contribuir a la síntesis de compuestos beneficiosos para la planta (por ejemplo, factores de crecimiento y otras fitohormonas)^1,3. Los endófitos micorrícicos son hongos que establecen asociaciones micorrícicas con la planta, participando en la transferencia de nutrientes⁴. En Orchidaceae, la interacción con endófitos micorrícicos es fundamental para la germinación de semillas en la gran mayoría de las especies, y el establecimiento de plántulas en todas las plantas de la familia⁵. En tales contextos, las orquídeas micoheterótrofas representan un caso de dependencia total con respecto a sus socios micorrícicos, ya que dependen de la transferencia de nutrientes minerales y compuestos de carbono por parte de estos hongos durante todo su ciclo de vida⁶. Por lo tanto, el aislamiento e identificación de hongos asociados es una base fundamental a la hora de investigar estrategias de vida micoheterótrofas. Además, poco se sabe sobre el papel de los endófitos fúngicos en las plantas micoheterótrofas o incluso la diversidad real de estos hongos ^7,8.

La investigación de hongos endófitos puede llevarse a cabo mediante diferentes técnicas, tradicionalmente descritas como independientes o dependientes del cultivo, por ejemplo: (a) observación directa, (b) aislamiento de hongos e identificación morfológica y/o molecular, y (c) extracción total de ADN de tejidos vegetales e identificación molecular⁹. En observación directa (a), los hongos endófitos pueden ser investigados mientras aún se encuentran en el interior de células y tejidos vegetales mediante microscopía óptica o electrónica⁹, ya que los diferentes protocolos de microscopía son detallados por Peña-Passos et ^al.10. Mediante métodos de aislamiento (b), los endófitos fúngicos pueden caracterizarse de acuerdo con sus colonias, hifas y morfología de la estructura reproductiva o de resistencia. Además, a través de técnicas de aislamiento, es posible llevar a cabo la identificación molecular de aislados a través de la extracción de ADN, la amplificación de secuencias de identificación molecular (códigos de barras o huellas dactilares) y la secuenciación¹¹. Esta última técnica (c) permite la identificación molecular de hongos endófitos mediante la extracción de ADN en el interior de los tejidos vegetales (metacódigo de barras), seguida de la preparación y secuenciación de la biblioteca¹².

Además, los aislados de hongos pueden aplicarse en ensayos de germinación simbiótica, utilizando semillas de orquídeas autótrofas o micoheterótrofas. Un ejemplo de esta aplicación es la investigación realizada por Sisti et ^al.13, describiendo la germinación y las etapas iniciales del desarrollo de protocormos en Pogoniopsis schenckii, una orquídea micoheterótrofa, en asociación con algunos de sus aislados, que comprenden hongos endófitos no micorrícicos. El protocolo de germinación simbiótica aplicado se detalla y presenta en un video de Pena-Passos et ^al.10. El aislamiento de hongos en asociación con diferentes órganos de la planta permite diversos enfoques de investigación con respecto a la naturaleza de las interacciones planta-hongo (por ejemplo, para comprender los aspectos ecológicos o fisiológicos de la asociación, así como indagaciones sobre la transferencia de nutrientes de los hongos a la planta)⁹.

Las metodologías presentadas en la sección 1 se basan en la recolección de muestras de órganos subterráneos, ya que estos órganos presentan más dificultades en la recolección, y son de gran interés ya que los endófitos micorrícicos los colonizan. Sin embargo, ambos protocolos incluidos (pasos 1.1 y 1.2) pueden aplicarse a otros órganos de plantas micoheterótrofas (p. ej., rizomas, tallos florales y frutos). La metodología de recolección descrita en el paso 1.1 está diseñada para aislar hongos endófitos (sección 2), para la caracterización morfológica (secciones 4 y 5) y/o la extracción total de ADN para la identificación aislada (sección 6). Por otro lado, la metodología de recolección descrita en el paso 1.2 se asigna exclusivamente a la extracción de ADN total de tejidos vegetales para técnicas de metabarcoding (sección 7). En la sección 3 se presentan cuatro métodos de almacenamiento y conservación de hongos filamentosos, dos para el almacenamiento a corto plazo (3-6 meses) y los otros dos adecuados para el almacenamiento a largo plazo (>1 año). La caracterización morfológica (secciones 4 y 5) puede asociarse con la identificación molecular para reforzarla y proporcionar información importante sobre la macro y micromorfología fúngica. En la Figura 1 se resumen las metodologías colectivas que se describen a continuación.

Figura 1: Resumen esquemático de los métodos presentados. Recolección de plantas y aislamiento, preservación e identificación molecular de hongos mediante metodologías dependientes e independientes del cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Recogida de muestras de plantas

1. Recopilación de muestras para métodos dependientes de la referencia cultural
   1. Excava cuidadosamente los órganos subterráneos; Estos pueden ser raíces, tallos, rizomas u órganos de almacenamiento de la planta que se va a recolectar. Aparte de los suelos muy compactos, recoja estas muestras a mano.
      NOTA: El uso de herramientas como llanas o cucharas en este paso es desaconsejable, ya que puede dañar las estructuras frágiles de las plantas micoheterótrofas y puede causar contaminación de los tejidos por hongos no endófitos.
   2. Recoge tantos órganos subterráneos como sea posible. Mantenga las muestras en bolsas de papel dentro de un recipiente refrigerado (por ejemplo, una caja de espuma de poliestireno o una bolsa térmica con hielo). Si también se recogen órganos aéreos, transpórtelos por separado de los subterráneos.
2. Recogida de muestras para métodos independientes de la referencia cultural
   1. Excave cuidadosamente las raíces de la planta que se va a recolectar bajo las mismas recomendaciones señaladas en la NOTA del paso 1.1.1.
   2. Recoge tantos órganos subterráneos como sea posible. Mantenga las muestras recolectadas en criotubos dentro de nitrógeno líquido (opción deseable) o use tubos de centrífuga rodeados de hielo seco (opción alternativa). Mantenga los órganos aéreos por separado, si se recogen.

2. Aislamiento de hongos endófitos asociados a órganos vegetales¹⁴

NOTA: Todos los materiales, soluciones y reactivos utilizados en esta sección deben ser estériles. Los que no se pueden comprar ya esterilizados deben esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 min.

1. Desinfestación superficial de órganos vegetales
   1. Lave las muestras recogidas (paso 1.1.2) con agua corriente y elimine la mayor cantidad posible de sustrato y otros residuos que puedan tener las muestras.
   2. Dentro de una campana de flujo laminar, mantenga las muestras lavadas sumergidas en etanol al 70% durante 1 min (se puede usar un vaso de precipitados o un frasco de vidrio).
   3. Transfiera las muestras a otro recipiente con hipoclorito de sodio con cloro activo al 2% durante 3 min.
   4. Cambie las muestras a un recipiente con etanol al 70% y manténgalas sumergidas durante 1 min. Después, lave las muestras secuencialmente en dos recipientes con agua destilada.
2. Instalación de fragmentos de plantas en medio de cultivo
   NOTA: Cada paso detallado en el paso 2.2 debe realizarse dentro de una campana de flujo laminar.
   1. Antes de la instalación, prepare placas de Petri (8-10 cm de diámetro) con 19,5 g/L de medio de cultivo en agar patata dextrosa (PDA) + 7 g/L de agar bacteriológico + 3 mL/L de antibióticos (por ejemplo, estreptomicina, penicilina, tetraciclina, ampicilina).
   2. Mantenga las placas de Petri con el medio de cultivo a 36 °C durante 24 h antes de usarlas para asegurarse de que no haya contaminación. Deseche los platos contaminados con colonias de bacterias u hongos.
      NOTA: La adición de antibióticos en el medio es esencial en este paso, ya que los órganos están altamente infectados por bacterias que pueden inhibir el crecimiento de hongos. Verifique si los antibióticos se pueden calentar durante el autoclave; algunos antibióticos deben agregarse después de enfriar el medio a alrededor de 36 ° C (antes de colocarlo en los platos).
   3. Inmediatamente después de la desinfestación superficial de las muestras y aún dentro de una campana de flujo laminar, en PDA, inocular unas gotas del agua destilada del último recipiente utilizado para lavar las muestras. Este paso es importante para evaluar la eficacia de la desinfestación superficial de las muestras.
   4. En un plato vacío esterilizado en autoclave, coloque las muestras y utilice un bisturí flameado y unas pinzas para seccionar las muestras hasta un grosor de unos 0,2 cm.
   5. Seccionar las muestras cilíndricas longitudinalmente en dos mitades si se desea amplificar la superficie en contacto con el medio. Para exponer mejor las frutas y otros órganos más esféricos, pique o corte bien las estructuras. Las semillas también pueden ser fuentes importantes de hongos, así que asegúrese de que la fruta seccionada las exponga al medio.
      NOTA: Solo los órganos sanos, sin daño tisular o señales de posibles enfermedades o infecciones patógenas, deben usarse en el aislamiento de endófitos fúngicos.
   6. Distribuya cinco fragmentos de los órganos subterráneos en las placas de Petri con PDA + antibiótico. Asegúrese de que los fragmentos estén lo más lejos posible entre sí y que no toquen los bordes del plato. No coloque ningún fragmento en el medio. Preparar réplicas de cada órgano instalado, como precaución en caso de contaminación.
   7. Selle las placas de Petri con film transparente y guárdelas en la oscuridad a 25-27 °C (preferiblemente en una incubadora) durante 5 días.
3. Cálculo de frecuencia de aislamiento (IF)¹¹
   1. Después de 5 días de incubación de los fragmentos de órganos, calcule el FI, de acuerdo con el número de fragmentos incubados que presentan colonias fúngicas en crecimiento dividido por el total de fragmentos incubados, como se representa en la siguiente ecuación:
      
4. Purificación de aislados fúngicos mediante estriado y subcultivo
   NOTA: Cada paso detallado en el paso 2.4 debe realizarse dentro de una campana de flujo laminar.
   1. Preparar placas de Petri (5 cm de diámetro) con 5-7 g/L de agar-agar (AA; solo agar bacteriológico). Mantener la vajilla durante 24 h a 36 °C para eliminar los posibles contaminantes.
   2. Identifique cada colonia de hongos cultivados con un código y delimite sus márgenes en la parte inferior del plato (se puede hacer con un marcador permanente). Diferencie las colonias por color, patrón de crecimiento, textura y formato de margen.
   3. Con un palillo de madera esterilizado en autoclave, con la punta fina, recupere una pequeña cantidad de micelio de una colonia de hongos. Concéntrese preferentemente en los márgenes de la colonia y elija un área lo más alejada posible de otra colonia, evitando recuperar más de un tipo de colonia a la vez.
   4. Usando el mismo palillo de dientes con micelio en la punta, estriar el AA produciendo tres estrías (surcos). Asegúrese de que cada estría esté a una distancia de 1 cm de la otra y de los bordes del plato. Escriba el código apropiado (con papel adhesivo y lápiz), selle los platos y manténgalos incubados en la oscuridad a 25-27 ° C durante 3 días.
   5. Preparar placas de Petri (8 cm de diámetro) con PDA de 39 g/L. No es necesario agregar antibióticos en esta etapa.
   6. Después de incubar las placas AA, obsérvelas meticulosamente a contraluz (de una lámpara o una ventana), con el objetivo de identificar hifas finas que forman colonias individuales. Delimite el área de una colonia individual por placa, usando un marcador permanente en la parte inferior de la placa de Petri.
   7. En una campana de flujo laminar, use un palillo de dientes esterilizado en autoclave para cortar una porción del medio que contiene la colonia y transfiera el volumen cortado al centro de una nueva placa PDA.
   8. Identifique las placas de Petri con los códigos de los aislados, selle las placas con film transparente y manténgalas en la oscuridad a 25-27 °C durante 7-14 días.

3. Conservación de aislados fúngicos purificados

NOTA: Todos los materiales, soluciones y reactivos utilizados en esta sección deben ser estériles. Los que no se pueden comprar ya esterilizados deben esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 min.

