Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Résumé

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Résumé

Les plantes mycohétérotrophes présentent l’une des formes les plus extrêmes de dépendance mycorhizienne, ayant totalement perdu leur capacité autotrophe. Aussi essentiels que toute autre ressource vitale, les champignons auxquels ces plantes s’associent intimement leur sont essentiels. Par conséquent, certaines des techniques les plus pertinentes dans l’étude des espèces mycohétérotrophes sont celles qui permettent d’étudier les champignons associés, en particulier ceux qui habitent les racines et les organes souterrains. Dans ce contexte, des techniques d’identification des champignons endophytes dépendants et indépendants de la culture sont couramment appliquées. L’isolement des endophytes fongiques permet de les identifier morphologiquement, d’analyser leur diversité et de maintenir les inocules pour des applications dans la germination symbiotique des graines d’orchidées. Cependant, on sait qu’il existe une grande variété de champignons non cultivables qui habitent les tissus végétaux. Ainsi, les techniques d’identification moléculaire indépendantes de la culture offrent une couverture plus large de la diversité et de l’abondance des espèces. L’objectif de cet article est d’apporter le soutien méthodologique nécessaire à la mise en place de deux procédures d’investigation : l’une dépendante de la culture et l’autre indépendante. En ce qui concerne le protocole dépendant de la culture, les processus de collecte et de conservation des échantillons de plantes des sites de collecte aux installations de laboratoire sont détaillés, ainsi que l’isolement des champignons filamenteux des organes souterrains et aériens des plantes mycohétérotrophes, la conservation d’une collection d’isolats, la caractérisation morphologique des hyphes par la méthodologie de culture sur lame et l’identification moléculaire des champignons par extraction totale de l’ADN. Englobant des méthodologies indépendantes de la culture, les procédures détaillées comprennent la collecte d’échantillons de plantes pour des analyses métagénomiques et l’extraction totale de l’ADN à partir d’organes végétaux achlorophylliens à l’aide d’un kit commercial. Enfin, des protocoles de continuité (p. ex., réaction en chaîne par polymérase [PCR], séquençage) sont également suggérés pour les analyses, et les techniques sont présentées ici.

Introduction

Les champignons endophytes sont, par définition, ceux qui habitent l’intérieur des organes et des tissus végétaux lors d’infections discrètes (c’est-à-dire sans causer de dommages à leur hôte)^1,2. Ces champignons peuvent interagir de manière neutre ou bénéfique avec les plantes hôtes, peuvent conférer une résistance aux agents pathogènes et aux conditions environnementales défavorables, et peuvent contribuer à la synthèse de composés bénéfiques pour la plante (par exemple, les facteurs de croissance et d’autres phytohormones)^1,3. Les endophytes mycorhiziens sont des champignons qui établissent des associations mycorhiziennes avec la plante, participant au transfert des nutriments⁴. Chez les Orchidaceae, l’interaction avec les endophytes mycorhiziens est fondamentale pour la germination des graines chez la grande majorité des espèces, et l’établissement des plantules chez toutes les plantes de la famille⁵. Dans de tels contextes, les orchidées mycohétérotrophes représentent un cas de dépendance totale vis-à-vis de leurs partenaires mycorhiziens, car elles dépendent du transfert de nutriments minéraux et de composés carbonés par ces champignons pendant tout leur cycle de vie⁶. Par conséquent, l’isolement et l’identification des champignons associés est une base fondamentale lors de l’étude des stratégies de vie mycohétérotrophes. De plus, on sait peu de choses sur les rôles des endophytes fongiques chez les plantes mycohétérotrophes ou même sur la diversité réelle de ces champignons ^7,8.

L’étude des champignons endophytes peut être menée à l’aide de différentes techniques, traditionnellement décrites comme indépendantes ou dépendantes de la culture, par exemple : (a) l’observation directe, (b) l’isolement fongique et l’identification morphologique et/ou moléculaire, et (c) l’extraction totale de l’ADN des tissus végétaux et l’identification moléculaire⁹. Dans l’observation directe (a), les champignons endophytes peuvent être étudiés alors qu’ils sont encore à l’intérieur des cellules et des tissus végétaux par microscopie optique ou électronique⁹, car différents protocoles de microscopie sont détaillés par Pena-Passos et ^al.10. Par des méthodes d’isolement (b), les endophytes fongiques peuvent être caractérisés en fonction de leurs colonies, de leurs hyphes et de la morphologie de leur structure de reproduction ou de résistance. De plus, grâce à des techniques d’isolement, il est possible d’effectuer l’identification moléculaire des isolats par extraction d’ADN, amplification de séquences d’identification moléculaire (codes-barres ou empreintes digitales) et séquençage¹¹. Cette dernière technique (c) permet l’identification moléculaire de champignons endophytes par extraction d’ADN à l’intérieur des tissus végétaux (métabarcoding), suivie d’une préparation et d’un séquençage de la bibliothèque¹².

