Выделение, характеристика и выделение общей ДНК для идентификации эндофитных грибов в микогетеротрофных растениях

Резюме

Целью настоящей статьи является предоставление подробных и адекватных протоколов выделения растительно-ассоциированных эндофитных грибов, долговременной консервации изолятов, морфологической характеристики и экстракции общей ДНК для последующей молекулярной идентификации и метагеномного анализа.

Аннотация

Микогетеротрофные растения представляют собой одну из самых крайних форм микоризной зависимости, полностью утратив свою автотрофную способность. Так же важны, как и любой другой жизненно важный ресурс, грибы, с которыми эти растения тесно связаны, необходимы для них. Таким образом, некоторые из наиболее актуальных методов в изучении микогетеротрофных видов позволяют исследовать ассоциированные грибы, особенно те, которые обитают в корнях и подземных органах. В этом контексте обычно применяются методы идентификации культурально-зависимых и культурально-независимых эндофитных грибов. Изоляция эндофитов грибов обеспечивает средства для их морфологической идентификации, анализа их разнообразия и сохранения инокулатуры для применения в симбиотическом проращивании семян орхидей. Однако известно, что существует большое разнообразие некультивируемых грибов, населяющих ткани растений. Таким образом, методы молекулярной идентификации, не зависящие от культуры, обеспечивают более широкий охват видового разнообразия и численности. Целью данной статьи является методологическое сопровождение, необходимое для запуска двух процедур исследования: культурно-зависимой и независимой. Что касается культурально-зависимого протокола, то подробно описаны процессы сбора и хранения образцов растений от мест сбора до лабораторных помещений, а также выделение нитчатых грибов из подземных и надземных органов микогетеротрофных растений, ведение коллекции изолятов, морфологически охарактеризовать гифы методом культивирования на предметных стеклах и молекулярная идентификация грибов методом тотальной экстракции ДНК. Детальные процедуры, включающие в себя независимые от культуры методики, включают сбор образцов растений для метагеномного анализа и извлечение общей ДНК из органов ахлорофилловых растений с использованием коммерческого набора. Наконец, протоколы непрерывности (например, полимеразная цепная реакция [ПЦР], секвенирование) также предлагаются для анализа, и здесь представлены методы.

Введение

Эндофитные грибы – это, по определению, те, которые обитают внутри органов и тканей растений при незаметных инфекциях (т.е. не причиняя вреда своему хозяину)^1,2. Эти грибы могут нейтрально или благотворно взаимодействовать с растениями-хозяевами, могут обеспечивать устойчивость к патогенам и неблагоприятным условиям окружающей среды, а также могут способствовать синтезу полезных для растения соединений (например, факторов роста и других фитогормонов)^1,3. Микоризные эндофиты – это грибы, которые устанавливают микоризные ассоциации с растением, принимая участие в переносе питательных веществ⁴. У Orchidaceae взаимодействие с микоризными эндофитами имеет основополагающее значение для прорастания семян у подавляющего большинства видов и укоренения проростков у всех растений семейства⁵. В таких условиях микогетеротрофные орхидеи представляют собой случай полной зависимости от своих микоризных партнеров, поскольку они зависят от переноса минеральных питательных веществ и углеродных соединений этими грибами в течение всего своего^{жизненного цикла}. Поэтому выделение и идентификация ассоциативных грибов является фундаментальной базой при исследовании микогетеротрофных жизненных стратегий. Более того, мало что известно о роли грибных эндофитов в микогетеротрофных растениях или даже о реальном разнообразии этих грибов ^7,8.

Исследование эндофитных грибов может проводиться с помощью различных методов, традиционно описываемых как независимые от культуры или зависимые, например: (а) прямое наблюдение, (б) выделение грибов и морфологическая и/или молекулярная идентификация, и (в) полная экстракция ДНК растительных тканей и молекулярная идентификация9. При непосредственном наблюдении (а) эндофитные грибы могут быть исследованы еще в недрах растительных клеток и тканей с помощью световой или электронной микроскопии⁹, поскольку различные протоколы микроскопии подробно описаны Pena-Passos et ^al.10. С помощью методов выделения (b) эндофиты грибов могут быть охарактеризованы в соответствии с их колониями, гифами и морфологией репродуктивной структуры или структуры резистентности. Кроме того, с помощью методов выделения можно проводить молекулярную идентификацию изолятов путем экстракции ДНК, амплификации молекулярных идентификационных последовательностей (штрих-кодов или отпечатков пальцев) и секвенирования¹¹. Последний метод (c) позволяет проводить молекулярную идентификацию эндофитных грибов с помощью экстракции ДНК во внутренней части растительных тканей (метабаркодирование) с последующей подготовкой библиотеки и секвенированием¹².

