Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

Özet

CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar) / Cas9 sistemi, çeşitli organizmalarda hassas ve verimli gen düzenleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Sentromer ile ilişkili protein-E (CENP-E), kinetokor-mikrotübül yakalama, kromozom hizalaması ve mil montaj kontrol noktası için gerekli olan artı uca yönelik bir kinesindir. CENP-E proteinlerinin hücresel fonksiyonları iyi çalışılmış olmasına rağmen, CENP-E proteinlerinin doğrudan fonksiyonlarını geleneksel protokoller kullanarak incelemek zor olmuştur çünkü CENP-E ablasyonu genellikle iğ montaj kontrol noktası aktivasyonuna, hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne yol açar. Bu çalışmada, insan HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E-/- HeLa hücrelerini başarıyla ürettik.

Hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere, CENP-E nakavt hücrelerinin tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını etkili bir şekilde artıran üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Önemli olarak, CENP-E delesyonu, kromozomun yanlış hizalanmasına, BUB1 mitotik kontrol noktası serin / treonin kinaz B (BubR1) proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur. Ayrıca, CENP-E'ye özgü inhibitörler için bir tanımlama yöntemi geliştirmek için CENP-E nakavt HeLa hücre modelini kullandık.

Bu çalışmada, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur. Ayrıca, bu makale, hücre bölünmesinde CENP-E mekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araç olabilecek CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E gen düzenleme protokollerini sunmaktadır. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hattı, antitümör ilaç geliştirme, hücre biyolojisinde hücre bölünme mekanizmaları çalışmaları ve klinik uygulamalar için önemli etkileri olan CENP-E inhibitörlerinin keşfine ve doğrulanmasına katkıda bulunacaktır.

Giriş

Tasarlanmış genom düzenleme, çeşitli hücrelerde ve organizmalarda genlerin hedeflenen modifikasyonlarına aracılık eder. Ökaryotlarda, bölgeye özgü mutajenez, hedef DNA1'in homolog rekombinasyonunu uyaran diziye özgü nükleazların uygulanmasıyla tanıtılabilir. Son yıllarda, çinko parmak nükleazları (ZFN'ler)2,3, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler)4,5 ve güdümlü meganükleazlar 6,7 dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bölgelerde parçalamak için tasarlanmıştır, ancak bu yaklaşımlar karmaşık protein mühendisliği ve gereksiz deneysel prosedürler gerektirir. Çalışmalar, tip II prokaryotik kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas sisteminin, çok çeşitli hücrelerde ve türlerdeRNA kılavuzlu, bölgeye özgü DNA bölünmesine spesifik olarak aracılık eden verimli bir gen düzenleme teknolojisi olduğunu göstermiştir 8,9,10,11. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıp alanlarında devrim yarattı12.

Bakteriler ve çoğu arke, virüsleri ve plazmitleri tanımlamak ve yok etmek için CRISPR ve Cas proteinlerini kullanan RNA tabanlı bir adaptif bağışıklık sistemi geliştirmiştir13. Streptokok pyogenes Cas9 (SpCas9) endonükleaz, CRISPR RNA'ları (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) içeren sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sağlayarak diziye özgü, çift sarmallı kırılmalara (DSB'ler) verimli bir şekilde aracılık edebilen RuvC benzeri Holliday bağlantı resolvazı (RuvC) ve His-Asn-His (HNH) alanını içerir14,15,16. DSB'ler, memeli hücrelerinde insersiyonlar, delesyonlar veya yara izi olmayan tek nükleotid ikameleri dahil olmak üzere çoklu mutasyonları ortaya çıkaran indel oluşturan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu ile onarılabilir 1,8. Hem hataya eğilimli NHEJ hem de yüksek kaliteli HDR yolu, çerçeve kayması mutasyonlarına ve erken durdurma kodonlarına neden olabilen eklemeler veya silmeler yoluyla gen nakavtına aracılık etmek için kullanılabilir10.