De plus, des isolats fongiques peuvent être appliqués dans des essais de germination symbiotique, en utilisant des graines d’orchidées autotrophes ou mycohétérotrophes. Un exemple d’une telle application est l’étude menée par Sisti et ^al.13, décrivant la germination et les premiers stades de développement du protocorme chez Pogoniopsis schenckii, une orchidée mycohétérotrophe, en association avec certains de ses isolats, comprenant des champignons endophytes non mycorhiziens. Le protocole de germination symbiotique appliqué est détaillé et présenté dans une vidéo par Pena-Passos et ^al.10. L’isolement des champignons en association avec différents organes végétaux permet d’orienter diverses recherches sur la nature des interactions plantes-champignons (par exemple, pour comprendre les aspects écologiques ou physiologiques de l’association, ainsi que des enquêtes sur le transfert des nutriments des champignons à la plante)⁹.

Les méthodologies présentées dans la section 1 sont basées sur une collecte d’échantillons d’organes souterrains, car ces organes présentent le plus de difficultés à collecter, et ils présentent un intérêt majeur puisque les endophytes mycorhiziens les colonisent. Cependant, les deux protocoles inclus (étapes 1.1 et 1.2) peuvent être appliqués à d’autres organes végétaux mycohétérotrophes (p. ex., rhizomes, tiges florales et fruits). La méthode de collecte décrite à l’étape 1.1 est destinée à l’isolement des champignons endophytes (section 2) pour la caractérisation morphologique (sections 4 et 5) et/ou à l’extraction totale de l’ADN pour l’identification des isolats (section 6). D’autre part, la méthodologie de collecte décrite à l’étape 1.2 est exclusivement attribuée à l’extraction totale de l’ADN des tissus végétaux pour les techniques de métabarcoding (section 7). Dans la section 3, quatre méthodes de stockage et de conservation des champignons filamenteux sont présentées, deux pour le stockage à court terme (3 à 6 mois) et les deux autres adéquates pour le stockage à long terme (>1 an). La caractérisation morphologique (sections 4 et 5) peut être associée à l’identification moléculaire pour la renforcer et fournir des informations importantes sur la macro- et micromorphologie fongique. La figure 1 résume les méthodologies collectives décrites ci-dessous.

Figure 1 : Résumé schématique des méthodes présentées. Collecte de plantes et isolement fongique, préservation et identification moléculaire par des méthodologies dépendantes et indépendantes de la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. Prélèvement d’échantillons de plantes

1. Prélèvement d’échantillons pour les méthodes dépendantes de la culture
   1. Creusez soigneusement les organes souterrains ; Il peut s’agir de racines, de tiges, de rhizomes ou d’organes de stockage de la plante à collecter. En dehors des sols très compacts, collectez ces échantillons à la main.
      REMARQUE : L’utilisation d’outils tels que des truelles ou des pelles dans cette étape est déconseillée, car elle peut endommager les structures fragiles des plantes mycohétérotrophes et peut provoquer une contamination des tissus par des champignons non endophytes.
   2. Collectez autant d’organes souterrains que possible. Conservez les échantillons dans des sacs en papier à l’intérieur d’un contenant réfrigéré (p. ex., une boîte en mousse de polystyrène ou un sac isotherme avec de la glace). Si des organes aériens sont également prélevés, transportez-les séparément des organes souterrains.
2. Prélèvement d’échantillons pour des méthodes indépendantes de la culture
   1. Creusez soigneusement les racines de la plante à collecter selon les mêmes recommandations que celles indiquées dans la NOTE de l’étape 1.1.1.
   2. Collectez autant d’organes souterrains que possible. Conservez les échantillons prélevés dans des cryotubes à l’intérieur d’azote liquide (option souhaitable) ou utilisez des tubes à centrifuger entourés de glace carbonique (option alternative). Conservez les organes aériens séparément, s’ils sont prélevés.

2. Isolement des champignons endophytes associés aux organes végétaux¹⁴

REMARQUE : Tous les matériaux, solutions et réactifs utilisés dans cette section doivent être stériles. Ceux qui ne peuvent pas être achetés déjà stérilisés doivent être autoclavés à 121 °C pendant 20 min.