Кроме того, грибные изоляты могут быть применены в симбиотических испытаниях проращивания с использованием семян автотрофных или микогетеротрофных орхидей. Примером такого применения является исследование, проведенное Sisti et ^al.13, описывающее прорастание и начальные стадии развития протокорма у микогетеротрофной орхидеи Pogoniopsis schenckii в ассоциации с некоторыми из ее изолятов, включающих немикоризные эндофитные грибы. Применяемый протокол проращивания симбиоза подробно описан и представлен в видео Pena-Passos et ^al.10. Выделение грибов в ассоциации с различными органами растений позволяет по-разному исследовать природу взаимодействия растений и грибов (например, понять экологические или физиологические аспекты ассоциации, а также исследовать перенос питательных веществ от грибов к растению)⁹.

Методики, представленные в разделе 1, основаны на сборе образцов подземных органов, поскольку эти органы представляют наибольшие трудности при сборе и представляют большой интерес, поскольку их колонизируют микоризные эндофиты. Тем не менее, оба включенных протокола (шаги 1.1 и 1.2) могут быть применены к другим микогетеротрофным органам растений (например, корневищам, цветочным стеблям и плодам). Методика сбора, описанная на шаге 1.1, предназначена для выделения эндофитных грибов (раздел 2) для морфологической характеристики (разделы 4 и 5) и/или выделения общей ДНК для идентификации изолятов (раздел 6). С другой стороны, методология сбора, описанная в шаге 1.2, предназначена исключительно для тотальной экстракции ДНК растительных тканей для методов метабаркодирования (раздел 7). В разделе 3 представлены четыре способа хранения и консервации нитчатых грибов: два для кратковременного хранения (3-6 месяцев) и два других для длительного хранения (>1 год). Морфологическая характеристика (разделы 4 и 5) может быть связана с молекулярной идентификацией для ее усиления и получения важной информации о макро- и микроморфологии грибов. На рисунке 1 обобщены коллективные методологии, описанные ниже.

Рисунок 1: Схематическое обобщение представленных методов. Сбор растений и выделение, консервация и молекулярная идентификация растений с помощью культурно-зависимых и независимых методологий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

1. Отбор проб растений

1. Отбор проб для методов, зависящих от языка и региональных параметров
   1. Осторожно выкопайте подземные органы; Это могут быть корни, стебли, корневища или органы хранения растения, подлежащего сбору. Помимо очень плотных почв, эти пробы собирают вручную.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование таких инструментов, как мастерки или совки, на этом этапе не рекомендуется, так как это может повредить хрупкие структуры микогетеротрофных растений и вызвать загрязнение тканей неэндофитными грибами.
   2. Соберите как можно больше подземных органов. Храните образцы в бумажных пакетах внутри охлаждаемого контейнера (например, коробки из пенополистирола или термосумки со льдом). Если собираются и воздушные органы, транспортируйте их отдельно от подземных.
2. Отбор образцов для методов, не зависящих от языка и региональных параметров
   1. Осторожно выкопайте корни растения, подлежащего сбору, в соответствии с теми же рекомендациями, указанными в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 1.1.1.
   2. Соберите как можно больше подземных органов. Храните собранные образцы в криопробирках внутри жидкого азота (предпочтительный вариант) или используйте центрифужные пробирки, окруженные сухим льдом (альтернативный вариант). Поддерживайте воздушные органы отдельно, если они собраны.

2. Выделение эндофитных грибов, ассоциированных с органами растений¹⁴

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый материал, раствор и реагент, используемые в этом разделе, должны быть стерильными. Те, которые не могут быть куплены уже стерилизованными, должны быть автоклавированы при 121 °C в течение 20 минут.

