JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Abstract

يعمل التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) كأداة مستخدمة على نطاق واسع لمعالجة جينومات النبات. ومع ذلك ، تظهر A. tumefaciens القدرة على نقل الجينات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع. تفتقر العديد من أنواع الطحالب الدقيقة إلى طرق راسخة لدمج الجينات ذات الأهمية بشكل موثوق في جينومها النووي. لتسخير الفوائد المحتملة للتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة ، تعد أدوات معالجة الجينوم البسيطة والفعالة أمرا بالغ الأهمية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول AMT محسن لأنواع الطحالب الدقيقة الصناعية Chlorella vulgaris ، باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر المراسل (mGFP5) وعلامة مقاومة المضادات الحيوية ل Hygromycin B. يتم اختيار الطفرات من خلال الطلاء على وسائط Tris-Acetate-Phosphate (TAP) التي تحتوي على Hygromycin B و cefotaxime. يتم قياس التعبير عن mGFP5 عن طريق التألق بعد أكثر من عشرة أجيال من الزراعة الفرعية ، مما يشير إلى التحول المستقر لكاسيت T-DNA. يسمح هذا البروتوكول بتوليد موثوق به للعديد من مستعمرات C. vulgaris المعدلة وراثيا في أقل من أسبوعين ، باستخدام ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1302 المتاح تجاريا.

Introduction

تمتلك Agrobacterium tumefaciens، وهي بكتيريا سالبة الجرام تنقلها التربة، قدرة فريدة على نقل الجينات بين المملكة، مما أكسبها لقب "مهندس وراثي طبيعي"1. يمكن لهذه البكتيريا نقل الحمض النووي (T-DNA) من البلازميد الذي يحفز الورم (Ti-Plasmid) إلى الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز من النوع الرابع ، مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي التائي والتعبير عنه داخل جينوم المضيف1،2،3،4. في البيئة الطبيعية ، تؤدي هذه العملية إلى تكوين الورم في النباتات ، والمعروف باسم مرض المرارة التاجية. ومع ذلك ، يمكن ل Agrobacterium أيضا نقل T-DNA إلى كائنات حية أخرى مختلفة ، بما في ذلك الخميرة والفطريات والطحالب وأجنة قنفذ البحر وحتى الخلايا البشرية في ظل ظروف المختبر5،6،7،8.

باستغلال هذا النظام الطبيعي ، يتيح التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) التكامل العشوائي للجين (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للخلية المضيفة عن طريق تعديل منطقة T-DNA في Ti-plasmid. لهذا الغرض ، فإن ناقل التعبير النباتي AMT المستخدم على نطاق واسع هو pCAMBIA13029. يمكن للباحثين استخدام تدفقات عمل استنساخ بسيطة في الإشريكية القولونية قبل نقل المتجه المطلوب إلى A. tumefaciens لنقله لاحقا إلى المضيف محل الاهتمام.

الطحالب الدقيقة الخضراء هي حقيقيات النوى التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع النباتات البرية ولكنها متمردة للغاية على التعديل الوراثي. ومع ذلك ، يلعب التحول الجيني دورا حاسما في كل من البحوث الأساسية والتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة. في العديد من أنواع الطحالب الدقيقة ، وخاصة Chlamydomonas reinhardtii ، نجح التحول الجيني عبر AMT في إدخال جينات محورة مثل إنترلوكين -2 البشري (hIL-2) ، ومجال ربط مستقبلات فيروس كورونا 2 للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2 RBD) ، واثنين من الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) 10،11،12،13. من بين هذه الأنواع ، شلوريلا الشائع ، وهو نوع من الطحالب الخضراء أقل سرعة وأسرع نموا ، يحمل إمكانات كبيرة للإنتاج المستدام للكربوهيدرات والبروتينات والمغذيات والأصباغ وغيرها من المركبات عالية القيمة14. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أدوات موثوقة لإنشاء سلالات معدلة وراثيا من C. vulgaris يعوق تقدمها التجاري. نظرا لوجود عدد محدود فقط من الأعمال المنشورة التي تستخدم AMT في C. vulgaris15 ، وبالنظر إلى الاختلافات الكبيرة بين زراعة النباتات والطحالب الدقيقة ، يصبح تحسين بروتوكول AMT ضروريا.