1. Désinfestation superficielle des organes végétaux
   1. Lavez les échantillons prélevés (étape 1.1.2) à l’eau courante et enlevez autant de substrat et d’autres débris que possible dans les échantillons.
   2. À l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, maintenez les échantillons lavés immergés dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 min (un bécher ou un bocal en verre peut être utilisé).
   3. Transférez les échantillons dans un autre récipient contenant de l’hypochlorite de sodium avec 2 % de chlore actif pendant 3 min.
   4. Changer les échantillons dans un récipient contenant 70% d’éthanol et les maintenir immergés pendant 1 min. Ensuite, lavez les échantillons séquentiellement dans deux récipients avec de l’eau distillée.
2. Installation de fragments végétaux dans un milieu de culture
   REMARQUE : Chaque étape détaillée à l’étape 2.2 doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   1. Avant l’installation, préparer des boîtes de Pétri (de 8 à 10 cm de diamètre) avec 19,5 g/L de milieu de culture de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) + 7 g/L de gélose bactériologique + 3 mL/L d’antibiotiques (p. ex., streptomycine, pénicilline, tétracycline, ampicilline).
   2. Maintenir les boîtes de Pétri avec le milieu de culture à 36 °C pendant 24 h avant de les utiliser pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination. Jetez les plats contaminés par des colonies de bactéries ou de champignons.
      REMARQUE : L’ajout d’antibiotiques dans le milieu est essentiel dans cette étape, car les organes sont fortement infectés par des bactéries qui peuvent inhiber la croissance fongique. Vérifier si les antibiotiques peuvent être chauffés pendant l’autoclavage ; certains antibiotiques doivent être ajoutés après avoir refroidi le milieu à environ 36 °C (avant de le placer dans la vaisselle).
   3. Immédiatement après la désinfestation superficielle des échantillons et toujours à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, en PDA, inoculer quelques gouttes de l’eau distillée du dernier récipient utilisé pour laver les échantillons. Cette étape est importante pour évaluer l’efficacité de la désinfestation superficielle des échantillons.
   4. Dans une boîte autoclavée vide, placez les échantillons et utilisez un scalpel flammé et une pince pour sectionner les échantillons sur une épaisseur d’environ 0,2 cm.
   5. Sectionnez les échantillons cylindriques longitudinalement en deux moitiés si vous le souhaitez pour amplifier la surface en contact avec le milieu. Pour mieux exposer les fruits et autres organes plus sphériques, hachez ou coupez soigneusement les structures. Les graines peuvent également être d’importantes sources fongiques, alors assurez-vous que les fruits sectionnés les exposent au milieu.
      REMARQUE : Seuls les organes sains, sans lésions tissulaires ni signes de maladies possibles ou d’infections pathogènes, doivent être utilisés dans l’isolement des endophytes fongiques.
   6. Répartissez cinq fragments d’organes souterrains dans les boîtes de Pétri avec PDA + antibiotique. Assurez-vous que les fragments sont aussi éloignés que possible les uns des autres et qu’ils ne touchent pas non plus les bords de la parabole. Ne disposez pas de fragments sur le support. Préparer des copies de chaque organe installé, par précaution en cas de contamination.
   7. Scellez les boîtes de Pétri avec du film alimentaire et conservez-les à l’abri de la lumière à 25-27 °C (de préférence dans un incubateur) pendant 5 jours.
3. Calcul de la fréquence d’isolement (FI)¹¹
   1. Après 5 jours d’incubation des fragments d’organes, calculer la FI, en fonction du nombre de fragments incubés qui présentent des colonies fongiques en croissance, divisé par le total des fragments incubés, comme le montre l’équation suivante :
      
4. Purification d’isolats fongiques par striation et sous-culture
   REMARQUE : Chaque étape détaillée à l’étape 2.4 doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   1. Préparer des boîtes de Pétri (5 cm de diamètre) avec 5 à 7 g/L d’agar-agar (AA ; gélose bactériologique uniquement). Maintenir la vaisselle pendant 24 h à 36 °C pour éliminer celles qui pourraient être contaminées.
   2. Identifiez chaque colonie fongique cultivée à l’aide d’un code et délimitez ses marges sur la face inférieure de la boîte (cela peut être fait avec un marqueur permanent). Différenciez les colonies par la couleur, le modèle de croissance, la texture et le format des marges.
   3. À l’aide d’un cure-dent en bois autoclave, à l’aide de la pointe fine, récupérez une infime quantité de mycélium d’une colonie fongique. Concentrez-vous de préférence sur les marges de la colonie et choisissez une zone aussi éloignée que possible d’une autre colonie, en évitant de récupérer plus d’un type de colonie à la fois.
   4. À l’aide du même cure-dent avec du mycélium à l’extrémité, strier l’AA en produisant trois stries (rainures). Assurez-vous que chaque strie est à une distance de 1 cm l’une de l’autre et des bords de la parabole. Écrivez le code approprié (à l’aide d’un papier autocollant et d’un crayon), scellez les plats et maintenez-les incubés dans l’obscurité à 25-27 °C pendant 3 jours.
   5. Préparez des boîtes de Pétri (8 cm de diamètre) avec 39 g/L de PDA. Il n’est pas nécessaire d’ajouter des antibiotiques à ce stade.
   6. Après avoir incubé les boîtes AA, observez-les méticuleusement à contre-jour (d’une lampe ou d’une fenêtre), dans le but d’identifier les hyphes fins formant des colonies individuelles. Délimitez la zone d’une colonie individuelle par boîte, à l’aide d’un marqueur permanent sur la face inférieure de la boîte de Pétri.
   7. Dans une hotte à flux laminaire, utilisez un cure-dent autoclavé pour couper une partie du milieu contenant la colonie et transférer le volume coupé au centre d’une nouvelle boîte PDA.
   8. Identifiez les boîtes de Pétri avec les codes des isolats, scellez les boîtes avec un film alimentaire et maintenez-les dans l’obscurité à 25-27 °C pendant 7 à 14 jours.

