Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Resumo

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Resumo

As plantas micoheterotróficas apresentam uma das formas mais extremas de dependência micorrízica, tendo perdido totalmente sua capacidade autotrófica. Tão essenciais quanto qualquer outro recurso vital, os fungos com os quais essas plantas se associam intimamente são essenciais para elas. Assim, algumas das técnicas mais relevantes no estudo de espécies micoheterotróficas são as que possibilitam a investigação de fungos associados, especialmente aqueles que habitam raízes e órgãos subterrâneos. Nesse contexto, técnicas de identificação de fungos endofíticos dependentes e independentes de cultura são comumente aplicadas. O isolamento de endófitos fúngicos fornece um meio para identificá-los morfologicamente, analisar sua diversidade e manter inóculos para aplicações na germinação simbiótica de sementes de orquídeas. No entanto, sabe-se que existe uma grande variedade de fungos não cultiváveis habitando tecidos vegetais. Assim, técnicas de identificação molecular independentes de cultura oferecem uma cobertura mais ampla da diversidade e abundância de espécies. Este artigo tem como objetivo fornecer o suporte metodológico necessário para o início de dois procedimentos de investigação: um dependente de cultura e outro independente. Em relação ao protocolo cultura-dependente, são detalhados os processos de coleta e manutenção de amostras de plantas desde os locais de coleta até as instalações laboratoriais, além do isolamento de fungos filamentosos de órgãos subterrâneos e aéreos de plantas micoheterotróficas, manutenção de uma coleção de isolados, caracterização morfológica de hifas pela metodologia de cultura em lâminas e identificação molecular de fungos por extração de DNA total. Englobando metodologias independentes de cultura, os procedimentos detalhados incluem a coleta de amostras de plantas para análises metagenômicas e extração de DNA total de órgãos de plantas aclorofilas usando um kit comercial. Finalmente, protocolos de continuidade (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR], sequenciamento) também são sugeridos para análises, e técnicas são apresentadas aqui.

Introdução

Os fungos endofíticos são, por definição, aqueles que habitam o interior dos órgãos e tecidos vegetais em infecções imperceptíveis (isto é, sem causar danos ao seu hospedeiro)^1,2. Esses fungos podem interagir de forma neutra ou benéfica com as plantas hospedeiras, podem conferir resistência a patógenos e condições ambientais desfavoráveis e podem contribuir para a síntese de compostos benéficos para a planta (por exemplo, fatores de crescimento e outros fitohormônios)^1,3. Os endofíticos micorrízicos são fungos que estabelecem associações micorrízicas com a planta, participando da transferência de^nutrientes4. Em Orchidaceae, a interação com endófitos micorrízicos é fundamental para a germinação de sementes na grande maioria das espécies e estabelecimento de plântulas em todas as plantas da família⁵. Nesses contextos, as orquídeas micoheterotróficas representam um caso de total dependência em relação aos seus parceiros micorrízicos, uma vez que dependem da transferência de nutrientes minerais e compostos de carbono por esses fungos durante todo o seu ciclo de^vida6. Portanto, o isolamento e a identificação de fungos associados são uma base fundamental na investigação de estratégias de vida micoheterotrófica. Além disso, pouco se sabe sobre o papel dos fungos endófitos em plantas micoheterotróficas ou mesmo sobre a real diversidade desses fungos ^7,8.

A investigação de fungos endofíticos pode ser realizada por meio de diferentes técnicas, tradicionalmente descritas como independentes ou dependentes de cultura, como, por exemplo: (a) observação direta, (b) isolamento fúngico e identificação morfológica e/ou molecular, e (c) extração total de DNA de tecidos vegetais e identificação^molecular9. Na observação direta (a), fungos endofíticos podem ser investigados ainda no interior de células e tecidos vegetais por microscopia de luz ou^eletrônica9, uma vez que diferentes protocolos de microscopia são detalhados por Pena-Passos et ^al.10. Pelos métodos de isolamento (b), os endófitos fúngicos podem ser caracterizados de acordo com suas colônias, hifas e morfologia da estrutura reprodutiva ou de resistência. Além disso, por meio de técnicas de isolamento, é possível realizar a identificação molecular de isolados por meio de extração de DNA, amplificação de sequências de identificação molecular (códigos de barras ou impressões digitais) e sequenciamento¹¹. Esta última técnica (c) permite a identificação molecular de fungos endofíticos por extração de DNA no interior dos tecidos vegetais (metacódigo de barras), seguida de preparo e sequenciamento de bibliotecas¹².

