Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

요약

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

Mycoheterotrophic 식물은 가장 극단적 인 형태의 균근 의존성 중 하나를 나타내며 독립 영양 능력을 완전히 잃었습니다. 다른 중요한 자원과 마찬가지로 이 식물과 밀접하게 연관되어 있는 균류는 식물에게 필수적입니다. 따라서 mycoheterotrophic 종을 연구하는 데 가장 관련성이 높은 기술 중 일부는 관련 균류, 특히 뿌리 및 지하 기관에 서식하는 균류를 조사할 수 있는 기술입니다. 이러한 맥락에서, 배양 의존적 및 배양 비의존성 내생균을 식별하기 위한 기술이 일반적으로 적용된다. 곰팡이 내생식물을 분리하는 것은 형태학적으로 식별하고, 다양성을 분석하고, 난초 종자의 공생 발아에 적용하기 위한 접종물을 유지하는 수단을 제공합니다. 그러나 식물 조직에 서식하는 다양한 비배양 균류가 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 배양에 독립적인 분자 식별 기술은 종의 다양성과 풍부도에 대한 더 넓은 범위를 제공합니다. 이 기사는 두 가지 조사 절차, 즉 문화 종속 및 독립 조사 절차를 시작하는 데 필요한 방법론적 지원을 제공하는 것을 목표로 합니다. 배양 의존적 프로토콜과 관련하여, 균종속영양 식물의 지하 및 공중 기관에서 사상균을 분리하고, 분리물을 수집하고, 슬라이드 배양 방법론에 의한 균사를 형태학적으로 특성화하고, 전체 DNA 추출을 통해 균류의 분자 식별과 함께 채취 장소에서 실험실 시설까지 식물 샘플을 수집하고 유지하는 과정이 자세히 설명되어 있습니다. 배양에 독립적인 방법론을 포괄하는 세부 절차에는 메타게놈 분석을 위한 식물 샘플 수집과 상용 키트를 사용하여 아클로로필 식물 장기에서 전체 DNA 추출이 포함됩니다. 마지막으로, 연속성 프로토콜(예: 중합효소연쇄반응[PCR], 염기서열분석)도 분석을 위해 제안되며, 여기에 기술이 제시됩니다.

서문

내생균(endophytic fungi)은 식물 장기와 조직의 내부에 눈에 띄지 않는 감염(즉, 숙주에게 해를 끼치지 않고)에 서식하는 균류입니다.^1,2. 이러한 균류는 숙주 식물과 중성 또는 유익하게 상호 작용할 수 있고, 병원균 및 불리한 환경 조건에 대한 저항성을 부여할 수 있으며, 식물에 유익한 화합물(예: 성장 인자 및 기타 식물 ^{호르몬)의} 합성에 기여할 수 있습니다^1,3. 균근 내생식물(Mycorrhizal endophytes)은 식물과 균근 결합을 이루는 균류로, 영양소 전달에 참여한다⁴. Orchidaceae에서 균근 내생식물과의 상호 작용은 대다수의 종에서 종자 발아와 가족의 모든 식물에서 묘목 설립에 기본입니다⁵. 이러한 맥락에서, 진균 종속영양 난초는 전체 생애 주기 동안 이러한 균류에 의한 미네랄 영양소와 탄소 화합물 전달에 의존하기 때문에 균근 파트너에 대한 완전한 의존의 경우를 나타낸다⁶. 따라서 연관 균류의 분리 및 식별은 mycoh....

프로토콜

1. 식물 시료 채취

1. culture-dependent method에 대한 샘플 수집
   1. 지하 기관을 조심스럽게 파십시오. 이들은 수집할 식물의 뿌리, 줄기, 뿌리줄기 또는 저장 기관일 수 있습니다. 매우 조밀한 토양 외에도 이러한 샘플을 손으로 수집하십시오.
      알림: 이 단계에서 흙손이나 스쿱과 같은 도구를 사용하는 것은 진균종속영양 식물의 취약한 구조를 손상시킬 수 있고 비내생균에 의한 조직 오염을 유발할 수 있으므로 권장되지 않습니다.
   2. 가능한 한 많은 지하 장기를 수집하십시오. 샘플을 냉각된 용기(예: 폴리스티렌 폼 상자 또는 얼음이 든 보온 백) 안에 종이 봉지에 보관합니다. 공중 기관도 수집되는 경우 지하 기관과 별도로 운송하십시오.
2. culture-independent method에 대한 샘플 수집
   1. 1.1.1 단계의 NOTE에 지적된 것과 동일한 권장 사항에 따라 수집할 식물의 뿌리를 조심스럽게 파십시오.
   2. 가능한 한 많은 지하 장기를 수집하십시오. 수집된 시료를 액체 질소 내부의 극저온 튜브에 보관하거나(바람직한 옵션) 드라이아이스로 둘러싸인 원심분리기 튜브를 사용하십시오(대체 옵션). 공중 장기를 수집하는 경우 별도로 유지 관리하십시....

결과

격리 프로토콜에서 마지막 세척에 사용된 물로 인한 오염이 있고 접종된 파편이 있는 페트리 접시에서도 오염이 검출되는 것을 고려하면 오염 물질의 유형에 따라 다른 조치를 취할 수 있습니다(표 1). 이 절차는 포자가 많은 곰팡이 오염 물질의 경우 처음부터 반복해야 하며, 이는 또한 성장을 가속화하고 선택한 항생제에 내성이 있는 강렬한 증식 박테리아?.......

토론

식물 샘플의 표면적 소독은 제시된 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. PDA 접시에 마지막 세척 물방울이 있는 오염이 없는 것은 매우 바람직합니다. 박테리아는 격리 접시에서 오염 물질로 자주 관찰되며, 일반적으로 공기 중 포자 균류보다 더 많으며, 내생균은 식물 조직 내에서도 흔하다는 점을 고려하면 ^3,11. 따라서 장기 절편을 설치할 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)