Дегенеративные заболевания глаз, поражающие пигментный эпителиевый слой сетчатки глаза, имеют моногенное и полигенное происхождение. Было разработано несколько моделей заболеваний и программное обеспечение LipidUNet для изучения механизмов заболевания, а также потенциальных терапевтических вмешательств.
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой гексагональных клеток, расположенных в задней части глаза. Он обеспечивает питание и поддержку фоторецепторов и хориоидальных капилляров, выполняет фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов (POS) и секретирует цитокины поляризованным образом для поддержания гомеостаза наружной сетчатки. Дисфункциональный RPE, вызванный мутациями, старением и факторами окружающей среды, приводит к дегенерации других слоев сетчатки и вызывает потерю зрения. Отличительной фенотипической особенностью дегенеративного РПЭ являются внутриклеточные и субклеточные отложения, богатые липидами. Эти отложения являются общим фенотипом при различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Для воспроизведения фенотипа липидного депонирования моногенных дегенераций сетчатки in vitro из фибробластов пациентов был получен индуцированный плюрипотентный RPE, полученный из стволовых клеток (iRPE). Клеточные линии, полученные от пациентов с болезнью Штаргардта и поздней дегенерацией сетчатки (L-ORD), получали POS в течение 7 дней для воспроизведения физиологической функции RPE, которая вызывала патологию, вызванную фагоцитозом POS при этих заболеваниях. Чтобы создать модель возрастной макулярной дегенерации (ВМД), полигенного заболевания, связанного с альтернативной активацией комплемента, iRPE был озадачен альтернативными анафилатоксинами комплемента. Внутриклеточные и субклеточные липидные отложения были охарактеризованы с использованием нильского красного, бор-дипиррометена (BODIPY) и аполипопротеина E (APOE). Для количественной оценки плотности отложений липидов было разработано программное обеспечение на основе машинного обучения LipidUNet. Программное обеспечение было обучено на проекционных изображениях iRPE максимальной интенсивности на культуральных поверхностях. В будущем он будет обучен анализировать трехмерные (3D) изображения и количественно определять объем липидных капель. Программное обеспечение LipidUNet станет ценным ресурсом для поиска лекарств, которые уменьшают накопление липидов в моделях заболеваний.
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой клеток, расположенных в задней части глаза, рядом с фоторецепторами сетчатки. RPE играет жизненно важную роль в поддержании правильного зрения, обеспечивая метаболическую и структурную поддержку фоторецепторов. Здоровые клетки RPE характеризуются отчетливой гексагональной морфологией. Они соединены плотными соединениями, которые позволяют РПЭ действовать как барьер между хориокапилляром, расположенным на его базальной стороне, и фоторецепторами, расположенными апикально. Для поддержания экосистемы сетчатки RPE перемещает ключевые метаболиты, например, глюкозу, к фоторецепторам таким образом, чтобы свести к минимуму потребление глюкозы в RPE1. Из-за этого ограничения RPE зависит от других метаболитов для поддержания своих метаболических потребностей, включая жирные кислоты, которые RPE превращает в кетоны посредством β-окисления2. Учитывая склонность RPE использовать жирные кислоты, которые, вероятно, рециркулируются в результате пищеварения внешнего сегмента фоторецепторов (POS), в качестве источника энергии, пагубные изменения в путях обработки липидов в RPE часто приводят или связаны как с моногенными, так и с полигенными дегенеративными заболеваниями сетчатки3.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное дегенеративное заболевание глаз, вызывающее дегенерацию РПЭ, также связано с аберрантной аутофагией и липидным обменом в монослое РПЭ. Неспособность дисфункционального монослоя RPE обрабатывать POS и выполнять другие критические функции приводит к внеклеточным (суб-RPE) отложениям, называемым базальными линейными отложениями (BLinD), расположенными между RPE и мембраной Бруха - отличительной чертой патологий ВМД. Основные компоненты BLinD включают липопротеины, наиболее распространенным из которых является аполипопротеин E (APOE)4. Накопление тонких слоев BLinD может привести к появлению мягких друз, которые признаются клиническим симптомомВМД 5,6.