1. Поверхностное дезинсекция органов растений
   1. Промойте собранные образцы (шаг 1.1.2) в проточной воде и удалите как можно больше субстрата и другого мусора, который может быть в образцах.
   2. Внутри ламинарного колпака выдержите промытые образцы, погруженные в 70% этанол в течение 1 минуты (можно использовать стакан или стеклянную банку).
   3. Переложите образцы в другую емкость с гипохлоритом натрия с 2% активным хлором на 3 мин.
   4. Переложите образцы в контейнер с 70% этанолом и держите погруженным в воду в течение 1 минуты. После этого образцы последовательно промывают в двух емкостях с дистиллированной водой.
2. Установка фрагментов растений в питательную среду
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый шаг, описанный в шаге 2.2, должен выполняться внутри ламинарного колпака.
   1. Перед установкой подготовьте чашки Петри (8-10 см в диаметре) с питательной средой картофельного декстрозы (КПК) 19,5 г/л + 7 г/л бактериологического агара + 3 мл/л антибиотиков (например, стрептомицина, пенициллина, тетрациклина, ампициллина).
   2. Перед использованием выдержите чашки Петри с питательной средой при температуре 36 °C в течение 24 ч, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения. Выбросьте посуду, зараженную колониями бактерий или грибков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков в среду имеет важное значение на этом этапе, так как органы сильно инфицированы бактериями, которые могут подавлять рост грибков. Проверьте, можно ли нагревать антибиотики во время автоклавирования; некоторые антибиотики необходимо добавлять после охлаждения среды примерно до 36 °C (перед тем, как поместить ее в посуду).
   3. Сразу после поверхностной дезинсекции образцов и все еще внутри ламинарного колпака, в КПК, засейте несколько капель дистиллированной воды из последней емкости, используемой для промывки образцов. Этот этап важен для оценки эффективности поверхностной дезинсекции образцов.
   4. Поместите образцы в пустую автоклавную посуду и с помощью опламененного скальпеля и щипцов разрежьте образцы до толщины около 0,2 см.
   5. Разрез цилиндрических образцов продольно на две половины, при желании усиливают поверхность, контактирующую со средой. Чтобы лучше обнажить плоды и другие более шаровидные органы, тщательно измельчите или нарежьте структуры. Семена также могут быть важными источниками грибков, поэтому убедитесь, что разрезанные плоды подвергают их воздействию среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только здоровые органы, без повреждений тканей или сигналов о возможных заболеваниях или патогенных инфекциях, должны использоваться для выделения эндофитов грибов.
   6. Распределите пять фрагментов подземных органов в чашках Петри с КПК + антибиотик. Убедитесь, что фрагменты находятся как можно дальше друг от друга, а также не касаются краев блюда. Не массивируйте какие-либо фрагменты на носителе. Подготовьте копии каждого установленного органа в качестве меры предосторожности на случай загрязнения.
   7. Запечатайте чашки Петри пищевой пленкой и храните их в темноте при температуре 25-27 °C (лучше в инкубаторе) в течение 5 дней.
3. Исчисление частоты изоляции (ПЧ)¹¹
   1. Через 5 дней инкубации фрагментов органов рассчитайте IF, в соответствии с количеством инкубационных фрагментов, в которых растут колонии грибов, разделенным на общее количество инкубированных фрагментов, как представлено в следующем уравнении:
      
4. Очистка грибковых изолятов путем бороздчатости и субкультивирования
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый шаг, описанный в шаге 2.4, должен выполняться внутри ламинарного колпака.
   1. Приготовьте чашки Петри (5 см в диаметре) с 5-7 г/л агар-агара (АА; только бактериологический агар). Выдерживайте посуду в течение 24 часов при температуре 36 °C, чтобы исключить возможные загрязнения.
   2. Определите каждую выращенную грибковую колонию кодом и разграничите ее края на нижней стороне чашки (можно сделать перманентным маркером). Дифференциация колоний по цвету, характеру роста, текстуре и формату полей.
   3. С помощью автоклавной деревянной зубочистки, используя тонкий наконечник, восстановите небольшое количество мицелия из колонии грибов. Желательно сконцентрироваться на границах колонии и выбрать область как можно дальше от другой колонии, избегая одновременного восстановления более чем одного типа колонии.
   4. Используя ту же зубочистку с мицелием на кончике, расчешите АА, образуя три стрии (бороздки). Следите за тем, чтобы каждая полоска находилась на расстоянии 1 см от другой и краев посуды. Напишите соответствующий код (используя бумагу для стикеров и карандаш), запечатайте посуду и выдержите ее в инкубации в темноте при температуре 25-27 °C в течение 3 дней.
   5. Приготовьте чашки Петри (диаметром 8 см) с 39 г/л КПК. Добавлять антибиотики на этом этапе не нужно.
   6. После инкубации чашек с АА внимательно наблюдайте за ними на фоне света (от лампы или окна), стремясь выявить тонкие гифы, образующие отдельные колонии. Разграничьте площадь отдельной колонии в чашке, используя перманентный маркер на нижней стороне чашки Петри.
   7. В ламинарном вытяжном шкафу используйте автоклавную зубочистку, чтобы отрезать часть среды, содержащей колонию, и переместить срезанный объем в центр новой чашки с КПК.
   8. Определите чашки Петри с кодами изолятов, запечатайте чашки пищевой пленкой и выдержите в темноте при температуре 25-27 °C в течение 7-14 дней.

