Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Riepilogo

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Abstract

Le piante micoeterotrofe presentano una delle forme più estreme di dipendenza micorrizica, avendo perso totalmente la loro capacità autotrofica. Essenziali come qualsiasi altra risorsa vitale, i funghi a cui queste piante si associano intimamente sono essenziali per loro. Pertanto, alcune delle tecniche più rilevanti nello studio delle specie micoeterotrofe sono quelle che consentono di studiare i funghi associati, in particolare quelli che abitano le radici e gli organi sotterranei. In questo contesto, vengono comunemente applicate tecniche per l'identificazione di funghi endofiti coltura-dipendenti e coltura-indipendenti. L'isolamento degli endofiti fungini fornisce un mezzo per identificarli morfologicamente, analizzare la loro diversità e mantenere inoculi per applicazioni nella germinazione simbiotica dei semi di orchidea. Tuttavia, è noto che esiste una grande varietà di funghi non coltivabili che abitano i tessuti vegetali. Pertanto, le tecniche di identificazione molecolare indipendenti dalla coltura offrono una copertura più ampia della diversità e dell'abbondanza delle specie. Questo articolo si propone di fornire il supporto metodologico necessario per l'avvio di due procedure di indagine: una cultura-dipendente e una indipendente. Per quanto riguarda il protocollo coltura-dipendente, vengono descritti in dettaglio i processi di raccolta e mantenimento dei campioni vegetali dai siti di raccolta alle strutture di laboratorio, insieme all'isolamento dei funghi filamentosi dagli organi sotterranei e aerei delle piante micoeterotrofe, al mantenimento di una collezione di isolati, alla caratterizzazione morfologica delle ife mediante la metodologia di coltura a vetrino e all'identificazione molecolare dei funghi mediante estrazione totale del DNA. Comprendendo metodologie indipendenti dalla coltura, le procedure dettagliate includono la raccolta di campioni di piante per le analisi metagenomiche e l'estrazione del DNA totale dagli organi vegetali aclorofilliani utilizzando un kit commerciale. Infine, per le analisi vengono suggeriti anche protocolli di continuità (ad esempio, reazione a catena della polimerasi [PCR], sequenziamento) e vengono qui presentate tecniche.

Introduzione

I funghi endofiti sono, per definizione, quelli che abitano l'interno degli organi e dei tessuti vegetali in caso di infezioni poco appariscenti (cioè senza causare danni al loro ospite)^1,2. Questi funghi possono interagire in modo neutro o benefico con le piante ospiti, possono conferire resistenza agli agenti patogeni e alle condizioni ambientali sfavorevoli e possono contribuire alla sintesi di composti benefici per la pianta (ad esempio, fattori di crescita e altri fitormoni)^1,3. Gli endofiti micorrizici sono funghi che stabiliscono associazioni micorriziche con la pianta, prendendo parte al trasferimento dei nutrienti⁴. Nelle Orchidaceae, l'interazione con gli endofiti micorrizici è fondamentale per la germinazione dei semi nella stragrande maggioranza delle specie, e per l'insediamento delle piantine in tutte le piante della famiglia⁵. In tali contesti, le orchidee micoeterotrofe rappresentano un caso di totale dipendenza nei confronti dei loro partner micorrizici, in quanto dipendono dal trasferimento di nutrienti minerali e composti carboniosi da parte di questi funghi durante il loro intero ciclo vitale⁶. Pertanto, l'isolamento e l'identificazione dei funghi associati è una base fondamentale quando si studiano le strategie di vita micoeterotrofe. Inoltre, poco si sa sul ruolo degli endofiti fungini nelle piante micoeterotrofe o anche sulla reale diversità di questi funghi ^7,8.

Lo studio dei funghi endofiti può essere condotto attraverso diverse tecniche, tradizionalmente descritte come coltura-indipendenti o -dipendenti, ad esempio: (a) osservazione diretta, (b) isolamento fungino e identificazione morfologica e/o molecolare, e (c) estrazione totale del DNA dei tessuti vegetali e identificazione molecolare⁹. Nell'osservazione diretta (a), i funghi endofiti possono essere studiati mentre si trovano ancora all'interno di cellule e tessuti vegetali mediante microscopia ottica o elettronica⁹, poiché diversi protocolli di microscopia sono dettagliati da Pena-Passos et ^al.10. Con i metodi di isolamento (b), gli endofiti fungini possono essere caratterizzati in base alle loro colonie, ife e morfologia della struttura riproduttiva o di resistenza. Inoltre, attraverso tecniche di isolamento, è possibile condurre l'identificazione molecolare degli isolati attraverso l'estrazione del DNA, l'amplificazione delle sequenze di identificazione molecolare (codici a barre o impronte digitali) e il sequenziamento¹¹. Quest'ultima tecnica (c) consente l'identificazione molecolare di funghi endofiti mediante estrazione di DNA all'interno dei tessuti vegetali (metabarcoding), seguita dalla preparazione e dal sequenziamento della libreria¹².