3. Conservation des isolats fongiques purifiés

REMARQUE : Tous les matériaux, solutions et réactifs utilisés dans cette section doivent être stériles. Ceux qui ne peuvent pas être achetés déjà stérilisés doivent être autoclavés à 121 °C pendant 20 min.

1. Conservation avec la méthode de Castellani ou dans de l’huile minérale (3-6 mois)^11,15
   1. Préparer des tubes de microcentrifugation de 2 mL avec 0,5 mL d’eau distillée ou contenant 0,5 mL d’huile minérale (selon la méthode choisie). Assurez-vous que les tubes sont vides à l’autoclave et que l’eau et l’huile autoclavées sont ajoutées aux tubes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   2. Dans une hotte à flux laminaire, placez les boîtes de Pétri avec des isolats purifiés déjà cultivés en PDA (39 g/L) pendant 7 à 14 jours. À l’aide d’un cure-dent autoclave, découpez de petits cuboïdes (0,5 cm x 0,5 cm dans la partie supérieure) d’un milieu contenant les marges du mycélium.
   3. Placez quatre à six cuboïdes dans les tubes de la microcentrifugeuse avec de l’eau distillée (méthode de Castellani) ou de l’huile minérale. Conservez les tubes à l’obscurité, à 25 °C, aussi longtemps que nécessaire, en respectant les limites de temps de la méthode.
      REMARQUE : Évitez d’ajouter trop de cuboïdes dans les tubes et de les remplir, ce qui pourrait augmenter les risques de contamination. Il est possible de maintenir les tubes au réfrigérateur, ce qui peut favoriser la conservation de certains isolats plus longtemps. Currah et ^al.16 recommandent de conserver les répétitions d’isolats de champignons mycorhiziens provenant d’orchidées tropicales à la fois au réfrigérateur et à 25 °C, car elles peuvent être perdues lorsqu’elles sont entreposées au froid.
   4. Récupérez un parallélépipède et placez-le au centre d’une nouvelle parabole PDA pour faire pousser un isolat stocké.
2. Cryoconservation dans les grains de riz non décortiqués (>1 an)¹⁷
   1. Lavez les grains de riz non décortiqués à l’eau courante et faites-les cuire jusqu’à ce que la coque de riz commence à s’ouvrir. Répartissez les grains cuits dans des tubes à essai en verre avec un bouchon à vis et autoclavez deux fois avec un intervalle de 24 h entre les deux.
   2. Dans une hotte à flux laminaire, placez les boîtes de Pétri avec des isolats purifiés déjà cultivés en PDA (39 g/L) pendant 7 à 14 jours. À l’aide d’un cure-dent autoclave, prélevez cinq petits fragments d’hyphes sur les marges du mycélium et inoculez-les dans le tube contenant des grains de riz autoclavés.
      REMARQUE : L’inoculation d’hyphes à différents points et profondeurs du tube garantit que l’isolat colonise les grains de riz non décortiqués en moins de temps.
   3. Incuber les tubes dans l’obscurité à 25-27 °C pendant 14 jours. Agitez les tubes en les vortex tous les 3 jours pour garder les grains individualisés.
   4. Après avoir observé la croissance fongique dans les grains de riz, répartissez les grains dans une boîte de Pétri autoclavée tapissée de papier filtre pour absorber l’humidité, sur le papier afin que les grains puissent sécher. Conserver à l’abri de la lumière à 25-27 °C pendant 2-3 jours.
   5. Préparez les cryotubes avec 1/3 de gel de silice au fond et 1/3 de laine de verre au-dessus de la silice. Enfin, répartissez 1/3 des grains de riz avec du mycélium fongique cultivé. Conserver à -20 °C pendant 24 h.
   6. Après 24 h, stocker les cryotubes à -80 °C aussi longtemps que nécessaire, en respectant les limites de temps de la méthode.
3. Cryoconservation dans la vermiculite à l’aide d’un cryoprotecteur (>1 an)¹⁸
   1. Préparer un milieu de culture liquide composé de 0,2 % d’extrait de levure et de 2 % de glucose dans de l’eau distillée. Ajustez le pH à 5 et autoclavez-le.
   2. Répartissez 0,2 g de vermiculite (utilisez une granulométrie fine) dans des cryotubes à l’aide d’un bouchon à vis et autoclavez-les. Ajouter 0,8 mL de milieu liquide autoclavé dans les cryotubes contenant de la vermiculite.
   3. Dans une hotte à flux laminaire, placez les boîtes de Pétri avec des isolats purifiés déjà cultivés en PDA (39 g/L) pendant 7 à 14 jours. À l’aide d’un cure-dent autoclave, prélever trois à cinq fragments d’hyphes sur les marges du mycélium et inoculer le long du tube contenant vermiculite + milieu de culture liquide. N’oubliez pas d’identifier les cryotubes avec le code d’isolat correspondant.
      REMARQUE : L’inoculation d’hyphes en différents points et profondeurs du cryotube garantit que l’isolat colonise la vermiculite en moins de temps.
   4. Stockez les cryotubes dans l’obscurité à 25-27 °C jusqu’à ce que la colonisation de la plupart des grains de vermiculite puisse être observée, ce qui prend généralement environ 14 jours.
   5. Préparez une solution cryoprotectrice composée de 5 % de glycérol et de 5 % de tréhalose dans de l’eau distillée et autoclavez-la. Laissez refroidir la solution avant de l’utiliser.
   6. Une fois que la vermiculite dans les cryotubes est colonisée par l’isolat fongique respectif, répartissez 0,4 mL de cryoprotecteur dans chaque tube et conservez les cryotubes au réfrigérateur à 4 °C pendant 48 h. Ensuite, maintenez les cryotubes à -80 °C aussi longtemps que nécessaire, en respectant les limites de temps de la méthode.