3. Консервация очищенных грибковых изолятов

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый материал, раствор и реагент, используемые в этом разделе, должны быть стерильными. Те, которые не могут быть куплены уже стерилизованными, должны быть автоклавированы при 121 °C в течение 20 минут.

1. Консервирование по методу Кастеллани или в минеральном масле (3-6 месяцев)^11,15
   1. Приготовьте пробирки для микроцентрифуг объемом 2 мл с 0,5 мл дистиллированной воды или содержащие 0,5 мл минерального масла (в зависимости от выбранного метода). Убедитесь, что пробирки автоклавированы пустыми, а автоклавная вода и масло добавляются в трубки внутри ламинарного колпака.
   2. В ламинарный колпак поместите чашки Петри с очищенными изолятами, уже выращенными в КПК (39 г/л) на 7-14 дней. Используя автоклавную зубочистку, вырежьте небольшие кубоиды (0,5 см х 0,5 см в верхней области) из среды, содержащей края мицелия.
   3. Поместите от четырех до шести кубоидов в пробирки микроцентрифуги с дистиллированной водой (метод Кастеллани) или минеральным маслом. Храните пробирки в темноте при температуре 25 °C столько, сколько необходимо, соблюдая временные ограничения метода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте слишком много кубоидов в пробирки и не делайте их заполненными, так как это может увеличить вероятность загрязнения. Пробирки можно хранить в холодильнике, что может способствовать более длительному хранению некоторых изолятов. Currah et ^al.16 рекомендуют хранить реплики изолятов микоризных грибов из тропических орхидей как в холодильнике, так и при температуре 25 °C, так как они могут быть потеряны при хранении в холодильнике.
   4. Восстановите кубоид и поместите его в центр новой чашки с КПК, чтобы вырастить хранимый изолят.
2. Криоконсервация в неочищенных рисовых зернах (>1 год)¹⁷
   1. Неочищенные рисовые зерна промыть в проточной воде и варить до тех пор, пока рисовая шелуха не начнет открываться. Приготовленные зерна распределить по стеклянным пробиркам с завинчивающейся крышкой и автоклавировать дважды с интервалом 24 ч между ними.
   2. В ламинарный колпак поместите чашки Петри с очищенными изолятами, уже выращенными в КПК (39 г/л) на 7-14 дней. Используя автоклавную зубочистку, восстановите пять небольших фрагментов гиф с краев мицелия и поместите их в пробирку, содержащую автоклавные зерна риса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Посев гиф в разных точках и на разной глубине трубки гарантирует, что изолят колонизирует неочищенные рисовые зерна за меньшее время.
   3. Инкубируют пробирки в темноте при температуре 25-27 °C в течение 14 дней. Перемешивайте трубки, вихревая их каждые 3 дня, чтобы зерна оставались индивидуальными.
   4. Наблюдая за ростом грибков в рисовых зернах, распределите зерна в автоклавной чашке Петри, выстланной фильтровальной бумагой для впитывания влаги, поверх бумаги, чтобы зерна могли высохнуть. Хранить в темноте при температуре 25-27 °C в течение 2-3 дней.
   5. Подготовьте криопробирки с 1/3 силикагеля внизу и 1/3 стекловаты над кремнеземом. Наконец, распределите 1/3 рисовых зерен с выращенным грибным мицелием. Хранить при температуре -20 °C в течение 24 часов.
   6. Через 24 ч храните криопробирки при температуре -80 °C столько, сколько необходимо, соблюдая временные ограничения метода.
3. Криоконсервация в вермикулите с использованием криопротектора (>1 год)¹⁸
   1. Готовят жидкую питательную среду, состоящую из 0,2% дрожжевого экстракта и 2% глюкозы в дистиллированной воде. Отрегулируйте pH до 5 и автоклавируйте его.
   2. Распределите 0,2 г вермикулита (используйте мелкую гранулометрию) в криопробирки с завинчивающейся крышкой и автоклавируйте их. В криопробирки, содержащие вермикулит, добавить 0,8 мл автоклавной жидкой среды.
   3. В ламинарный колпак поместите чашки Петри с очищенными изолятами, уже выращенными в КПК (39 г/л) на 7-14 дней. Используя автоклавную зубочистку, рекуперируют от трех до пяти фрагментов гиф с краев мицелия и высевают по пробирке, содержащую вермикулит + жидкая питательная среда. Не забудьте идентифицировать криопробирки с соответствующим кодом изолята.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инокуляция гиф в разных точках и глубинах криопробирки гарантирует, что изолят колонизирует вермикулит за меньшее время.
   4. Храните криопробирки в темноте при температуре 25-27 °C до тех пор, пока не будет наблюдаться колонизация большей части зерен вермикулита, что обычно занимает около 14 дней.
   5. Приготовьте раствор криопротектора, состоящий из 5% глицерина и 5% трегалозы, в дистиллированной воде и автоклавируйте его. Дайте раствору остыть перед использованием.
   6. После того, как вермикулит в криопробирках будет колонизирован соответствующим грибковым изолятом, распределите 0,4 мл криопротектора в каждой пробирке и храните криопробирки в холодильнике при температуре 4 °C в течение 48 часов. После этого поддерживайте криопробирки при температуре -80 °C столько, сколько необходимо, соблюдая временные ограничения метода.

4. Макроморфологическая характеристика нитчатых грибов (морфология колоний)

1. Вести фотографический регистр мицелия, выращенного в каждой чашке Петри, с 39 г/л КПК в течение 7-14 дней. Не забудьте зарегистрировать обе стороны колонии, верхнюю и нижнюю (обратную). Если посуда будет легко использоваться в разделе 6 или за ней не ухаживать, откройте посуду при ее фотографировании, чтобы получить более качественные фотографии.
2. Если вас интересуют количественные данные о морфологии колоний, субкультура реплицирует изоляты и поддерживает их в тех же условиях произрастания и в течение постоянного периода времени, чтобы зарегистрировать диаметр колонии и рассчитать скорость роста (обычно в мм/ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более сложные количественные результаты могут быть достигнуты путем использования различных типов питательных сред для сравнения¹⁹ и рассмотрения статистических инструментов для обработки данных.
3. Понаблюдайте за колониями под стереомикроскопом, чтобы определить морфологические характеристики и сфотографировать в увеличении. Оцените колонии в соответствии с их макроморфологическими характеристиками, как подробно описано в разделе результатов. Обратитесь к различным библиографическим источникам, чтобы помочь классифицировать и связать макроморфологию с молекулярной и/или морфологической идентификацией.

5. Микроморфологическая характеристика нитчатых грибов (гифальная морфология)

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроморфологические методы сравниваются в разделе обсуждения, учитывая их возможное использование и недостатки.