Inoltre, gli isolati fungini possono essere applicati in prove di germinazione simbiotica, utilizzando semi di orchidee autotrofe o micoeterotrofe. Un esempio di tale applicazione è l'indagine condotta da Sisti et ^al.13, che descrive la germinazione e le fasi iniziali dello sviluppo del protocormo in Pogoniopsis schenckii, un'orchidea micoeterotrofica, in associazione con alcuni dei suoi isolati, comprendenti funghi endofiti non micorrizici. Il protocollo di germinazione simbiotica applicato è dettagliato e presentato in un video di Pena-Passos et ^al.10. L'isolamento dei funghi in associazione con diversi organi della pianta consente di concentrarsi su diversi obiettivi di indagine riguardanti la natura delle interazioni pianta-fungo (ad esempio, per comprendere gli aspetti ecologici o fisiologici dell'associazione, nonché le indagini sul trasferimento di nutrienti dai funghi alla pianta)⁹.

Le metodologie presentate nella sezione 1 si basano su una raccolta di campioni di organi sotterranei, in quanto questi organi presentano le maggiori difficoltà di raccolta, e sono di grande interesse poiché gli endofiti micorrizici li colonizzano. Tuttavia, entrambi i protocolli inclusi (passaggi 1.1 e 1.2) possono essere applicati ad altri organi micoeterotrofi della pianta (ad esempio, rizomi, steli floreali e frutti). La metodologia di raccolta descritta nella fase 1.1 è designata per l'isolamento di funghi endofiti (sezione 2) per la caratterizzazione morfologica (sezioni 4 e 5) e/o l'estrazione di DNA totale per l'identificazione dell'isolato (sezione 6). D'altra parte, la metodologia di raccolta descritta nella fase 1.2 è assegnata esclusivamente all'estrazione totale del DNA di tessuti vegetali per tecniche di metabarcoding (sezione 7). Nella sezione 3 vengono presentati quattro metodi per la conservazione e la conservazione dei funghi filamentosi, due per la conservazione a breve termine (3-6 mesi) e gli altri due adeguati per la conservazione a lungo termine (>1 anno). La caratterizzazione morfologica (sezioni 4 e 5) può essere associata all'identificazione molecolare per rafforzarla e fornire importanti informazioni sulla macro- e micromorfologia fungina. La figura 1 riassume le metodologie collettive descritte in seguito.

Figura 1: Sintesi schematica dei metodi presentati. Raccolta delle piante e isolamento, conservazione e identificazione molecolare dei funghi mediante metodologie coltura-dipendenti e indipendenti dalla coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Raccolta di campioni di piante

1. Raccolta di campioni per metodi dipendenti dalle impostazioni cultura
   1. Scava con cura gli organi sotterranei; Questi possono essere radici, steli, rizomi o organi di deposito della pianta da raccogliere. Oltre ai terreni molto compatti, raccogli questi campioni a mano.
      NOTA: L'uso di strumenti come cazzuole o palette in questa fase è sconsigliato, in quanto può danneggiare le fragili strutture delle piante micoeterotrofe e può causare la contaminazione dei tessuti da parte di funghi non endofiti.
   2. Raccogli il maggior numero possibile di organi sotterranei. Conservare i campioni in sacchetti di carta all'interno di un contenitore raffreddato (ad es. scatola di polistirolo espanso o borsa termica con ghiaccio). Se vengono raccolti anche organi aerei, trasportarli separatamente da quelli sotterranei.
2. Raccolta di campioni per metodi indipendenti dalla coltura
   1. Scavare con cura le radici della pianta da raccogliere secondo le stesse raccomandazioni indicate nella NOTA dal punto 1.1.1.
   2. Raccogli il maggior numero possibile di organi sotterranei. Conservare i campioni raccolti in criotubi all'interno di azoto liquido (opzione desiderabile) o utilizzare provette da centrifuga circondate da ghiaccio secco (opzione alternativa). Mantenere separatamente gli organi aerei, se raccolti.

2. Isolamento di funghi endofiti associati ad organi vegetali¹⁴

NOTA: Ogni materiale, soluzione e reagente utilizzato in questa sezione deve essere sterile. Quelli che non possono essere acquistati già sterilizzati devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C per 20 min.

1. Disinfestazione superficiale degli organi vegetali
   1. Lavare i campioni raccolti (passaggio 1.1.2) in acqua corrente e rimuovere il più possibile il substrato e altri detriti che i campioni potrebbero avere.
   2. All'interno di una cappa a flusso laminare, mantenere i campioni lavati immersi in etanolo al 70% per 1 minuto (è possibile utilizzare un becher o un barattolo di vetro).
   3. Trasferire i campioni in un altro contenitore con ipoclorito di sodio con cloro attivo al 2% per 3 minuti.
   4. Mettere i campioni in un contenitore con etanolo al 70% e tenerli immersi per 1 minuto. Successivamente, lavare i campioni in sequenza in due contenitori con acqua distillata.
2. Installazione di frammenti vegetali nel terreno di coltura
   NOTA: Ogni passaggio descritto nel passaggio 2.2 deve essere eseguito all'interno di una cappa a flusso laminare.
   1. Prima dell'installazione, preparare piastre di Petri (8-10 cm di diametro) con 19,5 g/L di destrosio di patate agar terreno (PDA) + 7 g/L di agar batteriologico + 3 mL/L di antibiotici (ad es. streptomicina, penicillina, tetraciclina, ampicillina).
   2. Mantenere le piastre di Petri con il terreno di coltura a 36 °C per 24 ore prima di utilizzarle per garantire che non vi siano contaminazioni. Scartare le stoviglie contaminate da colonie di batteri o funghi.
      NOTA: L'aggiunta di antibiotici nel terreno è essenziale in questa fase, poiché gli organi sono altamente infettati da batteri che possono inibire la crescita fungina. Verificare se gli antibiotici possono essere riscaldati durante la sterilizzazione in autoclave; alcuni antibiotici devono essere aggiunti dopo aver raffreddato il terreno a circa 36 °C (prima di metterlo nei piatti).
   3. Subito dopo la disinfestazione superficiale dei campioni e sempre all'interno di una cappa a flusso laminare, in PDA, inoculare alcune gocce dell'acqua distillata dall'ultimo contenitore utilizzato per lavare i campioni. Questo passaggio è importante per valutare l'efficacia della disinfestazione superficiale dei campioni.
   4. In un piatto vuoto in autoclave, posizionare i campioni e utilizzare un bisturi fiammeggiato e una pinza per sezionare i campioni a uno spessore di circa 0,2 cm.
   5. Sezionare longitudinalmente i campioni cilindrici in due metà, se lo si desidera, per amplificare la superficie a contatto con il fluido. Per esporre meglio i frutti e altri organi più sferici, tritare o affettare accuratamente le strutture. I semi possono anche essere importanti fonti fungine, quindi assicurati che il frutto sezionato li esponga al substrato.
      NOTA: Solo gli organi sani, senza danni ai tessuti o segnali di possibili malattie o infezioni patogene, dovrebbero essere utilizzati nell'isolamento degli endofiti fungini.
   6. Distribuire cinque frammenti degli organi sotterranei nelle piastre di Petri con PDA + antibiotico. Assicurati che i frammenti siano il più lontano possibile l'uno dall'altro e che non tocchino i bordi del piatto. Non disporre alcun frammento sul supporto. Preparare le repliche di ogni organo installato, come precauzione in caso di contaminazione.
   7. Sigillare le piastre di Petri con pellicola trasparente e conservarle al buio a 25-27 °C (preferibilmente in un'incubatrice) per 5 giorni.
3. Calcolo della frequenza di isolamento (IF)¹¹
   1. Dopo 5 giorni di incubazione del frammento d'organo, calcolare l'IF, in base al numero di frammenti incubati che presentano colonie fungine in crescita diviso per il totale dei frammenti incubati, come rappresentato nella seguente equazione:
      
4. Purificazione degli isolati fungini mediante striatura e subcoltura
   NOTA: Ogni passaggio descritto nel passaggio 2.4 deve essere eseguito all'interno di una cappa a flusso laminare.
   1. Preparare le piastre di Petri (5 cm di diametro) con 5-7 g/L di agar-agar (AA; solo agar batteriologico). Mantenere le stoviglie per 24 ore a 36 °C per eliminare quelle eventualmente contaminate.
   2. Identifica ogni colonia fungina coltivata con un codice e delimita i suoi margini sul lato inferiore del piatto (può essere fatto con un pennarello indelebile). Differenzia le colonie in base al colore, al modello di crescita, alla consistenza e al formato dei margini.
   3. Con uno stuzzicadenti in legno autoclavato, utilizzando la punta fine, recuperare una piccola quantità di micelio da una colonia fungina. Concentrarsi preferibilmente sui margini della colonia e scegliere un'area il più lontana possibile da un'altra colonia, evitando di recuperare più di un tipo di colonia contemporaneamente.
   4. Usando lo stesso stuzzicadenti con il micelio all'estremità, striare l'AA producendo tre strie (scanalature). Assicurati che ogni stria sia a una distanza di 1 cm dall'altra e dai bordi del piatto. Scrivere l'apposito codice (utilizzando carta adesiva e matita), sigillare le stoviglie e mantenerle incubate al buio a 25-27 °C per 3 giorni.
   5. Preparare le piastre di Petri (8 cm di diametro) con 39 g/L di PDA. Non è necessario aggiungere antibiotici in questa fase.
   6. Dopo aver incubato le piastre AA, osservarle meticolosamente in controluce (da una lampada o da una finestra), con l'obiettivo di identificare le sottili ife che formano le singole colonie. Delimitare l'area di una singola colonia per capanna, utilizzando un pennarello indelebile sul lato inferiore della capsula di Petri.
   7. In una cappa a flusso laminare, utilizzare uno stuzzicadenti autoclavato per tagliare una porzione del terreno contenente la colonia e trasferire il volume tagliato al centro di una nuova capsula PDA.
   8. Identificare le piastre di Petri con i codici degli isolati, sigillare le piastre con pellicola trasparente e mantenerle al buio a 25-27 °C per 7-14 giorni.

3. Conservazione degli isolati fungini purificati

NOTA: Ogni materiale, soluzione e reagente utilizzato in questa sezione deve essere sterile. Quelli che non possono essere acquistati già sterilizzati devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C per 20 min.

1. Conservazione con metodo Castellani o in olio minerale (3-6 mesi)^11,15
   1. Preparare provette per microcentrifuga da 2 mL con 0,5 mL di acqua distillata o contenenti 0,5 mL di olio minerale (a seconda del metodo scelto). Assicurarsi che le provette siano vuote in autoclave e che l'acqua e l'olio sterilizzati in autoclave vengano aggiunti alle provette all'interno di una cappa a flusso laminare.
   2. In una cappa a flusso laminare, posizionare le piastre di Petri con isolati purificati già coltivati in PDA (39 g/L) per 7-14 giorni. Usando uno stuzzicadenti autoclavato, tagliare dei piccoli cuboidi (0,5 cm x 0,5 cm nella zona superiore) di terreno contenente i margini del micelio.
   3. Mettere da quattro a sei cubi nelle provette della microcentrifuga con acqua distillata (metodo Castellani) o olio minerale. Conservare le provette al buio, a 25 °C per tutto il tempo necessario, rispettando i limiti di tempo del metodo.
      NOTA: Evitare di aggiungere troppi parallelepipedi ai tubi e di riempirli, il che potrebbe aumentare le possibilità di contaminazione. E' possibile mantenere le provette refrigerate, il che può favorire la conservazione di alcuni isolati più a lungo. Currah et ^al.16 raccomandano di conservare le repliche degli isolati di funghi micorrizici delle orchidee tropicali sia refrigerati che a 25 °C, poiché possono essere persi durante la conservazione a freddo.
   4. Recupera un parallelepipedo e posizionalo al centro di una nuova parabola PDA per far crescere un isolato immagazzinato.
2. Crioconservazione in chicchi di riso non decorticati (>1 anno)¹⁷
   1. Lavare i chicchi di riso non decorticati in acqua corrente e cuocerli fino a quando il guscio di riso inizia ad aprirsi. Distribuire i chicchi cotti in provette di vetro con tappo a vite e sterilizzare in autoclave due volte con un intervallo di 24 ore tra una e l'altra.
   2. In una cappa a flusso laminare, posizionare le piastre di Petri con isolati purificati già coltivati in PDA (39 g/L) per 7-14 giorni. Utilizzando uno stuzzicadenti autoclavato, recuperare cinque piccoli frammenti di ife dai margini del micelio e inocularli nella provetta contenente i chicchi di riso autoclavati.
      NOTA: L'inoculazione di ife in diversi punti e profondità della provetta garantisce che l'isolato colonizzi i chicchi di riso non decorticati in minor tempo.
   3. Incubare le provette al buio a 25-27 °C per 14 giorni. Agitare i tubi facendoli vorticare ogni 3 giorni per mantenere i chicchi individualizzati.
   4. Dopo aver osservato la crescita fungina nei chicchi di riso, distribuire i chicchi in una capsula di Petri autoclavata rivestita con carta da filtro per assorbire l'umidità, sopra la carta in modo che i chicchi possano asciugarsi. Conservare al buio a 25-27 °C per 2-3 giorni.
   5. Preparare i criotubi con 1/3 di gel di silice sul fondo e 1/3 di lana di vetro sopra la silice. Infine, distribuire 1/3 dei chicchi di riso con micelio fungino cresciuto. Conservare a -20 °C per 24 h.
   6. Dopo 24 ore, conservare i criotubi a -80 °C per tutto il tempo necessario, rispettando i limiti di tempo del metodo.
3. Crioconservazione in vermiculite con crioprotettore (>1 anno)¹⁸
   1. Preparare un terreno di coltura liquido composto dallo 0,2% di estratto di lievito e dal 2% di glucosio in acqua distillata. Regolare il pH a 5 e sterilizzarlo in autoclave.
   2. Distribuire 0,2 g di vermiculite (utilizzare granulometria fine) in criotubi con tappo a vite e sterilizzarli in autoclave. Aggiungere 0,8 mL di terreno liquido autoclavato ai criotubi contenenti vermiculite.
   3. In una cappa a flusso laminare, posizionare le piastre di Petri con isolati purificati già coltivati in PDA (39 g/L) per 7-14 giorni. Utilizzando uno stuzzicadenti autoclavato, recuperare da tre a cinque frammenti di ife dai margini del micelio e inoculare lungo la provetta contenente vermiculite + terreno di coltura liquido. Ricordarsi di identificare i criotubi con il rispettivo codice di isolamento.
      NOTA: L'inoculazione di ife in diversi punti e profondità del criotubo garantisce che l'isolato colonizzi la vermiculite in meno tempo.
   4. Conservare i criotubi al buio a 25-27 °C fino a quando non si osserva la colonizzazione della maggior parte dei grani di vermiculite, che di solito richiede circa 14 giorni.
   5. Preparare una soluzione crioprotettiva composta dal 5% di glicerolo e dal 5% di trealosio in acqua distillata e sterilizzarla in autoclave. Lasciare raffreddare la soluzione prima di utilizzarla.
   6. Dopo che la vermiculite nei criotubi è stata colonizzata dal rispettivo isolato fungino, distribuire 0,4 mL di crioprotettore in ciascuna provetta e mantenere i criotubi refrigerati a 4 °C per 48 ore. Successivamente, mantenere i criotubi a -80 °C per tutto il tempo necessario, rispettando i limiti di tempo del metodo.