Além disso, isolados fúngicos podem ser aplicados em ensaios de germinação simbiótica, utilizando sementes de orquídeas autotróficas ou micoheterotróficas. Um exemplo dessa aplicação é a investigação conduzida por Sisti et ^al.13, descrevendo a germinação e os estágios iniciais de desenvolvimento do protocormo em Pogoniopsis schenckii, uma orquídea micoheterotrófica, em associação com alguns de seus isolados, compostos por fungos endofíticos não micorrízicos. O protocolo de germinação simbiótico aplicado é detalhado e apresentado em vídeo por Pena-Passos et ^al.10. O isolamento de fungos em associação com diferentes órgãos vegetais permite diversos enfoques de investigação sobre a natureza das interações planta-fungos (por exemplo, compreender aspectos ecológicos ou fisiológicos da associação, bem como investigações sobre a transferência de nutrientes dos fungos para a planta)⁹.

As metodologias apresentadas na seção 1 baseiam-se em uma coleção de amostras de órgãos subterrâneos, uma vez que esses órgãos apresentam maiores dificuldades de coleta, e são de grande interesse, uma vez que os endófitos micorrízicos os colonizam. No entanto, ambos os protocolos incluídos (etapas 1.1 e 1.2) podem ser aplicados a outros órgãos de plantas micoheterotróficas (por exemplo, rizomas, caules florais e frutos). A metodologia de coleta descrita na etapa 1.1 é designada para o isolamento de fungos endofíticos (seção 2) para caracterização morfológica (seções 4 e 5) e/ou extração total de DNA para identificação de isolados (seção 6). Por outro lado, a metodologia de coleta descrita na etapa 1.2 é atribuída exclusivamente à extração total de DNA de tecidos vegetais para técnicas de metabarcoding (seção 7). Na seção 3, são apresentados quatro métodos para armazenamento e preservação de fungos filamentosos, dois para armazenamento de curta duração (3-6 meses) e os outros dois adequados para armazenamento de longo prazo (>1 ano). A caracterização morfológica (seções 4 e 5) pode ser associada à identificação molecular para reforçá-la e fornecer informações importantes sobre macro e micromorfologia fúngica. A Figura 1 resume as metodologias coletivas descritas a seguir.

Figura 1: Sumarização esquemática dos métodos apresentados. Coleta de plantas e isolamento, preservação e identificação molecular de fungos por metodologias dependentes e independentes de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Coleta de amostras de plantas

1. Coleta de amostras para métodos dependentes de cultura
   1. Cavar cuidadosamente os órgãos subterrâneos; Estes podem ser raízes, caules, rizomas ou órgãos de armazenamento da planta a ser coletada. Além de solos altamente compactos, colete essas amostras manualmente.
      OBS: O uso de ferramentas como espátulas ou colheres nesta etapa é desaconselhável, pois pode danificar as estruturas frágeis das plantas micoheterotróficas e causar contaminação dos tecidos por fungos não endofíticos.
   2. Colete o maior número possível de órgãos subterrâneos. Mantenha as amostras em sacos de papel dentro de um recipiente refrigerado (por exemplo, caixa de espuma de poliestireno ou saco térmico com gelo). Se os órgãos aéreos também forem coletados, transporte-os separadamente dos subterrâneos.
2. Coleta de amostras para métodos independentes de cultura
   1. Escavar cuidadosamente as raízes da planta a ser coletada sob as mesmas recomendações apontadas na NOTA da etapa 1.1.1.
   2. Colete o maior número possível de órgãos subterrâneos. Manter as amostras coletadas em criotubos dentro de nitrogênio líquido (opção desejável) ou utilizar tubos centrífugos envoltos por gelo seco (opção alternativa). Manter os órgãos aéreos separados, se coletados.

2. Isolamento de fungos endofíticos associados a órgãos vegetais¹⁴

NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min.

1. Desinfestação superficial de órgãos vegetais
   1. Lavar as amostras recolhidas (passo 1.1.2) em água corrente e remover o máximo possível de substrato e outros detritos que as amostras possam ter.
   2. Dentro de uma capela de fluxo laminar, mantenha as amostras lavadas submersas em etanol 70% por 1 min (um copo ou um frasco de vidro podem ser usados).
   3. Transfira as amostras para outro recipiente com hipoclorito de sódio com cloro ativo a 2% por 3 min.
   4. Mude as amostras para um recipiente com etanol 70% e mantenha submersas por 1 min. Em seguida, lave as amostras sequencialmente em dois recipientes com água destilada.
2. Instalação de fragmentos vegetais em meio de cultura
   NOTA: Cada etapa detalhada na etapa 2.2 deve ser conduzida dentro de uma capela de fluxo laminar.
   1. Antes da instalação, prepare placas de Petri (8-10 cm de diâmetro) com 19,5 g/L de meio de cultura de batata-dextrose ágar (PDA) + 7 g/L de ágar bacteriológico + 3 mL/L de antibióticos (por exemplo, estreptomicina, penicilina, tetraciclina, ampicilina).
   2. Manter as placas de Petri com o meio de cultura a 36 °C por 24 h antes de usá-las para garantir que não haja contaminação. Descarte pratos contaminados com colônias de bactérias ou fungos.
      OBS: A adição de antibióticos no meio é essencial nessa etapa, pois os órgãos são altamente infectados por bactérias que podem inibir o crescimento fúngico. Verificar se os antibióticos podem ser aquecidos durante a autoclavagem; alguns antibióticos devem ser adicionados após o resfriamento do meio a cerca de 36 °C (antes de colocá-lo nos pratos).
   3. Imediatamente após a desinfestação superficial das amostras e ainda dentro de uma capela de fluxo laminar, em PDA, inocular algumas gotas da água destilada do último recipiente utilizado para lavar as amostras. Esta etapa é importante para avaliar a eficácia da desinfestação superficial das amostras.
   4. Em uma placa autoclavada vazia, coloque as amostras e use um bisturi flamejado e pinça para seccionar as amostras até uma espessura de cerca de 0,2 cm.
   5. Corte amostras cilíndricas longitudinalmente em duas metades, se desejado para amplificar a superfície em contato com o meio. Para expor melhor as frutas e outros órgãos mais esféricos, pique ou corte bem as estruturas. As sementes também podem ser importantes fontes fúngicas, portanto, certifique-se de que o fruto seccionado as exponha ao meio.
      NOTA: Somente órgãos saudáveis, sem danos teciduais ou sinais de possíveis doenças ou infecções patogênicas, devem ser usados no isolamento de fungos endofíticos.
   6. Distribuir cinco fragmentos dos órgãos subterrâneos nas placas de Petri com BDA + antibiótico. Certifique-se de que os fragmentos estejam o mais longe possível um do outro e também não estejam tocando as bordas do prato. Não organize nenhum fragmento na mídia. Preparar réplicas de cada órgão instalado, como precaução em caso de contaminação.
   7. Sele as placas de Petri com película aderente e guarde-as no escuro a 25-27 °C (de preferência em uma incubadora) por 5 dias.
3. Cálculo da frequência de isolamento (FI)¹¹
   1. Após 5 dias de incubação dos fragmentos de órgãos, calcular o FI, de acordo com o número de fragmentos incubados que apresentam colônias fúngicas crescendo dividido pelo total de fragmentos incubados, conforme representado na seguinte equação:
      
4. Purificação de isolados fúngicos por estriação e subcultivo
   NOTA: Cada passo detalhado na etapa 2.4 deve ser conduzido dentro de uma capela de fluxo laminar.
   1. Preparar placas de Petri (5 cm de diâmetro) com 5-7 g/L de ágar-ágar (AA; somente ágar bacteriológico). Manter os pratos por 24 h a 36 °C para eliminar os possivelmente contaminados.
   2. Identifique cada colônia fúngica cultivada com um código e delimite suas margens no lado inferior do prato (pode ser feito com um marcador permanente). Diferencie as colônias por cor, padrão de crescimento, textura e formato de margem.
   3. Com um palito de madeira autoclavado, usando a ponta fina, recuperar uma pequena quantidade de micélio de uma colônia de fungos. Concentrar-se preferencialmente nas margens da colônia e escolher uma área o mais distante possível de outra colônia, evitando recuperar mais de um tipo de colônia ao mesmo tempo.
   4. Usando o mesmo palito com micélio na ponta, estriar o AA produzindo três estrias (sulcos). Certifique-se de que cada estria esteja a uma distância de 1 cm da outra e das bordas do prato. Escreva o código apropriado (usando papel adesivo e lápis), lacre os pratos e mantenha-os incubados no escuro a 25-27 °C por 3 dias.
   5. Prepare placas de Petri (8 cm de diâmetro) com 39 g/L de PDA. Não é necessário adicionar antibióticos nesta fase.
   6. Após incubar as placas AA, observe-as meticulosamente contra a luz (de uma lâmpada ou de uma janela), com o objetivo de identificar hifas finas formando colônias individuais. Delimitar a área de uma colônia individual por prato, usando um marcador permanente no lado inferior da placa de Petri.
   7. Em uma capela de fluxo laminar, use um palito autoclavado para cortar uma porção do meio que contém a colônia e transferir o volume de corte para o centro de uma nova placa de PDA.
   8. Identifique as placas de Petri com os códigos dos isolados, sele as placas com película aderente e mantenha-as no escuro a 25-27 °C por 7-14 dias.