1. Выращивайте изоляты на чашках Петри с 39 г/л КПК в течение 7-14 дней. Для оценки предполагаемых микоризных грибов орхидей выращивают изоляты на агаре кукурузной муки 17 г/л (КМА; или другой питательно-лимитирующей среде) в течение 3-7 дней¹⁹.
2. Дразнящее крепление
   1. Работа внутри ламинарного колпака. Капните каплю выбранного пятна (шаг 5.5) на чистое предметное стекло.
   2. Используя автоклавную зубочистку или другой стерильный материал, аккуратно удалите несколько гиф из выращенного изолята и поместите их в каплю пятна. Поместите покровное стекло (желательно под начальным углом 45°, чтобы избежать пузырьков воздуха) и проанализируйте под световым микроскопом.
3. Крепление на клейкую ленту
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод обычно применяется в грибных культурах, которые легко используются в разделе 6 или не поддерживаются, так как клейкая лента не может быть автоклавирована, и после выполнения метода может произойти загрязнение.
   1. Капните каплю выбранного пятна (шаг 5.5) на чистое предметное стекло. Отрежьте полоску прозрачной клейкой ленты по размеру, который подходит к предметному стеклу и центральному пятну хорошо капли.
   2. Направьте липкую поверхность полоски на поверхность мицелия. Не давите и постарайтесь собрать несколько гиф, не приклеивая их слишком много.
   3. Приклейте ленту к предметному стеклу, убедившись, что пятно находится в контакте с собранными гифами. Поместите каплю воды над лентой и положите покровный листок. Проанализируйте предметное стекло под световым микроскопом.
4. Слайд-культура нитчатых грибов²⁰
   1. Внутри большой чашки Петри (предпочтительно >9 см в диаметре) поместите: фильтровальную бумагу в нижней части, U-образный стеклянный стержень или приспособление (цель состоит в том, чтобы обеспечить возвышение предметного стекла), одно предметное стекло и два покровных стекла. Более высокие чашки Петри облегчают манипуляции. Автоклавируйте эти наборы чашек Петри, по одному на каждый изолят.
   2. Готовят небольшой объем 39 г/л КПК или 17 г/л КМА, добавляют 10 г/л бактериологического агара и автоклавируют (объема для одной чашки Петри хватает более чем на 30 изолятов). Питательная среда, используемая в культуре слайдов, должна быть более твердой, чем обычная среда. Автоклав 100 мл дистиллированной воды.
   3. Работа внутри ламинарного колпака. Поместите жидкую среду в чашку Петри, образуя слой высотой около 0,5 см. Дайте среде застыть. После затвердевания стерильным скальпелем вырежьте квадраты среды размером 1 см x 1 см.
   4. Откройте набор чашки Петри внутри колпака с ламинарным потоком и используйте пламенные щипцы, чтобы упорядочить материал, автоклавный внутри чашки. Расположите материал в пронумерованном порядке, как показано на рисунке 2A, поместив квадрат питательной среды на предметное стекло. Перед тем, как поместить покровный лист на носитель, перейдите к шагу 5.4.5.
   5. Используйте автоклавную зубочистку, чтобы извлечь гифы из изолята, и осторожно потрите четыре боковые грани среды, помещенной на предметное стекло. Поместите автоклавный покровный листок на средний квадрат с помощью пламенных щипцов.
   6. Используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы поместить автоклавную воду в фильтровальную бумагу, чтобы создать влажную камеру. Используйте объем, чтобы пропитать бумагу, не добавляя лишнего количества воды. Запечатайте чашку Петри пищевой пленкой и определите ее соответствующим кодом изолята. Выдерживайте посуду в темноте при температуре 25-27 °C в течение 3-7 дней.
   7. Оцените рост гиф в предметном стекле и покровном стекле. Из каждого набора для культивирования слайдов изготавливаются два предметных стекла: один с использованием предметного стекла с гифами и автоклавным покровным стеклом, второй с использованием покровного стекла с гифами, а другой со стеклянным предметным стеклом.
   8. После наблюдения за ростом гифа осторожно отделите квадрат среды от предметного стекла (рис. 2Б), закрепите два предметных стекла с помощью выбранного красителя (шаг 5.5) и проанализируйте под световым микроскопом. Не забудьте идентифицировать изолированный код на слайде. Чтобы получить полуперманентные слайды, запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей.
   9. Чтобы получить перманентные предметные стекла, тщательно смойте краситель с прилипших гиф после окрашивания и дайте предметному стеколу высохнуть. Монтаж с быстросъемным монтажным материалом (подробнее см. Pena-Passos et ^al.10).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаток изготовления перманентного предметного стекла с помощью этой техники заключается в том, что споры и структуры, не прилипшие к стеклу, могут быть промыты.
5. Методы окрашивания и наблюдение за гифами
   1. Лактофенол хлопковый синий (LPCB)²¹: добавьте 20 мл молочной кислоты, 40 мл глицерина и 20 мл дистиллированной воды. Растворите в этом растворе 20 г кристаллов фенола, слегка нагревая. Растворяют 0,05 г метилового синего (хлопкового синего, или 2 мл 1% водного раствора). LPCB также можно легко приобрести уже готовым.
      ВНИМАНИЕ: Фенол очень токсичен и летуч; Манипулируйте им исключительно внутри вытяжного шкафа и надевайте перчатки.
   2. Толуидиновый синий O¹⁰ (TBO): Приготовьте 0,05% TBO в 0,1 М фосфатном буфере (pH 6,8).
   3. Конголезское красное^22,23,24: Приготовьте раствор 1% конголезского красного в дистиллированной воде и отфильтруйте его. Выдерживать 5-10 мин. Этот краситель также может быть применен для флуоресцентной микроскопии²⁵.
   4. При наблюдении и фотографировании гиф грибов под световым микроскопом обращайтесь к различным библиографическим источникам, которые помогут идентифицировать структуры (см. обсуждение).

Рисунок 2: Процедуры культивирования предметных стекол нитчатых грибов . (A) Схематическая конфигурация набора для культивирования предметных стекол, где цифры обозначают порядок расположения элементов. (Б) В предметном стекле и покровном стекле наблюдается отслоение квадрата питательной среды после роста гифы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

6. Выделение общей ДНК из грибных изолятов (самодельный протокол²⁶ с модификациями ²⁷)

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый материал, раствор и реагент, используемые в этом разделе, должны быть стерильными. Те, которые не могут быть куплены уже стерилизованными, должны быть автоклавированы при 121 °C в течение 20 минут. Надевайте перчатки в течение всего протокола и выполняйте некоторые этапы в вытяжном шкафу.

1. Приготовьте буфер для экстракции: 1% додецилсульфат натрия (SDS), 250 мМ NaCl, 200 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Выращивают очищенные изоляты в 39 г/л КПК в течение 7-14 дней.
2. Аккуратно соскребают мицелий с изолята с помощью шпателя или ложки и переносят фрагменты в автоклавную ступку, избегая переноса питательной среды с агрегатом гиф. С помощью фарфорового пестика измельчите мицелий с жидким азотом до состояния мелкого порошка. Не позволяйте измельчаемому мицелию растаять, добавляя азот, чтобы избежать этого.
3. Добавьте 1 мл экстракционного буфера в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл и поместите измельченный образец до отметки 1,5 мл. Осторожно перемешайте содержимое пробирок для гомогенизации.
4. Перемешайте пробирки в вихре в течение 5 с и поместите их в термоблок при температуре 65 °C на 20 минут. Тщательно гомогенизируйте содержимое путем инверсии каждые 7-10 минут.
5. Центрифугируйте пробирки при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перелейте 800 мкл из верхней фазы в новую пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл, добавьте в пробирки 800 мкл фенола и перемешайте содержимое путем инверсии.
   ВНИМАНИЕ: Фенол является высокотоксичным и летучим реагентом; Он может вызвать эритему, гангрену и некроз тканей. При вдыхании может вызвать одышку и кашель. Системная абсорбция может повредить печень, почки и центральную нервную систему. Манипулируйте фенолом исключительно в вытяжном шкафу и надевайте перчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная со следующего шага, используйте перчатки и проводите протокол в вытяжном шкафу.
6. Центрифужируют пробирки при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C и переносят 800 мкл из верхней фазы в новую пробирку объемом 2 мл, осторожно избегая переноса содержимого нижней фазы.
7. Добавьте в пробирки 400 мкл фенола и 400 мкл хлороформа и перемешайте содержимое методом инверсии. Центрифугируйте их при 10 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   ВНИМАНИЕ: Хлороформ является высокотоксичным и летучим реагентом; При контакте с кожей он может вызывать раздражение и травмы, а при вдыхании поражает центральную нервную и кардиореспираторную системы, печень и почки. Манипулируйте хлороформом исключительно в вытяжном шкафу и надевайте перчатки.
8. Рекуперация 800 мкл или менее из верхней фазы в новую пробирку объемом 2 мл. Добавьте 800 мкл хлороформа, перемешайте содержимое путем инверсии и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе остатки нижней фазы не должны перекладываться в новые пробирки. Таким образом, будьте особенно осторожны при рекуперации верхней фазы.
9. Перенесите 600-800 мкл из верхней фазы в новую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 450 мкл изопропанола. Содержимое перемешивают инверсией и инкубируют при 25 °С в течение 5 мин.
10. Центрифугируют пробирки при 10 000 x g в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость с помощью микропипетки. Будьте осторожны, чтобы не выбросить гранулы, осевшие на дне тюбика.
11. Добавьте 500 мкл 80% этанола и центрифугируйте в течение 5 минут. Повторите дважды, если гранула не осветлена.
12. Удалите этанол с помощью микропипетки и высушите гранулу при температуре 37 °C в течение 30-60 минут. Добавьте 30-50 мкл деионизированной воды, элюируя гранулы с помощью микропипетки.
13. Выдержите пробирки при температуре 4 °C в течение ночи для полного элюирования ДНК и заморозьте содержимое при -20 °C.

7. Выделение общей ДНК из органов растений для методики метабаркодирования (коммерческий набор)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующей методики необходимо приобрести коммерческий набор, указанный в таблице материалов , как набор для экстракции почвенной ДНК. Каждый материал, раствор и реагент, используемые в этом разделе, должны быть стерильными. Те, которые не могут быть куплены уже стерилизованными, должны быть автоклавированы при 121 °C в течение 20 минут. Настоятельно рекомендуется носить перчатки в течение всего протокола, а шаги можно проводить внутри ламинарного колпака. Описанный протокол является модификацией De Souza et ^al.12 из протокола, подробно описанного производителем.