4. Caractérisation macromorphologique des champignons filamenteux (morphologie des colonies)

1. Maintenir un registre photographique du mycélium cultivé dans chaque boîte de Pétri avec 39 g/L de PDA pendant 7 à 14 jours. N’oubliez pas d’enregistrer les deux côtés de la colonie, le dessus et le dessous (à l’envers). Si la vaisselle doit être facilement utilisée dans la section 6 ou si elle n’est pas entretenue, ouvrez la vaisselle lorsque vous les photographiez pour obtenir de meilleures photos.
2. Si vous êtes intéressé par des données quantitatives sur la morphologie des colonies, la sous-culture réplique les isolats et les maintient dans les mêmes conditions de croissance et pendant une période constante pour enregistrer le diamètre de la colonie et calculer le taux de croissance (généralement en mm/h).
   NOTE : Des résultats quantitatifs plus sophistiqués peuvent être obtenus en utilisant différents types de milieux de culture à des fins de comparaison¹⁹ et en considérant les outils statistiques pour traiter les données.
3. Observez également les colonies au stéréomicroscope pour identifier les caractéristiques morphologiques et photographiez-les à la loupe. Évaluer les colonies en fonction de leurs caractéristiques macromorphologiques, telles que détaillées dans la section des résultats. Consulter diverses sources bibliographiques pour aider à catégoriser et à relier la macromorphologie à l’identification moléculaire et/ou morphologique.

5. Caractérisation micromorphologique des champignons filamenteux (morphologie des hyphes)

NOTE : Les techniques micromorphologiques sont comparées dans la section de discussion, en tenant compte de leurs utilisations possibles et de leurs inconvénients.