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi sırasında kinetokor-mikrotübül bağlanması ve kromozom hizalaması için gereklidir 17,18,19. CENP-E'nin antikor mikroenjeksiyonu20,21, siRNA tükenmesi22,23, kimyasal inhibisyon 24,25,26 ve genetik delesyon 27,28,29, kromozom yanlış hizalanmasına, iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonuna ve mitotik defektlere yol açar, bu da anöploidi ve kromozomal instabilite ile sonuçlanır19,30. Farelerde, CENP-E delesyonu, gelişimin çok erken aşamalarında anormal gelişim ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır 27,29,31. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle kromozomun yanlış hizalanmasına ve hücre ölümüne yol açar 26,27,29, bu da CENP-E proteinlerinin işlevlerini ve mekanizmalarını incelemede bir engeldir.

Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CENP-E proteinlerinin nispeten kısa sürede hızlı bir şekilde parçalanmasını sağlayan bir Auxin ile indüklenebilir CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi32 kullanarak koşullu bir CENP-E nakavt hücre hattı oluşturmuştur33. Bununla birlikte, bugüne kadar, CENP-E biyolojisinde çözülmemiş bir teknik zorluk olan kararlı CENP-E nakavt hücre hatları kurulmamıştır. CENP-E'nin tamamen silinmesinin doğrudan sonuçları karmaşık ve öngörülemez olabileceğinden, genetik sağlamlık34, genetik kompanzasyon yanıtları 35,36,37 ve karmaşık hücre içi ortamlar göz önüne alındığında, kromozom hizalama mekanizmalarının araştırılması için CENP-E nakavt hücre hatlarının oluşturulması önemlidir.

CENP-E inhibitörlerinin keşfi ve uygulamaları kanser tedavisi için önemlidir. Bugüne kadar, GSK923295 ve türevleri24,25, PF-277138,39, imidazo [1,2-a] piridin iskele türevleri40,41, bileşik-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 ve benzo [d] pirolo [2,1-b] tiazol türevleri47 dahil olmak üzere yedi tip CENP-E inhibitörü bulunmuş ve sentezlenmiştir. Bu inhibitörler arasında GSK923295, CENP-E'nin motor alanına bağlanan ve CENP-E mikrotübül ile uyarılan ATPaz aktivitesini 3.2 ila 0.2 nM24,25'lik bir Ki ile inhibe eden allosterik ± etkili bir CENP-E inhibitörüdür. Bununla birlikte, GSK923295'nin kültürlenmiş kanser hücreleri üzerindeki inhibitör etkileri ile karşılaştırıldığında, klinik kanser hastalarında GSK923295 terapötik etkileri ideal değildir48,49, bu da CENP-E için GSK923295 özgüllüğü konusunda endişeleri artırmıştır. Ayrıca, diğer CENP-E inhibitörlerinin CENP-E proteinleri üzerindeki özgüllüğü ve yan etkileri, kanser araştırmalarında kilit konulardır.

Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık. CENP-E gen düzenlemesinin tarama verimliliğini ve başarı oranını artırmak için hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere optimize edilmiş üç fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hatları, CENP-E için aday bileşiklerin özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.