في هذه الدراسة ، أدخل الباحثون بروتين الفلورسنت الأخضر (mGFP5) في اتجاه مجرى فيروس فسيفساء القرنبيط (CamV) 35S المروج وأضافوا علامة الهستيدين لاستخدامها كجين مراسل للتعبير عن البروتين. تم اختيار المحولات باستخدام Hygromycin B ، وبعد الاستزراع الفرعي لأكثر من عشرين جيلا ، ظل التحول مستقرا. يمكن تكييف بلازميد pCAMBIA1302 المستخدم في هذا العمل بسهولة لاحتواء أي جين مهم. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الطريقة والمواد المقدمة لأنواع الطحالب الخضراء الأخرى باستخدام مروج CamV35S نشط ، حيث يتم استخدام هذا المروج لاختيار Hygromycin.

Protocol

يجب تعقيم جميع الوسائط والحلول قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع أنابيب الطرد المركزي ، وأطراف الماصة ، وما إلى ذلك ، معقمة أو معقمة قبل الاستخدام. لسهولة الرجوع إليها ، يتم سرد وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

1. تحضير خلايا A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية

  1. تلقيح Agrobacterium (AGL-1) في دورق شاكر معقم سعة 25 مل من وسائط LB (مكمل بالريفامبيسين ، 20 مجم / لتر -1) من مخزون الجلسرين المجمد وينمو طوال الليل عند 28-30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: سلالة Agrobacterium AGL-1 (انظر جدول المواد) مقاومة للريفامبيسين والأمبيسلين والكلورامفينيكول والستربتومايسين ويمكن الحصول عليها من العديد من الموردين.
  2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة بمقدار 1،00،000 ضعف عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من الماء النقي للغاية المعقم ونشر 10 ميكرولتر من هذه المزرعة المخففة على طبق LB ، ثم احتضانها عند 28-30 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
  3. اختر مستعمرة وابدأ استزراع 20 مل بين عشية وضحاها في LB مع ريفامبيسين عند 28-30 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 500 مل LB media (بدون مضاد حيوي) في دورق شاكر مع 9 مل من المزرعة الليلية وتنمو عند 28-30 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 0.5.
  5. قسم المزرعة بالتساوي إلى عشرة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل واتركها تبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في كل أنبوب في 50 مل من الماء المثلج.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 25 مل من الماء المثلج في كل أنبوب.
  8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الجلسرين المثلج البارد 10٪ (وزن / حجم) في كل أنبوب.
  9. الجمع بين جميع الأنابيب في أنبوب واحد 50 مل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4 °C و 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من الجلسرين المثلج البارد بنسبة 10٪ (وزن / حجم). يجب أن يكون تركيز الخلية حوالي 1-3 × 1010 خلايا / مل.
  10. قم بتوزيع الخلايا على شكل حصص 50 ميكرولتر في أنابيب دقيقة معقمة مبردة. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في فريزر -80 درجة مئوية.

2. التثقيب الكهربائي ل A. tumefaciens

  1. أضف 50 ميكرولتر من خلايا AGL-1 A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية إلى كوفيت 0.1 مم مبرد مسبقا وأضف 2 ميكرولتر من pCAMBIA1302 أو بلازميد مماثل (conc 15 نانوغرام / ميكرولتر) (انظر جدول المواد).
  2. إلكتروبورات عند 2400 فولت باستخدام مثقاب كهربائي (200 Ω ، موسع السعة 250 μFD ، السعة 25 μFD ، الاضمحلال الأسي ، انظر جدول المواد). يجب أن يكون ثابت الوقت >4.5 مللي ثانية للتثقيب الكهربائي الناجح مع الاضمحلال الأسي.
  3. أضف على الفور 1 مل من وسائط LB إلى الكوفيت وماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. انقل 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل واحتضانه عند 28-30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للتعافي.
  4. ضع الخلايا على أجار LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي المناسب (أي 50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302 للانتقاء بدائي النواة).
  5. احتضان في 28-30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  6. اختر مستعمرة واحدة ، وتنمو بين عشية وضحاها في LB مع الاختيار المناسب (50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302) ، وتحفظ السلالة المحتوية على البلازميد بالتبريد باستخدام 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. AMT من C. الشائع

ملاحظة: قم بإعداد C. vulgaris (UTEX 395 ، انظر جدول المواد) و A. tumefaciens الثقافات بالتوازي للزراعة المشتركة. يجب أن تبدأ ثقافات C. vulgariقبل 3 أيام من إعداد ثقافات A. tumefaciens. تم تعديل البروتوكول بناء على البروتوكول الذي نشره Kumar et al.7.