3. Preservação de isolados fúngicos purificados

NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min.

1. Preservação pelo método de Castellani ou em óleo mineral (3-6 meses)^11,15
   1. Preparar tubos de microcentrífuga de 2 mL com 0,5 mL de água destilada ou contendo 0,5 mL de óleo mineral (dependendo do método escolhido). Certifique-se de que os tubos estejam vazios autoclavados e que a água e o óleo autoclavados sejam adicionados aos tubos dentro de uma capela de fluxo laminar.
   2. Em uma capela de fluxo laminar, colocar as placas de Petri com isolados purificados já cultivados em BDA (39 g/L) por 7-14 dias. Usando um palito autoclavado, corte cuboides pequenos (0,5 cm x 0,5 cm na área superior) de meio contendo as margens do micélio.
   3. Coloque de quatro a seis cuboides nos tubos de microcentrífuga com água destilada (método de Castellani) ou óleo mineral. Conservar os tubos no escuro, a 25 °C pelo tempo que for necessário, observando as limitações de tempo do método.
      NOTA: Evite adicionar muitos cuboides aos tubos e deixá-los cheios, o que pode aumentar as chances de contaminação. É possível manter os tubos refrigerados, o que pode favorecer a preservação de alguns isolados por mais tempo. Currah et ^al.16 recomendam o armazenamento de réplicas de isolados de fungos micorrízicos de orquídeas tropicais refrigerados e a 25 °C, pois podem ser perdidos quando armazenados em câmara fria.
   4. Recupere um cuboide e coloque-o no centro de uma nova placa PDA para cultivar um isolado armazenado.
2. Criopreservação em grãos de arroz descascados (>1 ano)¹⁷
   1. Lave os grãos de arroz descascados em água corrente e cozinhe-os até que a casca de arroz comece a abrir. Distribuir os grãos cozidos em tubos de ensaio de vidro com tampa de rosca e autoclave duas vezes com intervalo de 24 h entre elas.
   2. Em uma capela de fluxo laminar, colocar as placas de Petri com isolados purificados já cultivados em BDA (39 g/L) por 7-14 dias. Com palito autoclavado, recuperar cinco pequenos fragmentos de hifas das margens do micélio e inoculá-los no tubo contendo grãos de arroz autoclavados.
      OBS: A inoculação de hifas em diferentes pontos e profundidades do tubo garante que o isolado colonize os grãos de arroz descascados em menos tempo.
   3. Incubar os tubos no escuro a 25-27 °C durante 14 dias. Agite os tubos, agitando-os a cada 3 dias para manter os grãos individualizados.
   4. Depois de observar o crescimento de fungos nos grãos de arroz, distribua os grãos em uma placa de Petri autoclavada forrada com papel filtro para absorver a umidade, sobre o papel para que os grãos possam secar. Conservar no escuro a 25-27 °C durante 2-3 dias.
   5. Prepare criotubos com 1/3 de sílica gel na parte inferior e 1/3 de lã de vidro acima da sílica. Finalmente, distribua 1/3 dos grãos de arroz com micélio fúngico cultivado. Conservar a -20 °C durante 24 h.
   6. Após 24 h, armazenar os criotubos a -80 °C pelo tempo necessário, observando as limitações de tempo do método.
3. Criopreservação em vermiculita com uso de crioprotetor (>1 ano)¹⁸
   1. Preparar um meio de cultura líquido composto de 0,2% de extrato de levedura e 2% de glicose em água destilada. Ajuste o pH para 5 e autoclave-o.
   2. Distribuir 0,2 g de vermiculita (utilizar granulometria fina) em criotubos com tampa de rosca e autoclavá-los. Adicionar 0,8 mL de meio líquido autoclavado aos criotubos contendo vermiculita.
   3. Em uma capela de fluxo laminar, colocar as placas de Petri com isolados purificados já cultivados em BDA (39 g/L) por 7-14 dias. Com palito autoclavado, recuperar de três a cinco fragmentos de hifas das margens do micélio e inocular ao longo do tubo contendo vermiculita + meio de cultura líquido. Lembre-se de identificar os criotubos com o respectivo código isolado.
      OBS: A inoculação de hifas em diferentes pontos e profundidades do criotubo garante que o isolado colonize a vermiculita em menor tempo.
   4. Armazenar os criotubos no escuro a 25-27 °C até que a colonização da maioria dos grãos de vermiculita possa ser observada, o que geralmente leva em torno de 14 dias.
   5. Preparar uma solução crioprotetora composta de glicerol a 5% e trealose a 5% em água destilada e autoclavá-la. Deixe a solução esfriar antes de usá-la.
   6. Após a vermiculita em criotubos ser colonizada pelo respectivo isolado fúngico, distribuir 0,4 mL de crioprotetor em cada tubo e manter os criotubos refrigerados a 4 °C por 48 h. Em seguida, manter os criotubos a -80 °C pelo tempo necessário, observando as limitações de tempo do método.

4. Caracterização macromorfológica de fungos filamentosos (morfologia de colônias)

1. Manter um registro fotográfico do micélio cultivado em cada placa de Petri com 39 g/L de PCA por 7-14 dias. Lembre-se de registrar os dois lados da colônia, superior e inferior (reverso). Se os pratos vão ser prontamente usados na seção 6 ou não são mantidos, abra os pratos ao fotografá-los para obter fotos melhores.
2. Se interessado em dados quantitativos sobre a morfologia da colônia, a subcultura replica os isolados e os mantém nas mesmas condições de crescimento e por um período constante para registrar o diâmetro da colônia e calcular a taxa de crescimento (geralmente em mm/h).
   NOTA: Resultados quantitativos mais sofisticados podem ser obtidos usando diferentes tipos de meios de cultura para comparação¹⁹ e considerando as ferramentas estatísticas para tratar dados.
3. Observar as colônias sob estereomicroscópio para identificar características morfológicas e fotografar em magnificação. Avaliar as colônias de acordo com suas características macromorfológicas, conforme detalhado na seção de resultados. Consultar diversas fontes bibliográficas para ajudar a categorizar e relacionar a macromorfologia com a identificação molecular e/ou morfológica.

5. Caracterização micromorfológica de fungos filamentosos (morfologia das hifas)

NOTA: As técnicas micromorfológicas são comparadas na seção de discussão, considerando seus possíveis usos e desvantagens.

1. Cultivar os isolados em placas de Petri com 39 g/L de PDA por 7-14 dias. Para avaliar possíveis fungos micorrízicos de orquídeas, cultivar os isolados em ágar 17 g/L de fubá (CMA; ou outro meio limitante de nutrientes) por 3-7 dias¹⁹.
2. Montagem Tease
   1. Trabalhe dentro de uma capela de fluxo laminar. Coloque uma gota de uma mancha escolhida (passo 5.5) sobre uma lâmina de vidro limpa.
   2. Usando um palito autoclavado ou outro material estéril, remova cuidadosamente algumas hifas do isolado crescido e coloque-as na gota de mancha. Coloque uma lamínula (de preferência em um ângulo inicial de 45° para evitar bolhas de ar) e analise sob um microscópio de luz.
3. Suporte para fita adesiva
   NOTA: Esta técnica é geralmente aplicada em culturas fúngicas para ser prontamente utilizada na seção 6 ou não mantida, uma vez que a fita adesiva não pode ser autoclavada, e contaminações podem ocorrer após a execução do método.
   1. Coloque uma gota de uma mancha escolhida (passo 5.5) sobre uma lâmina de vidro limpa. Corte uma tira de fita adesiva transparente em um tamanho que se encaixe bem na lâmina de vidro e a mancha central caia bem.
   2. Direcione a superfície pegajosa da tira para a superfície do micélio. Não pressione e tente coletar algumas hifas sem furar muitas delas.
   3. Cole a fita na lâmina de vidro, garantindo que a mancha esteja em contato com as hifas coletadas. Coloque uma gota de água acima da fita adesiva e coloque uma tampa. Analise a lâmina sob um microscópio de luz.
4. Cultura em lâminas de fungos filamentosos²⁰
   1. Dentro de uma placa de Petri grande (>9 cm de diâmetro, de preferência), coloque: papel filtro na parte inferior, uma haste de vidro em forma de U ou uma adaptação (o objetivo é fornecer uma elevação para a lâmina de vidro), uma lâmina de vidro e duas lamínulas. Placas de Petri mais altas facilitam a manipulação. Autoclave esses kits de placas de Petri, uma para cada isolado.
   2. Preparar um pequeno volume de 39 g/L PDA ou 17 g/L CMA, adicionar 10 g/L de ágar bacteriológico e autoclave (o volume para uma placa de Petri é suficiente para mais de 30 isolados). Os meios de cultura usados na cultura de slides devem ser mais difíceis do que os meios usuais. Autoclave 100 mL de água destilada.
   3. Trabalhe dentro de uma capela de fluxo laminar. Coloque o meio líquido em uma placa de Petri, produzindo uma camada em torno de 0,5 cm de altura. Deixe o meio se solidificar. Uma vez sólido, use um bisturi estéril para cortar quadrados do meio que tenham 1 cm x 1 cm de dimensão.
   4. Abra o kit de placa de Petri dentro de uma capela de fluxo laminar e use pinças flamejadas para organizar o material autoclavado dentro da placa. Disponha o material na ordem numerada, como pode ser visto na Figura 2A, colocando um quadrado do meio de cultura sobre a lâmina de vidro. Antes de colocar a tampa sobre o meio, avance para o passo 5.4.5.
   5. Use um palito autoclavado para recuperar algumas hifas de um isolado e esfregue cuidadosamente as quatro faces laterais do meio colocadas na lâmina de vidro. Coloque uma lamínula autoclavada sobre o quadrado médio usando pinça flamejada.
   6. Use uma ponta de pipeta estéril para colocar água autoclavada no papel de filtro, para criar uma câmara úmida. Use um volume para saturar o papel sem colocar água em excesso. Selar a placa de Petri com película aderente e identificá-la com o respectivo código isolado. Mantenha os pratos no escuro a 25-27 °C por 3-7 dias.
   7. Avaliar o crescimento de hifas na lâmina de vidro e na lamínula. A partir de cada kit de cultura de lâminas são produzidas duas lâminas, uma utilizando a lâmina de vidro com hifas e a lamínula autoclavada, a segunda utilizando a lamínula com hifas e outra com lâmina de vidro.
   8. Após a observação do crescimento das hifas, desprender cuidadosamente o quadrado do meio da lâmina de vidro (Figura 2B), montar as duas lâminas com a coloração escolhida (passo 5.5) e analisar ao microscópio de luz. Lembre-se de identificar o código de isolamento no slide. Para produzir lâminas semipermanentes, sele a lamínula com esmalte transparente.
   9. Para produzir lâminas permanentes, lave cuidadosamente o corante das hifas aderidas após a coloração e deixe a lâmina secar. Montagem com meio de montagem rápida (para detalhes, leia Pena-Passos et ^al.10).
      NOTA: A desvantagem de produzir uma lâmina permanente com esta técnica é que esporos e estruturas não aderidas ao vidro podem ser lavados.
5. Métodos de coloração e observação de hifas
   1. Lactofenol azul de algodão (LPCB)²¹: Adicionar 20 mL de ácido lático, 40 mL de glicerol e 20 mL de água destilada. Dissolva 20 g de cristais de fenol nesta solução aquecendo suavemente. Dissolver 0,05 g de azul de metilo (azul de algodão, ou 2 mL de solução aquosa a 1%). O LPCB também pode ser facilmente adquirido já preparado.
      CUIDADO: O fenol é altamente tóxico e volátil; manipulá-lo exclusivamente dentro de um exaustor e usar luvas.
   2. Azul de toluidina O¹⁰(TBO): Preparar 0,05% TBO em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,8).
   3. Vermelho Congo^22,23,24: Preparar uma solução de 1% de vermelho Congo em água destilada e filtrá-la. Incubar por 5-10 min. Este corante também pode ser aplicado para microscopia de fluorescência²⁵.
   4. Ao observar e fotografar hifas fúngicas ao microscópio de luz, consulte diversas fontes bibliográficas para ajudar a identificar estruturas (confira a discussão).

Figura 2: Procedimentos para cultivo em lâminas de fungos filamentosos . (A) Configuração esquemática de um kit de cultura de lâminas, onde os números indicam a ordem de disposição dos elementos. (B) Descolamento do quadrado do meio de cultura após o crescimento das hifas é observado na lâmina de vidro e na lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Extração total de DNA de isolados fúngicos (protocolo caseiro²⁶ com modificações ²⁷)

NOTA: Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min. Use luvas durante todo o protocolo e realize algumas etapas dentro de uma coifa.

1. Preparar o tampão de extração: dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1%, NaCl 250 mM, Tris-HCl 200 mM (pH 8,0) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 25 mM. Cultivar os isolados purificados em 39 g/L de PCA por 7-14 dias.
2. Raspar cuidadosamente o micélio de um isolado usando uma espátula ou uma colher e transferir os fragmentos para uma argamassa autoclavada, evitando transferir o meio de cultura com o agregado de hifas. Usando um pilão de porcelana, triture o micélio com nitrogênio líquido para um pó fino. Não deixe o micélio ser moído derreter, adicionando nitrogênio para evitar isso.
3. Adicionar 1 ml de tampão de extracção num tubo de microcentrífuga de 2 ml e colocar a amostra moída até à marca de 1,5 ml. Agite suavemente o conteúdo dos tubos para homogeneizar.
4. Agitar os tubos em um vórtice por 5 s e colocá-los em um termobloco a 65 °C por 20 min. Homogeneize cuidadosamente o conteúdo por inversão a cada 7-10 min.
5. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. Transferir 800 μL da fase superior para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL, adicionar 800 μL de fenol aos tubos e misturar o conteúdo por inversão.
   CUIDADO: O fenol é um reagente altamente tóxico e volátil; Pode causar eritema, gangrena e necrose tecidual. Quando inalada, pode causar dispneia e tosse. A absorção sistêmica pode danificar o fígado, os rins e o sistema nervoso central. Manipule o fenol exclusivamente dentro de uma capa de fumaça e use luvas.
   OBS: A partir do próximo passo, use luvas e conduza o protocolo dentro de um exaustor.
6. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 10 min a 4 °C e transferir 800 μL da fase superior para um novo tubo de 2 mL, evitando cuidadosamente a transferência do conteúdo da fase inferior.
7. Adicionar 400 μL de fenol e 400 μL de clorofórmio aos tubos e misturar o conteúdo por inversão. Centrifugar-os a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
   CUIDADO: O clorofórmio é um reagente altamente tóxico e volátil; Pode causar irritação e lesões quando em contato com a pele e, se inalada, afeta o sistema nervoso central e cardiorrespiratório, fígado e rins. Manipule o clorofórmio exclusivamente dentro de um exaustor e use luvas.
8. Recuperar 800 μL ou menos da fase superior para um novo tubo de 2 mL. Adicionar 800 μL de clorofórmio, misturar o conteúdo por inversão e centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   OBS: Nesta etapa, nenhum resíduo da fase inferior deve ser transferido para tubos novos. Assim, tenha cuidado redobrado ao recuperar a fase superior.
9. Transferir 600-800 μL da fase superior para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 450 μL de isopropanol. Misture o conteúdo por inversão e incube a 25 °C durante 5 min.
10. Centrifugar os tubos a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante utilizando uma micropipeta. Tenha cuidado para não descartar o pellet depositado no fundo do tubo.
11. Adicionar 500 μL de etanol 80% e centrifugar por 5 min. Repita duas vezes caso o pellet não esteja clarificado.
12. Retire o etanol usando uma micropipeta e seque o pellet a 37 °C por 30-60 min. Adicionar 30-50 μL de água deionizada, eluíndo o pellet usando uma micropipeta.
13. Manter os tubos a 4 °C durante a noite para a eluição completa do ADN e congelar o conteúdo a -20 °C.

7. Extração total de DNA de órgãos vegetais para metodologia de metabarcoding (kit comercial)

OBS: Para a metodologia a seguir, é necessário adquirir o kit comercial indicado na Tabela de Materiais como kit de extração de DNA do solo. Todos os materiais, soluções e reagentes utilizados nesta secção devem ser estéreis. Aqueles que não puderem ser comprados já esterilizados devem ser autoclavados a 121 °C por 20 min. É altamente recomendável o uso de luvas durante todo o protocolo, e as etapas podem ser conduzidas dentro de uma capela de fluxo laminar. O protocolo descrito é modificado de De Souza et ^al.12, a partir do protocolo detalhado pelo fabricante.

1. Com pilões e argamassas de porcelana, triture as raízes colhidas seguindo a etapa 1.2 em nitrogênio líquido, reduzindo as amostras a um pó fino. Adicionar 0,3 g das amostras moídas aos tubos PowerBead e agitar suavemente para homogeneizar.
2. Adicione 60 μL de solução C1 (incluída no kit) aos tubos PowerBead e misture o conteúdo por inversão. Usando um homogeneizador de tecido e lisador celular (Tabela de Materiais), amarre os tubos firmemente a um suporte adequado, acople o suporte ao vórtice e ligue o equipamento na velocidade máxima por 10-20 min.
   NOTA: Se a solução de C1 for precipitada, aqueça-a a 60 °C até à dissolução completa.
3. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 30 s a 25 °C. Transferir 500 μL do sobrenadante para tubos de microcentrífuga de 2 mL. O conteúdo transferido pode ser particulado.
4. Adicionar 250 μL de solução C2 aos tubos e agitar num vórtice durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 1-2 min a 25 °C.
5. Transferir mais de 600 μL do sobrenadante para novos tubos de 2 mL, evitando o pellet. Adicionar 200 μL da solução C3 e agitar num vórtice durante 5 s.
6. Incubar a 4 °C durante 5 min e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a 25 °C. Nesta etapa, certifique-se de que o sobrenadante não seja particulado.
7. Transfira mais de 750 μL do sobrenadante para novos tubos de 2 mL, evitando o pellet. Homogeneizar bem a solução C4, adicionar 1.100 μL da solução C4 ao sobrenadante e agitar em vórtice por 5 s.
8. Carregar 675 μL do conteúdo dos tubos nas colunas de spin MB, sobre o filtro, e centrifugar a 10.000 x g por 1 min a 25 °C. Descarte o conteúdo líquido.
9. Repita a etapa anterior duas vezes até que todo o conteúdo de cada tubo seja processado. Em seguida, adicionar 500 μL da solução C5 no centro do filtro presente na coluna superior do tubo e centrifugar a 10.000 x g por 30 s a 25 °C.
10. Descarte o conteúdo líquido e centrifugue novamente nas mesmas condições da etapa anterior. Transfira cuidadosamente a coluna superior da coluna de spin MB para novos tubos de microcentrífuga de 2 mL, evitando gotejar qualquer conteúdo líquido na coluna.
11. Adicionar 85-100 μL da solução C6 ao centro do filtro e aguardar 1 min. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s a 25 °C e descartar a coluna de rotação MB. Conservar os tubos a -80 °C.

8. Quantificação de DNA em espectrofotômetro (consulte a Tabela de Materiais)

1. Usando o espectrofotômetro indicado, abra o software. Selecione a opção Ácido nucleico, escolha a opção DNA e defina a concentração como ng/μL.
2. Adicionar 1 μL de água deionizada ao detector do espectrofotômetro e calibrar selecionando a opção Em branco. Após a leitura, limpe suavemente o detector com papel de seda macio.
3. Nomeie a amostra de campo com o código isolado da amostra a ser lida e coloque 1 μL dela no detector do equipamento. Selecione a opção Medir; Um gráfico e uma tabela com os resultados são gerados.
4. Repetir o passo 8.3 até que todas as amostras tenham sido lidas. Recomenda-se salvar a tabela com os resultados gerados para registro e análise: selecione a opção Relatórios e o local onde o arquivo .xml será salvo.
5. Adicione 5 μL de água deionizada ao detector, aguarde alguns minutos e limpe-o suavemente com papel de seda macio.

Resultados

No protocolo de isolamento, considerando que há contaminação da água utilizada na última lavagem e a contaminação também é detectada nas placas de Petri com fragmentos inoculados, diferentes ações podem ser tomadas, dependendo do tipo de contaminante (Tabela 1). Esse procedimento deve ser repetido desde o início no caso de contaminantes fúngicos altamente esporulantes, que também apresentam crescimento acelerado, e bactérias multiplicadoras intensas, resist...

Discussão

A desinfestação superficial de amostras de plantas é uma das etapas mais críticas do protocolo apresentado. Nenhuma contaminação nas placas de PDA com gotas da última lavagem são altamente desejáveis. Bactérias são frequentemente observadas como contaminantes nas placas de isolamento, geralmente mais do que fungos esporulantes transportados pelo ar, considerando que bactérias endofíticas também são comuns nos tecidos vegetais ^3,11. Assim, a adiçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape			(from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A5354	(for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave			(from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A1296	(for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes	Merck	CLS430828	(for samples collection)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red	Supelco	75768	(for hyphae staining)
Cryotubes	Merck	BR114831	(for many steps)
Ethanol	Supelco	100983	It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper	Merck	WHA10010155	(for many steps)
Glass test tubes	Merck	CLS7082516	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool	Supelco	20411	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid	Sigma-Aldrich	252476	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(for hyphae staining)
Laminar flow hood			(class I, from any company, for many steps)
Light microscope			(from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue)	Sigma-Aldrich	M5528	(for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	Merck	HS4323	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL)	Merck	BR780546	(for many steps)
Mineral oil			(for preservation of fungal isolates)
Paper bags			Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037	(for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar	Sigma-Aldrich	Z247464	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle	Sigma-Aldrich	Z247502	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(for many steps)
PowerBead tubes	Qiagen	12888-50	(purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(for fungi slide culture)
Silica gel	Supelco	717185	(for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine)			(commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope			(=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(for installation of plant fragments)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(for hyphae staining)
Trehalose	Sigma-Aldrich	T9531	(for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains			(for cryopreservation)
U-shaped glass rod			(or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite			Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625	(for cryopreservation in vermiculite)