4. Caratterizzazione macromorfologica di funghi filamentosi (morfologia delle colonie)

1. Mantenere un registro fotografico del micelio coltivato in ciascuna capsula di Petri con 39 g/L PDA per 7-14 giorni. Ricordati di registrare entrambi i lati della colonia, la parte superiore e quella inferiore (rovescio). Se i piatti devono essere prontamente utilizzati nella sezione 6 o non vengono mantenuti, aprire i piatti quando li si fotografa per ottenere foto migliori.
2. Se interessati a dati quantitativi sulla morfologia della colonia, la subcoltura replica gli isolati e li mantiene nelle stesse condizioni di crescita e per un periodo costante per registrare il diametro della colonia e calcolare il tasso di crescita (di solito in mm/h).
   NOTA: Risultati quantitativi più sofisticati possono essere ottenuti utilizzando diversi tipi di terreni di coltura per il confronto¹⁹ e considerando gli strumenti statistici per il trattamento dei dati.
3. Osservare le colonie anche al microscopio stereoscopico per identificarne le caratteristiche morfologiche e fotografarle ingrandindole. Valutare le colonie in base alle loro caratteristiche macromorfologiche, come dettagliato nella sezione dei risultati. Consultare diverse fonti bibliografiche per aiutare a classificare e correlare la macromorfologia all'identificazione molecolare e/o morfologica.

5. Caratterizzazione micromorfologica di funghi filamentosi (morfologia ifale)

NOTA: Le tecniche micromorfologiche sono confrontate nella sezione di discussione, considerandone i possibili usi e svantaggi.