1. Используя фарфоровые пестики и ступки, измельчите корни, собранные после шага 1.2, в жидком азоте, измельчив образцы до мелкого порошка. Добавьте 0,3 г измельченных образцов в пробирки PowerBead и осторожно перемешайте до гомогенизации.
2. Добавьте 60 мкл раствора С1 (входит в комплект) в пробирки PowerBead и перемешайте содержимое методом инверсии. Используя тканевый гомогенизатор и лизер клеток (таблица материалов), прочно привяжите трубки к соответствующей опоре, соедините опору с вихрем и запустите оборудование на максимальной скорости в течение 10-20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор C1 выпадает в осадок, нагрейте его при 60 °C до полного растворения.
3. Центрифугируйте пробирки при 10 000 x g в течение 30 с при 25 °C. Переносят 500 мкл надосадочной жидкости в пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл. Переносимое содержимое может быть твердыми частицами.
4. Добавить в пробирки 250 мкл раствора С2 и перемешать в вихре в течение 5 с. Инкубируют при 4 °C в течение 5 минут, а затем центрифугируют при 10 000 x G в течение 1-2 минут при 25 °C.
5. Перенесите более 600 мкл надосадочной жидкости в новые пробирки объемом 2 мл, избегая гранул. Добавляют 200 мкл раствора С3 и перемешивают на вихре в течение 5 с.
6. Инкубируют при 4 °C в течение 5 мин, а затем центрифугируют при 10 000 x G в течение 1 мин при 25 °C. На этом этапе убедитесь, что надосадочная жидкость не содержит твердых частиц.
7. Перенесите более 750 мкл надосадочной жидкости в новые пробирки объемом 2 мл, избегая гранул. Раствор С4 хорошо гомогенизируют, добавляют к надосадочной жидкости 1100 мкл раствора С4 и перемешивают в вихре в течение 5 с.
8. Загрузите 675 мкл из содержимого пробирок в колонках MB Spin Columns, через фильтр и центрифугу при 10 000 x g в течение 1 мин при 25 °C. Выбросьте жидкое содержимое.
9. Повторите предыдущий шаг дважды, пока не будет обработано все содержимое каждой пробирки. Затем добавьте 500 мкл раствора C5 в центр фильтра, находящегося в верхней колонне пробирки, и центрифугу при 10 000 x g в течение 30 с при 25 °C.
10. Выбросьте жидкое содержимое и снова центрифугируйте в тех же условиях, что и на предыдущем этапе. Осторожно переложите верхнюю колонку колонки MB Spin Column в новые пробирки для микроцентрифуг объемом 2 мл, избегая попадания жидкости в колонку.
11. Добавьте 85-100 мкл раствора С6 в центр фильтра и подождите 1 минуту. Центрифуга при 10 000 x g в течение 30 с при 25 °C и утилизируйте колонку MB Spin Column. Хранить пробирки при температуре -80 °C.

8. Количественное определение ДНК в спектрофотометре (см. Таблицу материалов)

1. С помощью указанного спектрофотометра откройте программное обеспечение. Выберите опцию Нуклеиновая кислота, выберите опцию ДНК и установите концентрацию нг/мкл.
2. Добавьте 1 мкл деионизированной воды в детектор спектрофотометра и выполните калибровку, выбрав опцию Пусто. После считывания аккуратно протрите датчик мягкой папиросной бумагой.
3. Назовите полевой образец кодом изолята считываемой пробы и поместите 1 мкл его в детектор оборудования. Выберите опцию Измерить; Формируется график и таблица с результатами.
4. Повторяйте шаг 8.3 до тех пор, пока не будут прочитаны все образцы. Таблицу со сформированными результатами рекомендуется сохранить для записи и анализа: выберите опцию Отчеты и место, куда будет сохранен .xml файл.
5. Добавьте в детектор 5 мкл деионизированной воды, подождите несколько минут и аккуратно протрите мягкой папиросной бумагой.

Результаты

В протоколе изоляции, учитывая наличие загрязнения от воды, использованной при последней промывке, а также обнаружение загрязнения в чашках Петри с инокулированными фрагментами, могут быть предприняты различные действия в зависимости от типа загрязняющего вещества ...

Обсуждение

Поверхностная дезинсекция образцов растений является одним из наиболее ответственных этапов в представленном протоколе. Крайне желательно отсутствие загрязнений в посуде КПК каплями от последней стирки. Бактерии часто наблюдаются в качестве загрязняющих веществ в изоляционных чаш?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)