  1. إعداد ثقافة C. الشائع
    1. يتم تخزين C. vulgaris تقليديا على المنحدرات أو الاحتفاظ بها في ثقافات المرحلة اللوغاريتمية في ظروف مضيئة. من استزراع طور اللوغاريتم عند OD600 = 1.0 ، انشر 0.5 مل على ألواح أجار Tris-Acetate-Phosphate (TAP ، انظر الجدول 1) (1.2٪ وزن / v agar A) وتنمو لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية مع الإضاءة (50 μE / m2s). هذا سوف ينتج ما يقرب من 5 × 106 خلايا.
  2. تحضير ثقافة A. tumefaciens
    1. تنمو سلالة A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 في دورق شاكر عن طريق تلقيح 10 مل من وسائط LB المكملة ب 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 مجم / لتر ريفامبيسين و 50 مجم / لتر كاناميسين (انظر جدول المواد) باستخدام مخزون الجلسرين. احتضان في 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
    2. تلقيح 1 مل من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من LB مع 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 ملغ / لتر ريفامبيسين و 50 ملغ / لتر كاناميسين واحتضانها عند 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 1.0.
  3. Cocultivate C. vulgaris و A. tumefaciens
    1. لتحضير استزراع A. tumefaciens للزراعة المشتركة ، انقل الاستزراع المزروع إلى أنبوب 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة واغسل الخلايا مرتين بوسط الحث.
      ملاحظة: وسائط الحث المستخدمة هي وسائط TAP معدلة على الرقم الهيدروجيني 5.5 وتستكمل بمعادن وفيتامينات متوسطة F/2 مع 200 ميكرومتر أسيتوسيرينجون (AS، انظر جدول المواد). أعد تعليق الخلايا في وسائط الحث بحيث يكون OD600 = 0.5.
    2. لتحضير ثقافة C. vulgaris للزراعة المشتركة ، أضف 25 مل من وسائط الحث إلى لوحة C. vulgaris التي تحتوي على ~ 5 × 106 خلايا. نقل إلى أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة الطافية.
    3. امزج حبيبات الخلايا الطحلبية مع 200 ميكرولتر من المعلق البكتيري (OD600: 0.5) واحتضانها في شاكر دوار عند 21-25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    4. انشر المستنبتة المختلطة (200 ميكرولتر) على ألواح وسائط الحث المكملة بجلوكوز 15 مللي متر واحتضانها عند 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام.
    5. بعد 3 أيام، استخدم 10 مل من وسائط TAP المكملة ب 400 ملغم/لتر سيفوتاكسيم أو 20 ملغ/لتر من التتراسيكلين (انظر جدول المواد) لجمع الطحالب الدقيقة وحضنها في الظلام عند 21-25 درجة مئوية لمدة يومين للقضاء على A. tumefaciens من المستزرع.
    6. صفيحة 500 ميكرولتر من المستنبتة على وسائط انتقائية ، على سبيل المثال ، وسائط TAP مكملة ب 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B (عند استخدام pCAMBIA1302) و 400 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين. احتضان 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين قبل وضعها في غرفة مضيئة.
      ملاحظة: ستظهر المستعمرات المقاومة بعد 5-7 أيام من التعرض للضوء.
    7. اختر مستعمرات مفردة من لوحة التحويل وأعد ربطها على ألواح أجار TAP مكملة ب 400 مجم / لتر من سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين و 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B.