1. Coltivare gli isolati su piastre di Petri con 39 g/L PDA per 7-14 giorni. Per valutare i funghi micorrizici putativi delle orchidee, coltivare gli isolati su 17 g/L di agar di farina di mais (CMA; o un altro mezzo limitante i nutrienti) per 3-7 giorni¹⁹.
2. Stuzzicare il supporto
   1. Lavorare all'interno di una cappa a flusso laminare. Posizionare una goccia di una macchia scelta (passaggio 5.5) su un vetrino pulito.
   2. Utilizzando uno stuzzicadenti autoclavato o un altro materiale sterile, rimuovere con cura alcune ife dall'isolato coltivato e posizionarle nella goccia di colorante. Posizionare un vetrino coprioggetto (preferibilmente con un angolo iniziale di 45° per evitare bolle d'aria) e analizzarlo al microscopio ottico.
3. Supporto per nastro adesivo
   NOTA: Questa tecnica viene solitamente applicata nelle colture fungine per essere prontamente utilizzata nella sezione 6 o non mantenuta, poiché il nastro adesivo non può essere sterilizzato in autoclave e possono verificarsi contaminazioni dopo l'esecuzione del metodo.
   1. Posizionare una goccia di una macchia scelta (passaggio 5.5) su un vetrino pulito. Tagliare una striscia di nastro adesivo trasparente di dimensioni che si adattino bene al vetrino e alla goccia di macchia centrale.
   2. Dirigere la superficie adesiva della striscia sulla superficie del micelio. Non premere e cerca di raccogliere alcune ife senza attaccarne troppe.
   3. Incolla il nastro adesivo sul vetrino, assicurandoti che la macchia sia a contatto con le ife raccolte. Metti una goccia d'acqua sopra il nastro e posiziona un vetrino coprioggetti. Analizza il vetrino al microscopio ottico.
4. Coltura di vetrini di funghi filamentosi²⁰
   1. All'interno di una capsula di Petri di grandi dimensioni (>9 cm di diametro, preferibilmente), posizionare: carta da filtro nella parte inferiore, un'asta di vetro a forma di U o un adattamento (lo scopo è quello di fornire un'elevazione per il vetrino), un vetrino e due vetrini coprioggetti. Le piastre di Petri più alte facilitano la manipolazione. Autoclavare questi kit di piastre di Petri, uno per ogni isolato.
   2. Preparare un piccolo volume di 39 g/L di PDA o 17 g/L di CMA, aggiungere 10 g/L di agar batteriologico e autoclave (il volume di una capsula di Petri è sufficiente per più di 30 isolati). I terreni di coltura utilizzati nella coltura dei vetrini devono essere più duri dei normali terreni. Autoclave 100 mL di acqua distillata.
   3. Lavorare all'interno di una cappa a flusso laminare. Mettere il terreno liquido in una capsula di Petri, producendo uno strato alto circa 0,5 cm. Lascia che il mezzo si solidifichi. Una volta solido, utilizzare un bisturi sterile per tagliare quadrati del terreno di dimensioni 1 cm x 1 cm.
   4. Aprire il kit della capsula di Petri all'interno di una cappa a flusso laminare e utilizzare una pinza fiammata per organizzare il materiale sterilizzato in autoclave all'interno della capsa. Disporre il materiale nell'ordine numerato, come si vede nella Figura 2A, posizionando un quadrato di terreno di coltura sul vetrino. Prima di posizionare il vetrino coprioggetto sul supporto, procedere al punto 5.4.5.
   5. Utilizzare uno stuzzicadenti autoclavato per recuperare alcune ife da un isolato e strofinare con cura le quattro facce laterali del terreno posto sul vetrino. Posizionare un vetrino coprioggetto autoclavato sul quadrato medio utilizzando una pinza fiammata.
   6. Utilizzare un puntale per pipetta sterile per inserire l'acqua sterilizzata in autoclave nella carta da filtro, per creare una camera umida. Utilizzare un volume per saturare la carta senza aggiungere acqua in eccesso. Sigillare la capsula di Petri con pellicola trasparente e identificarla con il rispettivo codice isolato. Mantenere le stoviglie al buio a 25-27 °C per 3-7 giorni.
   7. Valutare la crescita delle ife nel vetrino e nel vetrino. Da ogni kit di coltura vengono prodotti due vetrini, uno utilizzando il vetrino con ife e il vetrino coprioggetti autoclavato, il secondo utilizzando il vetrino coprioggetti con ife e un altro vetrino.
   8. Dopo aver osservato la crescita ifale, staccare con cautela il quadrato di terreno dal vetrino (Figura 2B), montare i due vetrini utilizzando un colorante scelto (passaggio 5.5) e analizzare al microscopio ottico. Ricordarsi di identificare il codice di isolamento sulla diapositiva. Per produrre vetrini semipermanenti, sigillare il vetrino coprioggetti con smalto trasparente.
   9. Per produrre vetrini permanenti, lavare accuratamente il colorante dalle ife aderenti dopo la colorazione e lasciare asciugare il vetrino. Montare con un mezzo di montaggio rapido (per i dettagli, leggere Pena-Passos et ^al.10).
      NOTA: Lo svantaggio di produrre un vetrino permanente con questa tecnica è che le spore e le strutture non aderenti al vetro possono essere lavate.
5. Metodi di colorazione e osservazione delle ife
   1. Lattofenolo blu di cotone (LPCB)²¹: aggiungere 20 ml di acido lattico, 40 ml di glicerolo e 20 ml di acqua distillata. Sciogliere 20 g di cristalli di fenolo in questa soluzione riscaldando delicatamente. Sciogliere 0,05 g di blu di metile (blu di cotone o 2 ml di soluzione acquosa all'1%). LPCB può anche essere facilmente acquistato già preparato.
      ATTENZIONE: Il fenolo è altamente tossico e volatile; manipolarlo esclusivamente all'interno di una cappa aspirante e indossare i guanti.
   2. Blu di toluidina O¹⁰ (TBO): Preparare TBO allo 0,05% in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,8).
   3. Congo rosso^22,23,24: Preparare una soluzione di rosso Congo all'1% in acqua distillata e filtrarla. Incubare per 5-10 min. Questo colorante può essere applicato anche per la microscopia a fluorescenza²⁵.
   4. Quando si osservano e si fotografano le ife fungine al microscopio ottico, consultare diverse fonti bibliografiche per aiutare a identificare le strutture (controlla la discussione).