1. Conservación con el método de Castellani o en aceite mineral (3-6 meses)^11,15
   1. Preparar tubos de microcentrífuga de 2 mL con 0,5 mL de agua destilada o que contengan 0,5 mL de aceite mineral (dependiendo del método elegido). Asegúrese de que los tubos estén vacíos en autoclave y que el agua y el aceite esterilizados en autoclave se agreguen a los tubos dentro de una campana de flujo laminar.
   2. En una campana de flujo laminar, colocar las placas de Petri con aislados purificados ya cultivados en PDA (39 g/L) durante 7-14 días. Con un palillo esterilizado en autoclave, corte cuboides pequeños (0,5 cm x 0,5 cm en la zona superior) de medio que contengan los márgenes del micelio.
   3. Coloque de cuatro a seis cuboides en los tubos de microcentrífuga con agua destilada (método de Castellani) o aceite mineral. Almacene los tubos en la oscuridad, a 25 °C durante el tiempo que sea necesario, respetando las limitaciones de tiempo del método.
      NOTA: Evite agregar demasiados cuboides a los tubos y hacerlos llenos, lo que puede aumentar las posibilidades de contaminación. Es posible mantener los tubos refrigerados, lo que puede favorecer la conservación de algunos aislados durante más tiempo. Currah et ^al.16 recomiendan almacenar las réplicas de aislados de hongos micorrícicos de orquídeas tropicales tanto refrigeradas como a 25 °C, ya que pueden perderse cuando se almacenan en frío.
   4. Recupere un cuboide y colóquelo en el centro de una nueva antena PDA para cultivar un aislado almacenado.
2. Criopreservación en granos de arroz sin cáscara (>1 año)¹⁷
   1. Lave los granos de arroz sin cáscara en agua corriente y cocínelos hasta que la cáscara de arroz comience a abrirse. Distribuir los granos cocidos en tubos de ensayo de vidrio con tapón de rosca y esterilizar en autoclave dos veces con un intervalo de 24 h entre ellos.
   2. En una campana de flujo laminar, colocar las placas de Petri con aislados purificados ya cultivados en PDA (39 g/L) durante 7-14 días. Con un palillo esterilizado en autoclave, recupere cinco pequeños fragmentos de hifas de los márgenes del micelio e inocule en el tubo que contiene los granos de arroz esterilizados en autoclave.
      NOTA: La inoculación de hifas en diferentes puntos y profundidades del tubo garantiza que el aislado colonice los granos de arroz sin cáscara en menos tiempo.
   3. Incubar los tubos en la oscuridad a 25-27 °C durante 14 días. Agite los tubos en vórtice cada 3 días para mantener los granos individualizados.
   4. Después de observar el crecimiento de hongos en los granos de arroz, distribuya los granos en una placa de Petri esterilizada en autoclave forrada con papel de filtro para absorber la humedad, sobre el papel para que los granos se sequen. Conservar en la oscuridad a 25-27 °C durante 2-3 días.
   5. Prepare los criotubos con 1/3 de gel de sílice en la parte inferior y 1/3 de lana de vidrio por encima de la sílice. Finalmente, distribuya 1/3 de los granos de arroz con micelio fúngico cultivado. Conservar a -20 °C durante 24 h.
   6. Después de 24 h, almacenar los criotubos a -80 °C durante el tiempo que sea necesario, respetando las limitaciones de tiempo del método.
3. Criopreservación en vermiculita mediante crioprotector (>1 año)¹⁸
   1. Preparar un medio de cultivo líquido compuesto por un 0,2% de extracto de levadura y un 2% de glucosa en agua destilada. Ajuste el pH a 5 y autoclave.
   2. Distribuir 0,2 g de vermiculita (utilizar granulometría fina) en criotubos con tapón de rosca y esterilizarlos en autoclave. Agregue 0,8 ml de medio líquido esterilizado en autoclave a los criotubos que contienen vermiculita.
   3. En una campana de flujo laminar, colocar las placas de Petri con aislados purificados ya cultivados en PDA (39 g/L) durante 7-14 días. Con un palillo esterilizado en autoclave, recupere de tres a cinco fragmentos de hifas de los márgenes del micelio e inocule a lo largo del tubo que contiene vermiculita + medio de cultivo líquido. Recuerde identificar los criotubos con el respectivo código de aislamiento.
      NOTA: La inoculación de hifas en diferentes puntos y profundidades del criotubo garantiza que el aislado colonice la vermiculita en menos tiempo.
   4. Almacenar los criotubos en la oscuridad a 25-27 °C hasta que se pueda observar la colonización de la mayoría de los granos de vermiculita, lo que suele tardar unos 14 días.
   5. Preparar una solución crioprotectora compuesta por un 5% de glicerol y un 5% de trehalosa en agua destilada y esterilizarla en autoclave. Deje que la solución se enfríe antes de usarla.
   6. Después de que la vermiculita en los criotubos sea colonizada por el respectivo aislado de hongo, distribuya 0,4 mL de crioprotector en cada tubo y mantenga los criotubos refrigerados a 4 °C durante 48 h. Posteriormente, mantenga los criotubos a -80 °C durante el tiempo que sea necesario, respetando las limitaciones de tiempo del método.

4. Caracterización macromorfológica de hongos filamentosos (morfología de colonias)

1. Mantener un registro fotográfico del micelio cultivado en cada placa de Petri con 39 g/L PDA durante 7-14 días. Recuerde registrar ambos lados de la colonia, superior e inferior (reverso). Si los platos se van a usar fácilmente en la sección 6 o no se mantienen, abra los platos al fotografiarlos para obtener mejores fotos.
2. Si está interesado en datos cuantitativos sobre la morfología de la colonia, el subcultivo replica los aislados y los mantiene en las mismas condiciones de crecimiento y durante un período constante para registrar el diámetro de la colonia y calcular la tasa de crecimiento (generalmente en mm/h).
   NOTA: Se pueden lograr resultados cuantitativos más sofisticados utilizando diferentes tipos de medios de cultivo para la comparación¹⁹ y considerando las herramientas estadísticas para tratar los datos.
3. Observe las colonias bajo un microscopio estereoscópico para identificar las características morfológicas y fotografiarlas con aumento. Evaluar las colonias de acuerdo a sus características macromorfológicas, tal y como se detalla en el apartado de resultados. Consultar diversas fuentes bibliográficas que ayuden a categorizar y relacionar la macromorfología con la identificación molecular y/o morfológica.

5. Caracterización micromorfológica de hongos filamentosos (morfología de hifas)

NOTA: Las técnicas micromorfológicas se comparan en la sección de discusión, considerando sus posibles usos y desventajas.

1. Cultive los aislados en placas de Petri con 39 g/L de PDA durante 7-14 días. Para evaluar los hongos micorrícicos putativos de las orquídeas, cultive los aislados en agar harina de maíz (CMA; u otro medio limitante de nutrientes) de 17 g/L durante 3-7 días¹⁹.
2. Montura de burla
   1. Trabaje dentro de una campana de flujo laminar. Coloque una gota de un tinte elegido (paso 5.5) en un portaobjetos de vidrio limpio.
   2. Con un palillo de dientes esterilizado en autoclave u otro material estéril, retire con cuidado algunas hifas del aislado cultivado y colóquelas en la gota de mancha. Coloque un cubreobjetos (preferiblemente en un ángulo inicial de 45° para evitar burbujas de aire) y analice bajo un microscopio óptico.
3. Soporte de cinta adhesiva
   NOTA: Esta técnica se suele aplicar en cultivos fúngicos para ser fácilmente utilizados en la sección 6 o no mantenidos, ya que la cinta adhesiva no se puede esterilizar en autoclave, y pueden producirse contaminaciones después de ejecutar el método.
   1. Coloque una gota de un tinte elegido (paso 5.5) en un portaobjetos de vidrio limpio. Corta una tira de cinta adhesiva transparente del tamaño que se ajuste bien al portaobjetos de vidrio y a la caída del tinte central.
   2. Dirija la superficie pegajosa de la tira hacia la superficie del micelio. No presiones, y trata de recoger algunas hifas sin pegar demasiadas.
   3. Pega la cinta al portaobjetos de vidrio, asegurándote de que la mancha esté en contacto con las hifas recogidas. Coloque una gota de agua sobre la cinta y coloque un cubreobjetos. Analice el portaobjetos bajo un microscopio óptico.
4. Cultivo de diapositivas de hongos filamentosos²⁰
   1. Dentro de una placa de Petri grande (>9 cm de diámetro, preferiblemente), coloque: papel de filtro en la parte inferior, una varilla de vidrio en forma de U o una adaptación (el objetivo es proporcionar una elevación para el portaobjetos de vidrio), un portaobjetos de vidrio y dos cubreobjetos. Las placas de Petri más altas facilitan la manipulación. Autoclave estos kits de placas de Petri, uno para cada aislado.
   2. Preparar un pequeño volumen de 39 g/L de PDA o 17 g/L de CMA, añadir 10 g/L de agar bacteriológico y autoclave (el volumen de una placa de Petri es suficiente para más de 30 aislamientos). Los medios de cultivo utilizados en el cultivo de diapositivas deben ser más duros que los medios habituales. Autoclave 100 mL de agua destilada.
   3. Trabaje dentro de una campana de flujo laminar. Coloque el medio líquido en una placa de Petri, produciendo una capa de alrededor de 0,5 cm de altura. Deja que el medio se solidifique. Una vez sólido, use un bisturí estéril para cortar cuadrados del medio que tengan una dimensión de 1 cm x 1 cm.
   4. Abra el kit de placa de Petri dentro de una campana de flujo laminar y use pinzas flameadas para organizar el material esterilizado en autoclave dentro de la placa. Coloque el material en el orden numerado, como se ve en la Figura 2A, colocando un cuadrado de medio de cultivo en el portaobjetos de vidrio. Antes de colocar el cubreobjetos sobre el medio, continúe con el paso 5.4.5.
   5. Use un palillo de dientes esterilizado en autoclave para recuperar algunas hifas de un aislado y frote cuidadosamente las cuatro caras laterales del medio colocado en el portaobjetos de vidrio. Coloque un cubreobjetos esterilizado en autoclave sobre el cuadrado mediano con pinzas flameadas.
   6. Utilice una punta de pipeta estéril para colocar agua esterilizada en autoclave en el papel de filtro, para crear una cámara húmeda. Utilice un volumen para saturar el papel sin colocar agua en exceso. Selle la placa de Petri con film transparente e identifíquela con el respectivo código de aislamiento. Mantener la vajilla en la oscuridad a 25-27 °C durante 3-7 días.
   7. Evalúe el crecimiento de las hifas en el portaobjetos de vidrio y en el cubreobjetos. A partir de cada kit de cultivo de portaobjetos se producen dos portaobjetos, uno utilizando el portaobjetos de vidrio con hifas y el cubreobjetos esterilizado en autoclave, el segundo utilizando el portaobjetos con hifas y otro portaobjetos de vidrio.
   8. Después de observar el crecimiento de las hifas, separe con cuidado el cuadrado de medio del portaobjetos de vidrio (Figura 2B), monte los dos portaobjetos utilizando una tinción elegida (paso 5.5) y analice bajo un microscopio óptico. Recuerde identificar el código de aislamiento en la diapositiva. Para producir portaobjetos semipermanentes, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
   9. Para producir portaobjetos permanentes, lave cuidadosamente el tinte de las hifas adheridas después de teñirlo y deje que el portaobjetos se seque. Monte con un medio de montaje rápido (para más detalles, lea Peña-Passos et ^al.10).
      NOTA: El inconveniente de producir un portaobjetos permanente con esta técnica es que las esporas y las estructuras no adheridas al vidrio pueden lavarse.
5. Métodos de tinción y observación de hifas
   1. Azul de algodón de lactofenol (LPCB)21: Agregue 20 ml de ácido láctico, 40 ml de glicerol y ²⁰ ml de agua destilada. Disuelva 20 g de cristales de fenol en esta solución calentando suavemente. Disolver 0,05 g de azul de metilo (azul de algodón o 2 ml de solución acuosa al 1%). El LPCB también se puede comprar fácilmente ya preparado.
      PRECAUCIÓN: El fenol es altamente tóxico y volátil; Manipularlo exclusivamente dentro de una campana extractora y usar guantes.
   2. Azul de toluidina O¹⁰ (TBO): Preparar TBO al 0,05% en tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8).
   3. Rojo Congo^22,23,24: Preparar una solución de rojo Congo al 1% en agua destilada y filtrarla. Incubar durante 5-10 min. Este colorante también se puede aplicar para microscopía de fluorescencia²⁵.
   4. Al observar y fotografiar hifas fúngicas bajo un microscopio óptico, consulte diversas fuentes bibliográficas para ayudar a identificar estructuras (consulte la discusión).

Figura 2: Procedimientos para el cultivo de portaobjetos de hongos filamentosos . (A) Configuración esquemática de un kit de cultivo de portaobjetos, donde los números indican el orden de disposición de los elementos. (B) Se observa el desprendimiento del cuadrado del medio de cultivo después del crecimiento de hifas en el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Extracción de ADN total de aislados fúngicos (protocolo casero²⁶ con modificaciones ²⁷)

NOTA: Todos los materiales, soluciones y reactivos utilizados en esta sección deben ser estériles. Los que no se pueden comprar ya esterilizados deben esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 min. Use guantes durante todo el protocolo y realice algunas etapas dentro de una campana extractora.

1. Prepare el tampón de extracción: dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1%, 250 mM de NaCl, 200 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y 25 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Cultive los aislados purificados en 39 g/L de PDA durante 7-14 días.
2. Raspar cuidadosamente el micelio de un aislado con una espátula o una cuchara y transferir los fragmentos a un mortero esterilizado en autoclave, evitando transferir el medio de cultivo con el agregado de hifas. Con un mortero de porcelana, muele el micelio con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. No deje que el micelio que se está moliendo se derrita, agregando nitrógeno para evitarlo.
3. Agregue 1 ml de tampón de extracción en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y coloque la muestra molida hasta la marca de 1,5 ml. Agitar suavemente el contenido de los tubos para homogeneizar.
4. Agitar los tubos en un vórtice durante 5 s y colocarlos en un termobloque a 65 °C durante 20 min. Homogeneizar cuidadosamente el contenido por inversión cada 7-10 min.
5. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera 800 μL de la fase superior a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 mL, agregue 800 μL de fenol a los tubos y mezcle el contenido por inversión.
   PRECAUCIÓN: El fenol es un reactivo altamente tóxico y volátil; Puede causar eritema, gangrena y necrosis tisular. Cuando se inhala, puede causar disnea y tos. La absorción sistémica puede dañar el hígado, los riñones y el sistema nervioso central. Manipule el fenol exclusivamente dentro de una campana extractora y use guantes.
   NOTA: A partir del siguiente paso, use guantes y realice el protocolo dentro de una campana extractora.
6. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C y transferir 800 μL de la fase superior a un nuevo tubo de 2 mL, evitando cuidadosamente la transferencia del contenido de la fase inferior.
7. Añadir 400 μL de fenol y 400 μL de cloroformo a los tubos y mezclar el contenido por inversión. Centrifugarlos a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   PRECAUCIÓN: El cloroformo es un reactivo altamente tóxico y volátil; Puede causar irritación y lesiones cuando entra en contacto con la piel y, si se inhala, afecta los sistemas nervioso central y cardiorrespiratorio, el hígado y los riñones. Manipule el cloroformo exclusivamente dentro de una campana extractora y use guantes.
8. Recupere 800 μL o menos de la fase superior a un nuevo tubo de 2 mL. Añadir 800 μL de cloroformo, mezclar el contenido por inversión y centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   NOTA: En este paso, no se deben transferir residuos de la fase inferior a tubos nuevos. Por lo tanto, tenga mucho cuidado al recuperar la fase superior.
9. Transfiera 600-800 μL de la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 mL y agregue 450 μL de isopropanol. Mezclar el contenido por inversión e incubar a 25 °C durante 5 min.
10. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante con una micropipeta. Tenga cuidado de no desechar el gránulo depositado en el fondo del tubo.
11. Añadir 500 μL de etanol al 80% y centrifugar durante 5 min. Repita dos veces en caso de que el gránulo no se aclare.
12. Retirar el etanol con una micropipeta y secar el pellet a 37 °C durante 30-60 min. Añadir 30-50 μL de agua desionizada, eluyendo el pellet con una micropipeta.
13. Mantenga los tubos a 4 °C durante la noche para una elución completa del ADN y congele el contenido a -20 °C.

7. Extracción de ADN total de órganos vegetales para metodología de metabarcoding (kit comercial)

NOTA: Para la siguiente metodología, es necesario adquirir el kit comercial indicado en la Tabla de Materiales como kit de extracción de ADN de suelo. Todos los materiales, soluciones y reactivos utilizados en esta sección deben ser estériles. Los que no se pueden comprar ya esterilizados deben esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 min. Se recomienda encarecidamente el uso de guantes durante todo el protocolo, y los pasos se pueden realizar dentro de una campana de flujo laminar. El protocolo descrito es una modificación de De Souza et ^al.12, a partir del protocolo detallado por el fabricante.