1. Cultivez les isolats sur des boîtes de Pétri avec 39 g/L de PDA pendant 7 à 14 jours. Pour évaluer les champignons mycorhiziens putatifs des orchidées, cultiver les isolats sur de la gélose à la semoule de maïs à 17 g/L (CMA ; ou un autre milieu limitant les nutriments) pendant 3 à 7 jours¹⁹.
2. Monture de taquinerie
   1. Travaillez à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Placez une goutte d’une teinture choisie (étape 5.5) sur une lame de verre propre.
   2. À l’aide d’un cure-dent autoclavé ou d’un autre matériau stérile, retirez soigneusement certains hyphes de l’isolat cultivé et placez-les dans la goutte de tache. Placez une lamelle (de préférence à un angle initial de 45° pour éviter les bulles d’air) et analysez-la au microscope optique.
3. Support de ruban adhésif
   REMARQUE : Cette technique est généralement appliquée dans les cultures fongiques pour être facilement utilisée dans la section 6 ou non entretenue, car le ruban adhésif ne peut pas être autoclavé et des contaminations peuvent se produire après l’exécution de la méthode.
   1. Placez une goutte d’une teinture choisie (étape 5.5) sur une lame de verre propre. Découpez une bande de ruban adhésif transparent d’une taille qui s’adapte bien à la lame de verre et à la goutte de tache centrale.
   2. Dirigez la surface collante de la bande vers la surface du mycélium. N’appuyez pas et essayez de recueillir quelques hyphes sans en coller trop.
   3. Collez le ruban adhésif sur la lame de verre, en vous assurant que la tache est en contact avec les hyphes collectés. Placez une goutte d’eau au-dessus du ruban adhésif et placez une lamelle. Analysez la lame au microscope optique.
4. Culture de lames de champignons filamenteux²⁰
   1. À l’intérieur d’une grande boîte de Pétri (>9 cm de diamètre, de préférence), placez : du papier filtre dans la partie inférieure, une tige de verre en U ou une adaptation (le but est de fournir une élévation pour la lame de verre), une lame de verre et deux lamelles. Des boîtes de Pétri plus hautes facilitent la manipulation. Autoclaver ces kits de boîtes de Pétri, un pour chaque isolat.
   2. Préparez un petit volume de 39 g/L de PDA ou 17 g/L de CMA, ajoutez 10 g/L de gélose bactériologique et autocchez (le volume d’une boîte de Pétri est suffisant pour plus de 30 isolats). Les milieux de culture utilisés dans la culture des lames doivent être plus durs que les milieux habituels. Autoclaver 100 mL d’eau distillée.
   3. Travaillez à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Placez le milieu liquide dans une boîte de Pétri, en produisant une couche d’environ 0,5 cm de haut. Laissez le milieu se solidifier. Une fois solide, utilisez un scalpel stérile pour couper des carrés du milieu de 1 cm x 1 cm.
   4. Ouvrez la trousse de boîte de Pétri à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire et utilisez une pince flammée pour organiser le matériau autoclavé à l’intérieur de la boîte. Disposez le matériel dans l’ordre numéroté, comme indiqué à la figure 2A, en plaçant un carré de milieu de culture sur la lame de verre. Avant de placer la lamelle sur le support, passez à l’étape 5.4.5.
   5. Utilisez un cure-dent autoclavé pour récupérer quelques hyphes d’un isolat et frottez soigneusement les quatre faces latérales du milieu placé sur la lame de verre. Placez une lamelle autoclavée sur le carré moyen à l’aide d’une pince flammée.
   6. Utilisez une pointe de pipette stérile pour placer de l’eau autoclavée dans le papier filtre, afin de créer une chambre humide. Utilisez un volume pour saturer le papier sans mettre d’eau en excès. Scellez la boîte de Pétri avec un film alimentaire et identifiez-la avec le code d’isolat correspondant. Conservez la vaisselle dans l’obscurité à 25-27 °C pendant 3 à 7 jours.
   7. Évaluez la croissance des hyphes dans la lame de verre et la lamelle. Deux lames sont produites à partir de chaque kit de culture de lames, l’une utilisant la lame de verre avec hyphes et la lamelle autoclave, la seconde utilisant la lamelle avec hyphes et une autre lame de verre.
   8. Une fois la croissance des hyphes observée, détachez soigneusement le carré de milieu de la lame de verre (Figure 2B), montez les deux lames à l’aide d’une coloration choisie (étape 5.5) et analysez au microscope optique. N’oubliez pas d’identifier le code d’isolement sur la lame. Pour produire des lames semi-permanentes, scellez la lamelle avec du vernis à ongles transparent.
   9. Pour produire des lames permanentes, lavez soigneusement le colorant des hyphes collés après la coloration et laissez sécher la lame. Montage à l’aide d’un support de montage rapide (pour plus de détails, lire Pena-Passos et ^al.10).
      REMARQUE : L’inconvénient de la production d’une lame permanente avec cette technique est que les spores et les structures qui n’adhèrent pas au verre peuvent être lavées.
5. Méthodes de coloration et observation des hyphes
   1. Lactophénol bleu de coton (LPCB)21 : Ajouter 20 mL d’acide lactique, 40 mL de glycérol et ²⁰ mL d’eau distillée. Dissoudre 20 g de cristaux de phénol dans cette solution en chauffant doucement. Dissoudre 0,05 g de bleu de méthyle (bleu de coton, ou 2 mL de solution aqueuse à 1 %). Le LPCB peut également être facilement acheté déjà préparé.
      ATTENTION : Le phénol est hautement toxique et volatil ; Manipulez-le exclusivement à l’intérieur d’une hotte et portez des gants.
   2. Bleu de toluidine O¹⁰ (TBO) : Préparer 0,05 % de TBO dans un tampon phosphate de 0,1 M (pH 6,8).
   3. Rouge Congo^22,23,24 : Préparez une solution de rouge Congo à 1% dans de l’eau distillée et filtrez-la. Incuber pendant 5 à 10 min. Ce colorant peut également être appliqué pour la microscopie à fluorescence²⁵.
   4. Lorsque vous observez et photographiez des hyphes fongiques au microscope optique, consultez diverses sources bibliographiques pour vous aider à identifier les structures (consultez la discussion).

Figure 2 : Procédures de culture de lames de champignons filamenteux. (A) Configuration schématique d’un kit de culture de lames, où les numéros indiquent l’ordre de disposition des éléments. (B) Le détachement du carré du milieu de culture après la croissance des hyphes est observé dans la lame de verre et la lamelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Extraction totale d’ADN à partir d’isolats fongiques (protocole maison²⁶ avec modifications ²⁷)

REMARQUE : Tous les matériaux, solutions et réactifs utilisés dans cette section doivent être stériles. Ceux qui ne peuvent pas être achetés déjà stérilisés doivent être autoclavés à 121 °C pendant 20 min. Portez des gants pendant tout le protocole et effectuez quelques étapes à l’intérieur d’une hotte.

1. Préparez le tampon d’extraction : 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 250 mM de NaCl, 200 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et 25 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Cultivez les isolats purifiés dans 39 g/L de PDA pendant 7 à 14 jours.
2. Grattez soigneusement le mycélium d’un isolat à l’aide d’une spatule ou d’une cuillère et transférez les fragments dans un mortier autoclave, en évitant de transférer le milieu de culture avec l’agrégat d’hyphes. À l’aide d’un pilon en porcelaine, broyez le mycélium avec de l’azote liquide jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. Ne laissez pas le mycélium moulu fondre, ajoutez de l’azote pour éviter cela.
3. Ajouter 1 mL de tampon d’extraction dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et placer l’échantillon moulu jusqu’à la marque de 1,5 mL. Agitez doucement le contenu des tubes pour l’homogénéiser.
4. Agitez les tubes en tourbillon pendant 5 s et placez-les dans un thermobloc à 65 °C pendant 20 min. Homogénéisez soigneusement le contenu par inversion toutes les 7 à 10 minutes.
5. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez 800 μL de la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 mL, ajoutez 800 μL de phénol dans les tubes et mélangez le contenu par inversion.
   ATTENTION : Le phénol est un réactif hautement toxique et volatil ; Il peut provoquer un érythème, une gangrène et une nécrose des tissus. Lorsqu’il est inhalé, il peut provoquer une dyspnée et une toux. L’absorption systémique peut endommager le foie, les reins et le système nerveux central. Manipulez le phénol exclusivement à l’intérieur d’une hotte et portez des gants.
   REMARQUE : À partir de l’étape suivante, utilisez des gants et effectuez le protocole à l’intérieur d’une hotte.
6. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C et transférer 800 μL de la phase supérieure vers un nouveau tube de 2 mL, en évitant soigneusement le transfert du contenu de la phase inférieure.
7. Ajouter 400 μL de phénol et 400 μL de chloroforme dans les tubes et mélanger le contenu par inversion. Centrifugez-les à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   ATTENTION : Le chloroforme est un réactif hautement toxique et volatil ; Il peut provoquer des irritations et des blessures au contact de la peau et, s’il est inhalé, affecte les systèmes nerveux central et cardiorespiratoire, le foie et les reins. Manipulez le chloroforme exclusivement à l’intérieur d’une hotte et portez des gants.
8. Récupérez 800 μL ou moins de la phase supérieure dans un nouveau tube de 2 mL. Ajouter 800 μL de chloroforme, mélanger le contenu par inversion et centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE : Dans cette étape, aucun résidu de la phase inférieure ne doit être transféré dans de nouveaux tubes. Ainsi, soyez très prudent lors de la récupération de la phase supérieure.
9. Transférez 600 à 800 μL de la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajoutez 450 μL d’isopropanol. Mélanger le contenu par inversion et incuber à 25 °C pendant 5 min.
10. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette. Attention à ne pas jeter la pastille déposée au fond du tube.
11. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % et centrifuger pendant 5 min. Répétez deux fois au cas où la pastille ne serait pas clarifiée.
12. Retirez l’éthanol à l’aide d’une micropipette et séchez le granulé à 37 °C pendant 30 à 60 min. Ajouter 30 à 50 μL d’eau déminéralisée en éluant la pastille à l’aide d’une micropipette.
13. Maintenez les tubes à 4 °C pendant la nuit pour une élution complète de l’ADN et congelez le contenu à -20 °C.

7. Extraction totale d’ADN à partir d’organes végétaux pour la méthodologie de métabarcoding (kit commercial)

REMARQUE : Pour la méthodologie suivante, il est nécessaire d’acheter le kit commercial indiqué dans le tableau des matériaux en tant que kit d’extraction d’ADN du sol. Tous les matériaux, solutions et réactifs utilisés dans cette section doivent être stériles. Ceux qui ne peuvent pas être achetés déjà stérilisés doivent être autoclavés à 121 °C pendant 20 min. Il est fortement recommandé de porter des gants pendant tout le protocole, et les étapes peuvent être effectuées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Le protocole décrit est modifié à partir de De Souza et ^al.12, à partir du protocole détaillé par le fabricant.

1. À l’aide de pilons et de mortiers en porcelaine, broyer les racines recueillies à l’étape 1.2 dans de l’azote liquide, en réduisant les échantillons en une fine poudre. Ajouter 0,3 g des échantillons moulus dans les tubes PowerBead et agiter doucement pour homogénéiser.
2. Ajouter 60 μL de solution C1 (incluse dans le kit) dans les tubes PowerBead et mélanger le contenu par inversion. À l’aide d’un homogénéisateur de tissus et d’un lyseur cellulaire (Table des matériaux), attachez fermement les tubes à un support adéquat, couplez le support au vortex et démarrez l’équipement à la vitesse maximale pendant 10 à 20 minutes.
   REMARQUE : Dans le cas où la solution C1 est précipitée, chauffez-la à 60 °C jusqu’à dissolution complète.
3. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 30 s à 25 °C. Transférer 500 μL du surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL. Le contenu transféré peut être particulaire.
4. Ajouter 250 μL de solution C2 dans les tubes et agiter en tourbillon pendant 5 s. Incuber à 4 °C pendant 5 min, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 1 à 2 min à 25 °C.
5. Transvaser plus de 600 μL de surnageant dans de nouveaux tubes de 2 mL, en évitant la pastille. Ajouter 200 μL de solution C3 et agiter sur un vortex pendant 5 s.
6. Incuber à 4 °C pendant 5 min puis centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à 25 °C. À ce stade, assurez-vous que le surnageant n’est pas particulaire.
7. Transvaser plus de 750 μL du surnageant dans de nouveaux tubes de 2 mL, en évitant la pastille. Bien homogénéiser la solution C4, ajouter 1 100 μL de solution C4 au surnageant et agiter en tourbillon pendant 5 s.
8. Chargez 675 μL du contenu des tubes dans les colonnes d’essorage MB, sur le filtre, et centrifugez à 10 000 x g pendant 1 min à 25 °C. Jetez le contenu liquide.
9. Répétez l’étape précédente deux fois jusqu’à ce que tout le contenu de chaque tube soit traité. Ensuite, ajouter 500 μL de solution C5 au centre du filtre présent au niveau de la colonne supérieure du tube et centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s à 25 °C.
10. Jetez le contenu liquide et centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions que l’étape précédente. Transférez avec précaution la colonne supérieure de la colonne de centrifugation MB dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 2 mL, en évitant que le contenu liquide de la colonne ne s’égoutte.
11. Ajouter 85 à 100 μL de solution C6 au centre du filtre et attendre 1 min. Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s à 25 °C et jeter la colonne d’essorage MB. Conservez les tubes à -80 °C.

8. Quantification de l’ADN dans un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux)

1. À l’aide du spectrophotomètre indiqué, ouvrez le logiciel. Sélectionnez l’option Acide nucléique, choisissez l’option ADN et définissez la concentration sur ng/μL.
2. Ajoutez 1 μL d’eau déminéralisée au détecteur du spectrophotomètre et étalonnez en sélectionnant l’option Blank. Après la lecture, essuyez délicatement le détecteur avec du papier de soie doux.
3. Nommez l’échantillon de champ avec le code d’isolat de l’échantillon à lire et placez-en 1 μL dans le détecteur de l’équipement. Sélectionnez l’option Mesurer ; Un graphique et un tableau avec les résultats sont générés.
4. Répétez l’étape 8.3 jusqu’à ce que tous les échantillons aient été lus. Il est recommandé d’enregistrer la table avec les résultats générés pour l’enregistrement et l’analyse : sélectionnez l’option Rapports et l’emplacement où le fichier .xml sera enregistré.
5. Ajoutez 5 μL d’eau déminéralisée dans le détecteur, attendez quelques minutes et essuyez-le délicatement avec du papier de soie doux.

Résultats

Dans le protocole d’isolement, étant donné qu’il y a contamination par l’eau utilisée lors du dernier lavage et que la contamination est également détectée dans les boîtes de Pétri avec des fragments inoculés, différentes mesures peuvent être prises, selon le type de contaminant (tableau 1). Cette procédure doit être répétée dès le début en cas de contaminants fongiques très sporulants, qui présentent également une croissance accélérée, et de...

Discussion

La désinfestation superficielle des échantillons de plantes est l’une des étapes les plus critiques du protocole présenté. Il est fortement souhaitable qu’il n’y ait pas de contamination de la vaisselle PDA par des gouttes provenant du dernier lavage. Les bactéries sont fréquemment observées en tant que contaminants dans les boîtes d’isolement, généralement plus que les champignons sporulants en suspension dans l’air, étant donné que les bactéries endophytes sont également...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)