Protokol

1. CRISPR/Cas9 gen nakavt vektörlerinin oluşturulması

  1. İnsan CENP-E genindeki hedef genomik DNA dizisini seçin (GenBank Erişim No. NM_001286734.2) ve çevrimiçi bir CRISPR tasarım aracı (http://crispor.tefor.net/) kullanarak sgRNA'yı tasarlayın.
  2. Tek bir genomik dizi girin, "Homo sapiens-insan-UCSC Aralık 2013 (hg38 analiz seti) + tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler): dbSNP148" genomunu seçin ve "20 bp-NGG-spCas9" protospacer bitişik motifini seçin. Özgüllük skorları50, tahmin edilen verimlilik10 ve minimum hedef dışı değerlere göre sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' ve sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGCTC-3' dahil olmak üzere iki kılavuz dizisi seçin.
  3. Tek sarmallı DNA oligonükleotidlerini (ssODN'ler) sıralayın ve sentezleyin. ssODN'leri ddH2O'da100 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne sgRNA oligolarını fosforile etmek ve tavlamak için 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo, 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz, 1 μL T4 polinükleotid kinaz tamponu ve 6.5 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve tüpü 37 °C'de 30 dakika, 95 °C'de 5 dakika inkübe edin; daha sonra 5 °C dk-1'de 25 °C'ye kadar rampa yapın.
  4. Bbs kısıtlama enzimini kullanarak pX458 plazmitinifigure-protocol-1363 sindirin. 1 μg pX458 plazmid, 2 μL 10x tampon G, 1 μL Bbsfigure-protocol-1509 ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne RNaz içermeyen ddH2O'yu 20 μL'ye ekleyin. Tüpü 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Ardından, üreticinin protokollerine göre kolon DNA jel ekstraksiyon kitini kullanarak doğrusal plazmidi saflaştırın.
  5. sgRNA oligolarını pX458 plazmidine bağlayın (pSpCas9(BB)-2A-yeşil floresan protein (GFP) plazmidi, Addgene ID. 48138). 1 μL tavlanmış oligonükleotid, 25 ng lineer plazmit, 1 μL 10x T4 DNA ligasyon tamponu, 0.5 μL T4 DNA ligaz (350 U/μL) ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde ddH2Oile 10 μL'ye kadar yapın. Ligasyon çözeltisini 16 °C'de 2 saat inkübe edin.
  6. Oluşturulan plazmitin 10 μL'sini yetkin DH5α hücreleri ile buz üzerinde 30 dakika, 42 °C'de 45 saniye ısı şoku ile inkübe edin ve hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 500 μL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve hücreleri ampisilin (100 μg / mL) içeren bir LB plakasına tohumlayın. 37 ° C'de 16 saat inkübe edin ve dirençli klonları eleyin.
  7. Sterilize edilmiş bir pipet ucu ile 5-10 tek koloni seçin ve bunları ampisilinli (100 μg/mL) 1 mL LB ortam kültürüne aktarın. Kültürü 37 °C'de inkübe edin ve 180 rpm'de 12-16 saat çalkalayın.
  8. Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. U6-Fwd primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' kullanarak U6 promotör bölgesinden Sanger dizilimi ile her koloninin plazmit DNA'sını doğrulayın.
  9. Üreticinin protokollerine göre endo-içermeyen plazmid DNA kitini kullanarak plazmitleri ekstrakte edin ve saflaştırın.

2. CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin transfeksiyonu, izolasyonu ve taranması

  1. Dulbecco Modifiye Eagle's Medium'daki (DMEM) kültür HeLa hücreleri, %5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiştir.
  2. HeLa hücrelerini %0.25 tripsin/etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) kullanarak 37 °C'de 2-3 dakika inkübe edin, hücreleri nazikçe pipetleyerek ayırın ve ardından hücreleri hücre geçişi için 1:4 seyreltme oranında yeni plakalara tohumlayın.
  3. Hücreleri 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve transfeksiyondan önce% 60-70 birleşmeye kadar kültürleyin. pX458-sgRNA plazmitlerini, üreticinin protokollerine göre referans verilen reaktifleri kullanarak HeLa hücrelerine aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Tüp A'da 1 μg doğrulanmış pX458-sgRNA plazmidi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını nazikçe karıştırın. Daha sonra, 2 μL transfeksiyon reaktifi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını B tüpünde nazikçe karıştırın.
    2. Hem tüp A'yı hem de tüp B'yi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Karışımı 12 oyuklu bir plakaya ekleyin, hücreleri 6 saat inkübe edin ve ortamı taze bir DMEM ortamı ile değiştirin.
  4. Transfeksiyon verimliliği için bir floresan mikroskobu kullanarak 24 saat veya 48 saat sonra HeLa hücrelerini inceleyin. 48 saat boyunca transfeksiyondan sonra, transfekte edilen HeLa hücrelerini 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin / EDTA kullanarak tamamen ayırın, bir Neubauer odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve hücreleri, seri seyreltme yöntemlerine göre her transfekte edilen popülasyon için üç ayrı 96 oyuklu plakaya yerleştirin10.
  5. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun ve ardından 1-2 hafta daha kültürleyin. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin. CENP-E nakavtının fenotipe dayalı taraması ve doğrulanması için, hücreleri 5-7 gün boyunca 24 oyuklu veya 12 oyuklu plakalarda ayırın ve genişletin.
  6. 10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak daha küçük hücre kolonisi çaplarına sahip mutant hücreleri tarayın.
    NOT: CENP-E mutasyonları genellikle hücre kolonilerindeki bölünen hücrelerin sayısında önemli bir artışa neden olur, bu da CENP-E mutant hücrelerinin taranması için anahtar göstergelerden biri olabilir.
  7. Üreticinin protokollerine göre sütun hayvan genomik DNA ekstraksiyon kitini kullanarak DNA ekstraksiyonu için hücreleri hasat edin. PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0.25 μL Taq polimeraz, 5 μL 10x tampon (Mg2+ plus), 4 μL dNTP karışımları, 500 ng DNA şablonu, 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo ve ddH2O'yu 50 μL'ye ayarlayın. Gen amplifikasyonu için aşağıdaki PCR program ayarlarını kullanın: 98 °C, 10 sn; 33 döngü için 98 °C, 10 sn, 55 °C, 30 sn, 72 °C, 60 sn; 72 °C, 10 dakika ve ardından 4 °C'de tutun.
    NOT: Hedef lokusun klonlanması için spesifik primerler aşağıdaki gibi listelenmiştir: CENP-E hedef F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E hedefi R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E hedefi F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E hedefi R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Hedef DNA'yı üreticinin protokollerine göre pMD18-T vektörüne bağlayın. Bağlanmış plazmiti yetkin DH5α hücrelerine ve klonların seçimi için kültüre aktarın.
  9. CENP-E nakavt türlerini belirlemek için Sanger sıralaması gerçekleştirin. Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. M13 ileri ve geri primerlerini kullanarak her koloninin plazmit DNA'sının Sanger dizilimini gerçekleştirin. M13F astar, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R astar, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Yabani tip ve CENP-E mutant HeLa hücrelerini, sırasıyla 24 oyuklu bir plakada 12 mm'lik cam lameller üzerine tohumlayın. DMEM ortamının tamamını çıkarın ve hücreleri% 4 paraformaldehit / fosfat tamponlu salin (PBS) fiksatif çözeltisinde oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
  11. Çekirdekleri oda sıcaklığında 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ile 5 dakika boyayın. Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0.75 objektif ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kromozom hizalama fenotipine dayalı olarak CENP-E mutant hücrelerini tarayın ve doğrulayın.
  12. CENP-E proteinlerinin immünofloresan boyama ve analizini (bkz. bölüm 3) kullanarak CENP-E nakavt hücrelerini tarayın ve doğrulayın.

3. İmmünofloresan boyama ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi

  1. Hücreleri %4 paraformaldehit/PBS fiksatif solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve 2 x 5 dakika 1x PBS'ye daldırın.
    NOT: Metafaz hücre ayrılmasını önlemek için hücrelerin sağlıklı durumda olduğundan ve hücrelerin nazikçe toplanıp sabitlendiğinden emin olun.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında %0.25 Triton X-100/PBS ile 10 dakika geçirgen hale getirin ve 2 x 5 dakika boyunca 1x PBS'ye daldırın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 BSA/PBST (PBS'de %0.1 Tween 20) ile bloke edin. Primer antikorları %1 BSA/PBST ile seyreltin ve numuneleri 4 °C'de 12 saat inkübe edin.
  4. Birincil antikor çözeltilerini atın, hücreleri 3 x 5 dakika 1x PBS ile durulayın ve hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. İkincil antikorları atın ve hücreleri 1x PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
  6. Çekirdekleri DAPI ile oda sıcaklığında 5 dakika boyayın. Kızakları montaj ortamıyla monte edin. Slaytları oje ile kapatın.
  7. 63x/NA 1.40 objektif ile donatılmış bir taramalı konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntülerini gözlemleyin ve kaydedin.