Figura 2: Procedure per la coltura di funghi filamentosi. (A) Configurazione schematica di un kit di coltura di vetrini, in cui i numeri indicano l'ordine di disposizione degli elementi. (B) Si osserva il distacco del quadrato del terreno di coltura dopo la crescita ifale nel vetrino e nel vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Estrazione totale del DNA da isolati fungini (protocollo casalingo²⁶ con modifiche ²⁷)

NOTA: Ogni materiale, soluzione e reagente utilizzato in questa sezione deve essere sterile. Quelli che non possono essere acquistati già sterilizzati devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C per 20 min. Indossare i guanti durante tutto il protocollo ed eseguire alcune fasi all'interno di una cappa aspirante.

1. Preparare il tampone di estrazione: 1% di sodio dodecil solfato (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 25 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Coltivare gli isolati purificati in 39 g/L PDA per 7-14 giorni.
2. Raschiare con cura il micelio da un isolato utilizzando una spatola o un cucchiaio e trasferire i frammenti in una malta autoclavata, evitando di trasferire il terreno di coltura con l'aggregato di ife. Usando un pestello di porcellana, macinare il micelio con azoto liquido fino a ottenere una polvere fine. Non lasciare che il micelio macinato si sciolga, aggiungendo azoto per evitarlo.
3. Aggiungere 1 mL di tampone di estrazione in una provetta per microcentrifuga da 2 mL e posizionare il campione macinato fino al segno di 1,5 mL. Agitare delicatamente il contenuto delle provette per omogeneizzare.
4. Agitare i tubi in un vortice per 5 s e metterli in un termoblocco a 65 °C per 20 min. Omogeneizzare accuratamente il contenuto per inversione ogni 7-10 min.
5. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire 800 μL dalla fase superiore a una nuova provetta per microcentrifuga da 2 mL, aggiungere 800 μL di fenolo alle provette e miscelare il contenuto per inversione.
   ATTENZIONE: Il fenolo è un reagente altamente tossico e volatile; Può causare eritema, cancrena e necrosi tissutale. Se inalato, può causare dispnea e tosse. L'assorbimento sistemico può danneggiare il fegato, i reni e il sistema nervoso centrale. Manipolare il fenolo esclusivamente all'interno di una cappa aspirante e indossare guanti.
   NOTA: Dalla fase successiva, utilizzare i guanti ed eseguire il protocollo all'interno di una cappa aspirante.
6. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C e trasferire 800 μL dalla fase superiore a una nuova provetta da 2 mL, evitando accuratamente il trasferimento del contenuto della fase inferiore.
7. Aggiungere 400 μL di fenolo e 400 μL di cloroformio alle provette e mescolare il contenuto per inversione. Centrifugarli a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   ATTENZIONE: Il cloroformio è un reagente altamente tossico e volatile; Può causare irritazioni e lesioni a contatto con la pelle e, se inalato, colpisce il sistema nervoso centrale e cardiorespiratorio, il fegato e i reni. Manipolare il cloroformio esclusivamente all'interno di una cappa aspirante e indossare guanti.
8. Recuperare 800 μL o meno dalla fase superiore in una nuova provetta da 2 mL. Aggiungere 800 μL di cloroformio, mescolare il contenuto per inversione e centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   NOTA: In questa fase, nessun residuo della fase inferiore deve essere trasferito ai nuovi tubi. Pertanto, fai molta attenzione quando recuperi la fase superiore.
9. Trasferire 600-800 μL dalla fase superiore a una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 450 μL di isopropanolo. Miscelare il contenuto per inversione e incubare a 25 °C per 5 min.
10. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante utilizzando una micropipetta. Fare attenzione a non gettare il pellet depositato sul fondo del tubo.
11. Aggiungere 500 μL di etanolo all'80% e centrifugare per 5 min. Ripetere due volte nel caso in cui il pellet non sia chiarificato.
12. Rimuovere l'etanolo con una micropipetta e asciugare il pellet a 37 °C per 30-60 minuti. Aggiungere 30-50 μL di acqua deionizzata, eluendo il pellet utilizzando una micropipetta.
13. Mantenere le provette a 4 °C per una notte per una completa eluizione del DNA e congelare il contenuto a -20 °C.

7. Estrazione totale del DNA da organi vegetali per metodologia di metabarcoding (kit commerciale)

NOTA: Per la seguente metodologia, è necessario acquistare il kit commerciale indicato nella Tabella dei Materiali come kit per l'estrazione del DNA del suolo. Ogni materiale, soluzione e reagente utilizzato in questa sezione deve essere sterile. Quelli che non possono essere acquistati già sterilizzati devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C per 20 min. Si consiglia vivamente di indossare guanti durante l'intero protocollo e i passaggi possono essere eseguiti all'interno di una cappa a flusso laminare. Il protocollo descritto è modificato da De Souza et ^al.12, dal protocollo dettagliato dal produttore.

1. Utilizzando pestelli e mortai in porcellana, macinare le radici raccolte seguendo il passaggio 1.2 in azoto liquido, riducendo i campioni in polvere fine. Aggiungere 0,3 g dai campioni macinati alle provette PowerBead e agitare delicatamente per omogeneizzare.
2. Aggiungere 60 μL di soluzione C1 (inclusa nel kit) alle provette PowerBead e miscelare il contenuto per inversione. Utilizzando un omogeneizzatore per tessuti e un lisatore cellulare (Tabella dei materiali), legare saldamente i tubi a un supporto adeguato, accoppiare il supporto al vortice e avviare l'apparecchiatura alla massima velocità per 10-20 minuti.
   NOTA: Nel caso in cui la soluzione C1 sia precipitata, riscaldarla a 60 °C fino alla completa dissoluzione.
3. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 30 s a 25 °C. Trasferire 500 μL del surnatante in provette da microcentrifuga da 2 mL. Il contenuto trasferito può essere particolato.
4. Aggiungere 250 μL di soluzione C2 alle provette e agitare in un vortice per 5 s. Incubare a 4 °C per 5 minuti e poi centrifugare a 10.000 x g per 1-2 minuti a 25 °C.
5. Trasferire più di 600 μL del surnatante in nuove provette da 2 mL, evitando il pellet. Aggiungere 200 μL di soluzione C3 e agitare a vortice per 5 s.
6. Incubare a 4 °C per 5 minuti e poi centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto a 25 °C. In questa fase, assicurarsi che il surnatante non sia particolato.
7. Trasferire più di 750 μL del surnatante in nuove provette da 2 mL, evitando il pellet. Omogeneizzare bene la soluzione C4, aggiungere 1.100 μL di soluzione C4 al surnatante e agitare in un vortice per 5 s.
8. Caricare 675 μL dal contenuto delle provette nelle colonne di rotazione MB, sopra il filtro, e centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto a 25 °C. Scartare il contenuto liquido.
9. Ripetere il passaggio precedente due volte fino a quando tutto il contenuto di ogni provetta non è stato elaborato. Quindi, aggiungere 500 μL di soluzione C5 al centro del filtro presente nella colonna superiore della provetta e centrifugare a 10.000 x g per 30 s a 25 °C.
10. Scartare il contenuto liquido e centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni del passaggio precedente. Trasferire con cautela la colonna superiore della colonna MB Spin su nuove provette per microcentrifuga da 2 mL, evitando di far gocciolare il contenuto di liquido nella colonna.
11. Aggiungere 85-100 μL di soluzione C6 al centro del filtro e attendere 1 minuto. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a 25 °C ed eliminare la colonna di centrifuga MB. Conservare le provette a -80 °C.

8. Quantificazione del DNA in spettrofotometro (vedi Tabella dei Materiali)

1. Utilizzando lo spettrofotometro indicato, aprire il software. Selezionare l'opzione Acido nucleico, scegliere l'opzione DNA e impostare la concentrazione su ng/μL.
2. Aggiungere 1 μL di acqua deionizzata al rivelatore dello spettrofotometro e calibrare selezionando l'opzione Blank. Dopo la lettura, pulire delicatamente il rilevatore con carta velina morbida.
3. Nominare il campione da campo con il codice di isolamento del campione da leggere e inserirne 1 μL nel rivelatore dell'apparecchiatura. Selezionare l'opzione Misura; Viene generato un grafico e una tabella con i risultati.
4. Ripetere il passaggio 8.3 fino a quando tutti i campioni sono stati letti. Si consiglia di salvare la tabella con i risultati generati per la registrazione e l'analisi: selezionare l'opzione Report e la posizione in cui verrà salvato il file .xml.
5. Aggiungere 5 μL di acqua deionizzata al rilevatore, attendere alcuni minuti e strofinare delicatamente con carta velina morbida.

Risultati

Nel protocollo di isolamento, considerando che c'è contaminazione dall'acqua utilizzata nell'ultimo lavaggio e che la contaminazione viene rilevata anche nelle piastre di Petri con frammenti inoculati, possono essere intraprese azioni diverse, a seconda del tipo di contaminante (Tabella 1). Questa procedura deve essere ripetuta fin dall'inizio in caso di contaminanti fungini altamente sporulanti, che presentano anche una crescita accelerata, e batteri a moltiplicazione i...

Discussione

La disinfestazione superficiale dei campioni vegetali è una delle fasi più critiche del protocollo presentato. È altamente auspicabile che non si contaminino le stoviglie PDA con gocce dell'ultimo lavaggio. I batteri sono spesso osservati come contaminanti nelle piastre di isolamento, di solito più dei funghi sporulanti presenti nell'aria, considerando che i batteri endofiti sono comuni anche all'interno dei tessuti vegetali ^3,11. Pertanto, l'aggiunta di anti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)