1. Utilizando morteros de porcelana, muela las raíces recogidas siguiendo el paso 1.2 en nitrógeno líquido, reduciendo las muestras a un polvo fino. Añadir 0,3 g de las muestras molidas a los tubos PowerBead y agitar suavemente para homogeneizar.
2. Añadir 60 μL de solución C1 (incluida en el kit) a los tubos PowerBead y mezclar el contenido por inversión. Utilizando un homogeneizador de tejidos y un lisador celular (Tabla de Materiales), ate los tubos firmemente a un soporte adecuado, acople el soporte al vórtice y ponga en marcha el equipo a máxima velocidad durante 10-20 min.
   NOTA: En caso de que la solución C1 se precipite, caliéntela a 60 °C hasta su completa disolución.
3. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 30 s a 25 °C. Transfiera 500 μL del sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 2 mL. El contenido transferido puede ser partículas.
4. Añadir 250 μL de solución C2 a los tubos y agitar en un vórtice durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min y luego centrifugar a 10.000 x g durante 1-2 min a 25 °C.
5. Transfiera más de 600 μL del sobrenadante a nuevos tubos de 2 mL, evitando el pellet. Añadir 200 μL de solución C3 y agitar en un vórtice durante 5 s.
6. Incubar a 4 °C durante 5 min y luego centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a 25 °C. En esta etapa, asegúrese de que el sobrenadante no sea partícula.
7. Transfiera más de 750 μL del sobrenadante a nuevos tubos de 2 mL, evitando el pellet. Homogeneizar bien la solución C4, añadir 1.100 μL de solución C4 al sobrenadante y agitar en un vórtice durante 5 s.
8. Cargue 675 μL del contenido de los tubos en las columnas de centrifugación MB, sobre el filtro, y centrifugue a 10.000 x g durante 1 min a 25 °C. Deseche el contenido líquido.
9. Repita el paso anterior dos veces hasta que se procese todo el contenido de cada tubo. A continuación, añadir 500 μL de solución C5 en el centro del filtro presente en la columna superior del tubo y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a 25 °C.
10. Deseche el contenido líquido y vuelva a centrifugar en las mismas condiciones que en el paso anterior. Transfiera con cuidado la columna superior de la columna giratoria MB a nuevos tubos de microcentrífuga de 2 ml, evitando gotear cualquier contenido líquido en la columna.
11. Añadir 85-100 μL de solución C6 en el centro del filtro y esperar 1 min. Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a 25 °C y desechar la columna de centrifugación MB. Almacenar los tubos a -80 °C.

8. Cuantificación de ADN en un espectrofotómetro (consultar la Tabla de Materiales)

1. Con el espectrofotómetro indicado, abra el software. Seleccione la opción Ácido nucleico, elija la opción ADN y establezca la concentración en ng/μL.
2. Agregue 1 μL de agua desionizada al detector de espectrofotómetro y calibre seleccionando la opción En blanco. Después de leer, limpie suavemente el detector con papel de seda suave.
3. Asigne un nombre a la muestra de campo con el código de aislamiento de la muestra a leer y coloque 1 μL de la misma en el detector del equipo. Seleccione la opción Medir; Se genera un gráfico y una tabla con los resultados.
4. Repita el paso 8.3 hasta que se hayan leído todas las muestras. Se recomienda guardar la tabla con los resultados generados para su registro y análisis: seleccione la opción Informes y la ubicación donde se guardará el archivo .xml.
5. Agregue 5 μL de agua desionizada al detector, espere varios minutos y límpielo suavemente con papel de seda suave.

Resultados

En el protocolo de aislamiento, considerando que existe contaminación por el agua utilizada en el último lavado y que la contaminación también se detecta en las placas de Petri con fragmentos inoculados, se pueden tomar diferentes acciones, dependiendo del tipo de contaminante (Tabla 1). Este procedimiento debe repetirse desde el principio en caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que también presentan un crecimiento acelerado, y bacterias de multipl...

Discusión

La desinfestación superficial de muestras de plantas es una de las etapas más críticas en el protocolo presentado. Es muy deseable que no se contaminen las antenas PDA con gotas del último lavado. Las bacterias se observan con frecuencia como contaminantes en las placas de aislamiento, generalmente más que los hongos esporulantes en el aire, considerando que las bacterias endófitas también son comunes dentro de los tejidos vegetales ^3,11. Por lo tanto, la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)