4. Kromozom hazırlama ve karyotip analizi

  1. Yabani tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini, 24 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam DMEM ortamında kültürleyin ve daha sonra, vahşi tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini 5 saat boyunca 300 nM kolşisin ile inkübe edin.
  2. Hücreleri %0.25 tripsin/EDTA ile 37 °C'de 3 dakika inkübe edin ve hücreleri 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, 1.2 mL 0.075 mol / L KCl çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, ön fiksasyon için 0.2 mL fiksatif çözelti (metanol: buzlu asetik asit = 3: 1) ekleyin ve 1 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
  5. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, peletleri toplayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.5 mL fiksatif çözelti ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanları atın, 0.6 mL fiksatif çözelti ekleyin ve bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Buz kaydıraklarının üzerine 35-40 cm yükseklikten 3-5 damla hücre süspansiyonu ekleyin.
    NOT: Hücre süspansiyonlarını kızaklara bırakmak için yüksekliği 35-40 cm'de tutun; Aksi takdirde, kromozomlar çok dağınık olabilir veya birbirinden ayrılmayabilir.
  7. Slaytları hemen bir alkol lambası ile kurulayın, numuneleri %10 Giemsa boyama solüsyonu ile 7 dakika boyayın, slaytları 2 dakika akan su ile durulayın ve Plan Fluor 40x/NA 0.75 objektif ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanarak numuneleri gözlemleyin.

5. Hücre kolonisi oluşum testi

  1. Hücre süspansiyonlarını 6 oyuklu plakalarda 1.000-2.000 hücre/kuyu hücre yoğunluğunda hazırlayın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
  2. 6 oyuklu plakaları bir CO2 inkübatörüne yerleştirin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 2-3 hafta inkübe edin. Kültür ortamını her 5 günde bir değiştirin. 10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntüleri kaydedin. Koloniler göründüğünde hücreleri hasat edin (bir klon içindeki yüzlerce hücre).
  3. GSK923295 etkilerini incelemek için, hücreleri 6 oyuklu plakalarda 24 saat boyunca kültürleyin ve 10, 25, 50, 100 ve 200 nM'lik son konsantrasyonlarda 2 mL GSK923295 ekleyin.
    NOT: Yeni klonlar oluşturabilecek ve transfekte edilmiş hücrelerin taranmasını etkileyebilecek hücre dökülmesini önlemek için kültür kabını klon oluşumunun erken aşamasında hareket ettirmeyin.
  4. Kültür ortamını atın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 PFA ile sabitleyin. Kolonileri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.1 kristal viyole boyama solüsyonu ile boyayın. Numuneleri 1x PBS ile üç kez durulayın. ImageJ yazılımını kullanarak hücre kolonilerinin görüntülerini kaydedin ve her koloninin çaplarını ölçün. Düz çizgi seçim aracını seçin, Analiz Et'e tıklayın, Ölç'ü seçin ve uzunluğu kaydedin.
  5. Kolonileri 1 mL% 10 asetik asit çözeltisi ile 5 dakika durulayın. 200 μL'lik süpernatan çözeltileri 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve A600 nm'de bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak absorbans değerlerini ölçün.