4. مستعمرة PCR (cPCR) لتأكيد التكامل الجيني في محولات C. vulgaris

  1. استخرج الحمض النووي الجينومي من محول C. vulgaris بعد الاستزراع الفرعي مرتين على الأقل من مستعمرة واحدة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي النباتي (انظر جدول المواد). باستخدام هذا كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم الاشعال لمنطقة mgfp5 من T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3 '، و M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. باستخدام مجموعة مزيج بوليميراز الحمض النووي الرئيسي عالي الدقة Q5 (انظر جدول المواد) ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتحقق من تكامل الجينات المحورة.
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورة (98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي والحمض النووي الجيني C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي.
  2. للتأكد من عدم وجود pCAMBIA1302 في العينة بسبب التلوث المتبقي بواسطة A. tumefaciens، استخدم مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
    1. تصميم الاشعال لمنطقة خارج T-DNA على pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' و B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 48 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
  3. للتأكد من عدم وجود تلوث A. tumerfaciens في العينة ، استخدم مستعمرة PCR. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
    1. تصميم الاشعال لجين virE2 الموجود على بلازميد الفوعة AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' و virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 53 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
  4. قم بتشغيل عينات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز الحمض النووي جنبا إلى جنب مع سلم (سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت ، انظر جدول المواد) لتأكيد حجم الأجزاء الناتجة16.

5. قياس مضان المحولات

  1. تلقيح كل محول من مزرعة صيانة في مرحلة السجل أو ميل أجار TAP إلى 50 مل من TAP المكمل ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب بحيث يكون OD600 = 0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م2ثانية من الضوء النشط ضوئيا (انظر جدول المواد).
  2. كل 24 ساعة ، خذ عينة 300 ميكرولتر وقم بقياس الامتصاص والتألق (الإثارة 488 نانومتر ، الانبعاث 526 نانومتر) في قارئ لوحة 96 بئرا أو مطياف الأشعة المرئية والأشعة المرئية ومقياس الفلور (انظر جدول المواد). استخدم صفيحة سوداء ذات قاع شفاف للقياسات المتزامنة.

6. استخراج البروتين الخام ، تنقية البروتين ، والرحلان الكهربائي SDS-PAGE

  1. تلقيح المحول (# 50) من ثقافة صيانة لوغاريتمية المرحلة إلى 300 مل من TAP مكملة ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب للوصول إلى OD680 = 0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م2ثانية من الضوء النشط ضوئيا.
  2. استخرج عينة البروتين الخام من المحول (# 50) والسلالات البرية باستخدام مخزن تحلل 5 مل (انظر الجدول 1) ، متبوعا بصوتنة لمدة 4 دقائق.
  3. تنقية عينة البروتين الخام باستخدام راتنج Ni-NTA من خلال أعمدة البولي بروبلين سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
  4. التجفيد لعينات البروتين المنقى 15 مل وإعادة تعليقها في محلول تحلل 1 مل لتحليل SDS-PAGE17.

النتائج

لإظهار التحول الناجح باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه ، تم استزراع C. vulgaris إما مع AGL-1 الذي يحتوي على بلازميد pCAMBIA1302 أو بدون البلازميد (من النوع البري ومطلي على أجار TAP المكمل ب Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1 أ). تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليسار المستعمرات المحولة القادرة على ا?...

Discussion

ترتبط كفاءة التحول بعدة معايير مختلفة. يعد اختيار سلالات A. tumefaciens المستخدمة في AMT أمرا بالغ الأهمية. AGL-1 هي واحدة من أكثر السلالات الغازية المكتشفة ، ولهذا السبب ، تم استخدامها بشكل روتيني في نبات AMT. يعد استكمال وسائط الحث بالجلوكوز (15-20 مللي مول) مهما أيضا لكفاءة AMT. بالنظر إلى أن C. vulga...

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور بول هويكاس على تفضله بتوفير ناقل pCAMBIA1302 و Agrobacterium tumefaciens AGL1 من معهد علم الأحياء في ليدن ، جامعة ليدن ، هولندا. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا إيفا كوليك على مساعدتها في زراعة محولات الفلورسنت. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وبرنامج Mitacs Accelerate.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift from Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial acetic acidVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES BufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3 VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift from Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch SunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptoneBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
Yeast ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

References

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, e0257089 (2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  17. . . A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. , (2023).
  18. . NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Agrobacterium Tumefaciens AMT mGFP5 Hygromycin B Tris Acetate Phosphate TAP T DNA PCAMBIA1302

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved