イン・ビトロBis-3-クロロピペリジンによるG-四重鎖DNA構造のケミカルマッピング

要約

Bis-3-クロロピペリジン(B-CeP)は、 in vitroでDNAテンプレート中のG-四重鎖構造を同定および特性評価するための有用な化学プローブです。このプロトコルはB-CePsの調査の反作用を行い、高リゾリューションのポリアクリルアミドのゲルの電気泳動によって反作用生成物を解決するプロシージャを詳述する。

要約

G-四重鎖(G4)は、遺伝子発現や疾患において重要な役割を果たす生物学的に関連性のある非標準的なDNA構造であり、重要な治療標的となります。潜在的なG四重鎖形成配列(PQS)内のDNAの in vitro 特性評価には、アクセス可能な方法が必要です。B-CePは、核酸の高次構造を調べるための有用な化学プローブであることが証明されているアルキル化剤の一種です。この論文では、B-CePとグアニンの N7との特異的な反応性を利用した新しいケミカルマッピングアッセイと、それに続くアルキル化Gsでの直接鎖切断について説明します。

すなわち、G4フォールドとアンフォールドDNAの形態を区別するために、B-CeP 1を用いて、G4配列を仮定できる15-merのDNAであるトロンビン結合アプタマー(TBA)をプローブします。B-CeP応答グアニンとB-CeP1の反応により、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により、アルキル化グアニンの個々のアルキル化付加物およびDNA鎖切断の位置を特定することにより、一塩基レベルで分離できる生成物が得られます。B-CePを用いたマッピングは、G-四重鎖形成DNA配列の in vitro 特性評価のためのシンプルで強力なツールであり、G-テトラッドの形成に関与するグアニンの正確な位置を特定することができます。

概要

核酸は、典型的なワトソン・クリック二重らせんに加えて、グアニンに富む配列により、代替のG-四重鎖(G4)型など、さまざまな二次構造を採用することができます。G4構造は、4つのグアニンがフーグステン水素結合を介して相互作用するG-テトラッドと呼ばれる平面四量体の形成に基づいています。G-テトラッドは、グアニンコアの中心に配位した一価の陽イオンによって積み重ねられ、さらに安定化されます(図1)¹。

図1:G-四重構造の模式図 。 (A)G-テトラッドの模式図。平面アレイは、フーグスティーン塩基対形成と中心陽イオン(M⁺)によって安定化されます。

プロトコル

1. 核酸および化学プローブの調製

1. 核酸
   注:「TBA」と名付けられたオリゴヌクレオチドは、15 mer の DNA 配列 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' で、3' 末端に蛍光色素の 5-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識され、ゲル上での可視化を可能にします。非標識オリゴヌクレオチド「cTBA」は、そのDNA相補的配列5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'です。 表1に示すように、TBAおよびcTBAは、3つの異なる構造を得るために採用される。
   1. オートクレーブチップと0.5mLチューブは、滅菌済みの使い捨て製品を入手し、汚染を防ぎます。
   2. 各オリゴヌクレオチドを超純水に可溶化して最終濃度100μMになるようにストック溶液を調製します。 メーカーが提供する260 nmの吸光係数を使用して、紫外可視(UV-Vis)分光光度計で正確なオリゴヌクレオチド濃度を決定します。
      注:消光係数:TBAとcTBAには、それぞれ164,300 M-1 cm-1と138,600 ^{M-1 cm-1}を使用しました。
   3. TBAおよびcTBAストック溶液は-20°Cで保管してください(これらの条件で数ヶ月間)。
2. 化合物B-CeP1
   注:....

結果

図 2 は、3 つの異なる構造に折りたたまれた TBA オリゴヌクレオチドの B-CeP 1 を使用したプロトコルに記載されているように、実施されたケミカルマッピングアッセイの代表的な結果を示しています。TBA(G4-TBA)のG-四重鎖配列は、オリゴヌクレオチドをBPE中でK⁺カチオンの存在下で折りたたむことによって得られたが、同じTBA配列の一本鎖型(ssTBA)はカリウム非存在.......

ディスカッション

G-四重鎖は、通常、グアニンに富むDNA配列内で折りたたまれる核酸二次構造であり、遺伝的制御や疾患との関連から重要な研究対象となっています。B-CePによるケミカルマッピングは、DNA G4の特性評価に有用なプロトコルであり、生理学的塩条件下でのG-テトラッドの形成に関与するグアニン塩基を同定するために使用できます。

このプロトコルで使用される化学プロー?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000