6. Hücre canlılığı testi

  1. Hücreleri 24 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri 48 saat ila% 80-90 yoğunlukta kültürleyin.
  2. Hücreleri 100 μL% 0.25 tripsin / EDTA ile 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
  3. 400 μL PBS'yi bir pipet tabancası ile hücrelerle karıştırın. 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu plakaya aktarın.
  4. Her bir oyuğa 317 μg/mL nihai konsantrasyona sahip 20 μL MTS çözeltisi ekleyin ve üreticinin protokollerine göre hafifçe karıştırın. Numuneleri bir CO2 inkübatöründe 1-3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak her bir kuyucuğun absorbans değerlerini A490 nm'lik absorbans zirvesinde kaydedin. Hücre kalıntısı ve spesifik olmayan absorbansın katkıda bulunduğu arka planı çıkarmak için A630 nm'lik bir referans dalga boyu kullanın (Hücre canlılığı = A490nm- A630 nm).

Sonuçlar

CENP-E-/- HeLa hücreleri, CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak başarıyla üretildi (Şekil 1). Bu yöntemin zaman çizelgesi ve kritik deneysel adımları Şekil 1'de gösterilmektedir. İlk olarak, CENP-E'ye özgü sgRNA'ları tasarladık ve sentezledik, sgRNA'ları tavladık ve pX458 plazmidine bağladık, plazmiti HeLa hücrelerine transfekte ettik ve 48 saat boyunca kültürledik. Transfekte edilen hücreler ayrıştırıldı ve ...

Tartışmalar

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi 17,19,20 sırasında kromozom hizalamasında ve iğ montaj kontrol noktasında önemli bir düzenleyicidir. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonu, hücre döngüsü durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır 27,29,51,52.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki Hücre İskeleti Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin ve Min-Xia Wu'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin ve Qi Ke'ye destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608 ve 82101678), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Bilim ve Teknoloji İnovasyonu için Ortak Fonlar, Fujian Eyaleti, Çin (hibe numarası 2021Y9160) ve Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1.5 mL centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
24-well plateCorning3524
4S Gelred, 10,000x in waterSangon Biotech (Shanghai)A616697
50 mL centrifuge tubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% ethanolSinopharm Chemical Reagent10009164
96-well plateCorning3599
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent10000218Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0428For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)BeyotimeA0423For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0460For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibodyAbcamab254326For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376392For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibodyAbcamab133583For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibodyAbcamab7291For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerBiotek InstrumentsBiotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)Sinopharm Chemical Reagent69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assayPromegaG3580
CentrifugeEppendorf5424BK745380
ColchicineSinopharm Chemical Reagent61001563
Confocal scanning microscopeLeicaLeica TCS SP8
CoverslipCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α competent cellsSangon Biotech (Shanghai)B528413
DL2000 DNA markerTaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-free plasmid mini kit figure-materials-4202OmegaD6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification KitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Gentian violetSinopharm Chemical Reagent71019944Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solutionSinopharm Chemical Reagent71020260
GraphPad Prism version 8.0 softwareGraphPadwww.graphpad.comStatistical analysis.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
HeLa cell lineATCCCCL-2
Humidified incubatorHeal ForceHF90/HF240
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Image processing and analysis.
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB agar powderSangon Biotech (Shanghai)A507003
Lipo6000 transfection reagentBeyotimeC0526
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Opti-MEM reduced serum mediumGibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solutionHyCloneSV30010
SanPrep column DNA gel extraction kitSangon Biotech (Shanghai)B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kitSangon Biotech (Shanghai)B518191
T4 DNA ligaseTaKaRa2011A
T4 polynucleotide kinaseTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent30189328Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

Referanslar

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 196CENP E NakavtSentromerle li kili Protein EKinesinKinetokor mikrot b l YakalamaKromozom HizalamasMontaj Kontrol NoktasHeLa H creleriFenotip Tabanl TaramaKromozom Yanl HizalamasBUB1 Mitotik Kontrol Noktas Serin treonin Kinaz B BubR1Mitotik Defektler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır