Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Resumen

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Resumen

Los organoides tumorales son modelos tumorales ex vivo tridimensionales (3D) que recapitulan las características biológicas clave de los tejidos tumorales primarios originales. Los organoides tumorales derivados de pacientes se han utilizado en la investigación traslacional del cáncer y se pueden aplicar para evaluar la sensibilidad y la resistencia al tratamiento, las interacciones entre células y las interacciones de las células tumorales con el microambiente tumoral. Los organoides tumorales son sistemas de cultivo complejos que requieren técnicas avanzadas de cultivo celular y medios de cultivo con cócteles específicos de factores de crecimiento y una membrana basal biológica que imita el entorno extracelular. La capacidad de establecer cultivos tumorales primarios depende en gran medida del tejido de origen, la celularidad y las características clínicas del tumor, como el grado tumoral. Además, la recogida de muestras de tejido, la calidad y cantidad del material, así como el correcto biobanco y almacenamiento son elementos cruciales de este procedimiento. Las capacidades técnicas del laboratorio también son factores cruciales a tener en cuenta. Aquí, reportamos un SOP/protocolo validado que es técnica y económicamente factible para el cultivo de organoides tumorales ex vivo a partir de muestras de tejido fresco de origen adenocarcinoma de páncreas, ya sea a partir de tejido fresco de donante de paciente resecado primario o xenoinjertos derivados del paciente (PDX). La técnica descrita en este documento se puede realizar en laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos y ratones y está diseñada para una amplia aplicación en el campo de la oncología traslacional.

Introducción

Los organoides tumorales son cultivos organizados tridimensionales (3D) ex vivo que se derivan de tejido tumoral fresco y proporcionan modelos de cáncer. Los organoides tumorales recapitulan las características biológicas clave del tumor primario original 1,2,3,4 y pueden expandirse hasta varios meses y criopreservarse^, de forma similar a las líneas celulares inmortalizadas convencionales. Los organoides tumorales proporcionan un biobanco de modelos tumorales derivados de pacientes para la medicina traslacional/personalizada⁵ y representan un avance importante en los sistemas/modelos de biología de células cancerosas. Los organoides tumorales derivados del paciente pueden utilizarse como modelos ex vivo para predecir la eficacia de las terapias oncológicas/farmacológicas (neo)adyuvantes, para las cuales se establecen cultivos a partir de tejido tumoral fresco y se realizan ensayos de sensibilidad a los fármacos o farmacotipado específicos para cada paciente con el fin de identificar agentes eficaces para las líneas terapéuticas posteriores ^1,4. Además, los organoides tumorales superan la limitación de la disponibilidad de tejido tumoral primario y, lo que es más importante, proporcionan un excelente sistema alternativo o complementario a los modelos de ratón in vivo, como los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)². La complejidad de los organoides tumorales aumenta si las células tumorales primarias se combinan con células estromales que se encuentran en el microambiente tumoral (TME), como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células endoteliales y las células inmunitarias, que imitan el funcionamiento y la celularidad compleja del tumor primario. Se han establecido organoides tumorales para muchos tipos de tumores utilizando protocolos estandarizados 6,7,8,9,10. La propagación de organoides a partir de diferentes tumores sólidos, incluyendo tejido colorrectal y de cáncer de mama, está bien establecida y es técnicamente asequible 11,12,13,14,15.

Las resecciones quirúrgicas de tumores o biopsias tumorales proporcionan muestras de tejido tumoral primario. Idealmente, las muestras de tejido tumoral deben provenir del centro de la masa tumoral o del borde invasor del tumor, así como del tejido de aspecto normal adyacente al tumor. En comparación con los cultivos 2D convencionales, los organoides tumorales requieren varios "complementos", incluida una membrana basal biológica (como Matrigel, hidrogel o un andamio a base de colágeno), que imita la TME extracelular, y un medio de crecimiento líquido que suministra nutrientes y factores de crecimiento específicos y apoya la proliferación celular y la viabilidad en el cultivo¹⁶.

Los pasos más básicos en el cultivo celular primario son el lavado del tejido en solución salina para evitar la contaminación, el corte/digestión mecánica del tumor en pequeños trozos de 1-3^mm3 y el tratamiento con colagenasa para la digestión enzimática del tejido. A continuación, la mezcla digerida se filtra para eliminar fragmentos de tejido grandes, se resuspende en una membrana basal biológica como Matrigel, y se siembra como cúpulas en placas de cultivo de baja adherencia para mejorar el crecimiento sin adherencia. Los domos de la matriz de la membrana basal se cubren con medio de cultivo líquido y se suplementan con glutamina y antibióticos para evitar la contaminación, así como con factores de crecimiento específicos según el tipo de tejido 7,8,9,16,17. También se pueden aislar otras células relevantes presentes en el tumor a granel y en la EMT, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células inmunitarias. Esta técnica, que ha sido revisada recientemente¹⁸, permite el establecimiento de cocultivos con diferentes tipos celulares para estudiar la respuesta a la terapia en un entorno tumoral más "realista". Además, se pueden estudiar las interacciones célula-célula y la interacción entre las células tumorales y los componentes de la matriz biológica circundante.

La tasa de éxito reportada para el establecimiento de organoides tumorales utilizando tejido fresco de biopsias o tejido tumoral gastrointestinal resecado es de alrededor del 50%¹¹, y la tasa de éxito de este último depende en gran medida del tipo de tejido y el origen⁴, particularmente el grado tumoral y la celularidad general del tumor. Los modelos tumorales tridimensionales tienen una complejidad variable, desde simples agregados unicelulares hasta modelos de ingeniería altamente complejos que constan de varios tipos de células. La terminología utilizada para describir los cultivos 3D en la literatura es muy inconsistente 19,20,21, ya que se utilizan diferentes términos como esferoides, tumoresferas y organoides^, aunque la diferencia entre ellos no está clara. Como aún no se ha llegado a un consenso claro sobre la definición, en este artículo se describe un organoide tumoral como un cultivo organizado de células tumorales incrustado en una membrana basal biológica.

En este artículo, se presenta un protocolo validado para el establecimiento de organoides tumorales a partir de muestras de tejido fresco procedentes de adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) resecado primario fresco o derivado de PDX, y este protocolo se puede realizar en la mayoría de los laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos. Este protocolo ha sido adaptado de varios protocolos reportados de última generación que se utilizan actualmente para establecer organoides tumorales o tumoroides a partir de tejido tumoral digestivo de los grupos de David Tuveson⁹, Hans Clevers⁸ y Aurel Perren⁷.

Este protocolo no analiza cómo se recolecta el tejido fresco. Para obtener tejido tumoral humano fresco de alta calidad, es importante tener una coordinación eficiente entre los cirujanos que extraen el tejido y el departamento de patología que extrae la muestra de tejido para el cultivo de organoides. Del mismo modo, cuando se utiliza PDX como fuente de tejido fresco, también es importante una coordinación eficiente con la persona que recolecta la muestra de tejido. Es fundamental obtener la muestra de tejido lo más rápido posible (dentro de los 30-60 minutos posteriores al momento de la recolección) para mantener una alta calidad.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el bienestar de los animales de experimentación aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) y la Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) y de acuerdo con las directrices de Conducta Ética en el Cuidado y Uso de los Animales recogidas en los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales. desarrollado por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS). El protocolo siguió los principios éticos para la investigación biomédica con el consentimiento informado por escrito. Se obtuvo la aprobación ética previa para el uso de tejido fresco para el establecimiento de los cultivos de organoides tumorales. Las muestras fueron proporcionadas por el Biobanco Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nacional de Biobancos B.0000678), integradas en la Plataforma de Biobancos y Biomodelos del ISCIII (PT20/00045), y procesadas siguiendo procedimientos normalizados de operación con la oportuna aprobación ética. Los tumores se implantaron por vía subcutánea, como se describió anteriormente²², en ratones desnudos hembra NU-Foxn1nu de 6 semanas de edad inmunocomprometidos (ver Tabla de materiales) y se dejaron pasar in vivo para establecer PDAC PDX.

1. Preparación experimental

1. Manipule muestras humanas en una cabina de bioseguridad de clase II.
2. Use una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos durante todo el procedimiento para evitar la infección por patógenos transmitidos por los tejidos.
   NOTA: Se requiere un mínimo de 3 h para procesar la muestra de tejido fresco y colocar la placa en los organoides y fibroblastos.
3. Procesar las muestras de tejido fresco 22 en un plazo máximo de²⁴ h desde la recolección, y almacenar a 4 °C en medio de cultivo de tejidos (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina) hasta su procesamiento.
4. Mantenga todas las muestras y reactivos en el hielo durante todo el procedimiento, y asegúrese de preajustar una centrífuga refrigerada a 4 °C y utilizarla a baja velocidad para evitar dañar la preparación de la célula.
5. Guarde las puntas de pipeta P1.000 y P200 en un congelador a -20 °C para utilizarlas durante el protocolo.
6. Alícuota la matriz de la membrana basal (ver Tabla de Materiales) antes de su uso. Para este protocolo, se recomiendan alícuotas de 250 ml.

2. Procesamiento de tejido tumoral primario fresco para establecer organoides tumorales y fibroblastos primarios

NOTA: Se requiere un mínimo de 3 h para procesar la muestra de tejido fresco (ya sean tumores humanos primarios resecables o PDX) y para colocar placas en los organoides tumorales y fibroblastos. En la Figura 1 se muestra un esquema del proceso de preparación de los organoides, desde la digestión de los tejidos hasta la siembra de los organoides tumorales. Antes de iniciar el protocolo, saque una alícuota de la matriz de la membrana basal del congelador a -20 °C y déjela en hielo durante aproximadamente 30-60 minutos antes de su uso.

1. Coloque una placa de cultivo de 6 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 °C 3 h antes de sembrar los organoides.
2. Mida, fotografíe y lave el tejido (paso 1.3) con 3 ml de Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mix F-12 Ham (F12), suplementado con 5 % de suero fetal bovino (FBS), 15 mM de Hepes, 1 % de L-glutamina, 1 % de penicilina-estreptomicina, 125 ng/ml de anfotericina B, 0,1 mg/ml de normocina) (consulte la Tabla de materiales) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego lave con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
3. Retire el medio por aspiración de la placa de cultivo de tejidos y corte el tejido en trozos de^{1 mm 3} en una placa de cultivo de tejidos estéril utilizando dos cuchillas estériles y 2 ml de medio de digestión (DMEM-F12 avanzado + 10 mg de colagenasa IV/ml, 0,000625 % de tripsina-EDTA y 10 μg/ml de DNasa). Recoger el tejido en un tubo de 50 ml con un total de 5 ml de medios de digestión e incubar durante 1 h a 37 °C con digestión mecánica con equipos disponibles en el mercado (véase la tabla de materiales) o con mezcla periódica de la muestra, pipeteando la muestra hacia arriba y hacia abajo.
4. Agregue 5 ml de DMEM-F12 avanzado para inactivar la tripsina y filtre la muestra a través de un filtro de poros de 70 μm para eliminar los desechos grandes.
5. Agregue 2 ml de DMEM con FBS al 10% en la parte superior del filtro y recoja los desechos y restos de tejido para establecer cultivos de fibroblastos (consulte el paso 5).
6. Centrifugar el filtrado a 200-300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante, dejando solo el gránulo de la célula. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g.
7. Vuelva a suspender el gránulo en 4 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK, consulte la Tabla de materiales). Pasar la mezcla a un tubo de 15 ml e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos para lisar los glóbulos rojos.
   NOTA: Este paso de lisis de glóbulos rojos se puede eliminar cuando no hay evidencia visible de contaminación.
8. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g.
9. Añada 1 ml de reactivo de disociación celular disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales) suplementado con DNasa (1 μg/ml) al gránulo celular e incube durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.
10. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y aspirar el sobrenadante. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y vuelva a suspender el gránulo celular.
11. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 30 veces con una pipeta P1.000 para disociar las células, centrifugar durante 5 minutos a 300 x g y eliminar el sobrenadante.
12. Tome las puntas de pipeta P1.000 y P200 del congelador a -20 °C y vuelva a suspender el gránulo celular en la matriz de membrana utilizando una pipeta P1.000 y puntas frías (50 μL por gota, teniendo en cuenta el volumen del gránulo, de seis a siete cúpulas por pocillo). Saque la placa previamente calentada de la incubadora. Ajuste una pipeta P200 a 48 μL y utilice puntas frías para crear cúpulas de la matriz de la membrana basal en la placa precalentada de 6 pocillos.
13. Coloque la placa con las cúpulas de la matriz de la membrana basal en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 15 minutos para solidificar la matriz de la membrana basal.
14. Añadir 2-2,5 ml de DMEM-F12 avanzado, suplementado con 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/ml de factor de crecimiento de placenta humana (PlGF), 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF), 769 ng/ml de factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) y 10,5 μM de inhibidor de ROCK (DMEM-F12 avanzado + factores de crecimiento) (ver Tabla de materiales).

3. Seguimiento de los organoides

1. Monitoree visualmente el cultivo de organoides tumorales durante los primeros 7 días y luego tres veces por semana a partir de entonces.
2. Cambie el medio dos veces por semana con DMEM-F12 avanzado que contiene 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) recombinante, 100 ng/ml de factor de crecimiento de placenta humana (PlGF), 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF), 769 ng/ml de factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) y 10,5 μM de inhibidor de ROCK (DMEM-F12 avanzado + factores de crecimiento).
3. Capturar imágenes del cultivo de organoides tumorales periódicamente los días 1, 3, 7, 10 y 15 después de procesar la muestra y sembrar el cultivo en la matriz para observar el crecimiento y la viabilidad.

4. Paso y crioalmacenamiento de los organoides

1. Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos.
2. Añadir 1 mL de un reactivo de recuperación celular apropiado (ver Tabla de Materiales) para disociar la matriz de la membrana basal y obtener una suspensión celular, y recuperar el sobrenadante en un tubo de 15 mL. Si la matriz no se disocia inmediatamente, incubar la muestra a 4 °C durante 15-20 min hasta que se disuelva por completo.
3. Añada 1 ml del mismo reactivo de recuperación celular utilizado en el paso 4.2 al pocillo de la placa para recuperar células disociadas adicionales y añada el sobrenadante al mismo tubo de 15 ml que en el paso 4.2.
4. Añadir 5 ml de DMEM-F12 avanzado frío y centrifugar a 200 x g durante 5 min.
5. Retire el sobrenadante y seque el gránulo con cuidado eliminando cualquier resto de líquido con una pipeta de 5 ml; Evite mover el tubo tanto como sea posible. Resuspender el pellet celular en el doble del volumen original de la matriz de la membrana basal para obtener un paso de 1:2.
6. Para el crioalmacenamiento de los cultivos de organoides, resuspender el pellet obtenido en el paso 4.5 en 1 mL de medio de congelación (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10.5 μM inhibidor de ROCK) y almacenar a -80 °C.
   NOTA: El volumen de la matriz de la membrana basal se puede ajustar para realizar diferentes pasos, como 1:1 (usando el mismo volumen de matriz de la membrana basal que el original) o 1:3 (agregando tres veces el volumen original de la matriz de la membrana basal).

5. Establecimiento de fibroblastos

1. Después de recuperar los restos de residuos y tejidos en 2 mL de DMEM con 10% de FBS, añadir esto a una placa de 6 pocillos e incubar a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Eliminar los restos de tejido de los cultivos de fibroblastos del paso 2.5 mediante la aspiración del medio 2 días o 3 días después de la siembra, y reemplazarlos con DMEM fresco con FBS al 10%.
3. Monitorizar visualmente el cultivo de fibroblastos tres veces por semana, y cambiar el medio de cultivo al menos dos veces por semana utilizando DMEM suplementado con FBS al 10%.

Resultados

Es importante documentar cómo progresa el cultivo de organoides tumorales a lo largo del tiempo, especialmente en las primeras semanas, para estimar cómo se comportará el cultivo en los ensayos posteriores. La figura 2 muestra un ejemplo de aislamiento óptimo de células tumorales y establecimiento de organoides tumorales a partir de tejido fresco durante un período de 15 días. A veces, hay un gran volumen de restos celulares en la muestra y es difícil ver los organoides tumorales en ...

Discusión

Los grandes avances en las terapias farmacológicas contra el cáncer son un reto, ya que la probabilidad de aprobación de fármacos en ensayos clínicos oncológicos de fase I es del 5,1%, que es la más baja de todos los tipos de enfermedades²³. La razón principal es que el cáncer es muy heterogéneo y, por lo tanto, las cohortes de pacientes no responden de manera uniforme como se espera al tratamiento dado, lo que pone de manifiesto que se necesita un enfoque más personalizado. Los cultivo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054