Несколько групп показали, что модели заболеваний in vitro, полученные из стволовых клеток, которые вызывают дисфункцию RPE, характеризуются накоплением липидов sub-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) получили индуцированный плюрипотентный RPE, полученный из стволовых клеток (iRPE), у пациентов с высоким риском развития ВМД из-за полиморфизма гена CFH. iRPE показал накопление друз, как отмечено APOE, а RPE с высоким риском накопил большие отложения, чем iRPE, генерируемый у пациентов с низким риском10.
Чтобы создать модель in vitro , которая повторяет клеточные признаки ВМД, такие как липидные капли и отложение друз, линии iRPE, полученные из образцов крови пациентов, были созданы с использованием ранее опубликованного протокола11, ориентированного на развитие. iRPE подвергали комплемент-компетентной сыворотке человека (CC-HS), раствору, содержащему анафилатоксины, которые имитируют одну из возможных причин ВМД: повышенную передачу сигналов альтернативного комплемента8. Результирующее клеточное и субклеточное отложение липидных отложений измеряли с использованием широко используемых липидных и липопротеиновых маркеров, APOE, Nile Red и BODIPY. С помощью этих маркеров было показано, что активированная передача сигналов комплемента через CC-HS усугубляет накопление липидов в клетках iRPE8.
Для разработки модели моногенного дегенеративного заболевания сетчатки были разработаны линии iRPE от пациентов с болезнью Штаргардта, заболеванием, вызванным мутациями гена ABCA4 в RPE. Ранее было показано, что при нокауте ABCA4 внутри RPE12 накапливается липофусцин A2E, внутриклеточное отложение, которое, как известно, содержит высокие уровни фосфолипидов и светозависимых продуктов перекисного окисления липидов. Нокаутирующие линии ABCA4 были разработаны наряду с линиями пациентов, и обе были подвергнуты POS-подаче. Stargardt iRPE продемонстрировал патологию, вызванную фагоцитозом POS, демонстрируя повышенное накопление липидов, количественно определяемое окрашиванием BODIPY. РПЭ, полученный из ИПСК ABCA4 KO, был подвергнут обработке CC-HS; количественная оценка сигнала BODIPY также показала дефект обработки липидов в модели болезни Штаргардта9.
Учитывая распространенность этих заболеваний и потребность в эффективных терапевтических средствах, наряду с соответствующими моделями заболеваний, описанными выше, необходимо разработать надежные методы количественной оценки эффективности потенциальных методов лечения. Для объективной, автоматизированной и стандартизированной количественной оценки липидных отложений было создано программное обеспечение на основе машинного обучения LipidUNet, чтобы в сочетании с инструментами анализа масок можно было быстро и эффективно идентифицировать отложение липидов с использованием общих маркеров Nile Red, BODIPY и APOE. Сводная статистика, полученная с помощью этого аналитического конвейера, затем может быть проанализирована и отображена графически, что позволяет легко сравнивать условия лечения. Схема протокола показана на рисунке 1.
Рисунок 1: Схема протокола: клетки RPE выращивают на 96-луночном планшете и подвергают воздействию активной сыворотки человека или очищенных наружных сегментов крупного рогатого скота для моделирования различных типов дегенерации сетчатки in vitro. Клетки RPE фиксируются и окрашиваются для отложений липопротеинов с помощью Nile Red, BODIPY и APOE. Конфокальный микроскоп используется для получения Z-стеков флуоресцентно меченных липидных частиц, которые впоследствии обрабатываются в 2D-проекции максимальной интенсивности. Алгоритм машинного обучения был обучен распознавать и правильно сегментировать частицы липопротеинов. Генерируются сводные таблицы, содержащие количество частиц и различные метрики формы, которые можно использовать для последующего построения графиков и статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Все шаги протокола соответствуют руководящим принципам, изложенным комитетом по этике исследований человека NIH. Работа со стволовыми клетками и сбор образцов пациентов были одобрены Объединенным институциональным наблюдательным советом по неврологии (CNS IRB) при Управлении по защите исследований человека (OHRP), NIH, в соответствии с руководящими принципами 45 CFR 46 правительства США. Образцы пациентов были собраны с использованием одобренной CNS формы согласия IRB в соответствии с критериями, установленными Хельсинкской декларацией под номером протокола NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).
1. Генерация iRPE
Рисунок 2: Схема дифференциации и созревания iRPE. Для генерации iRPE следовали установленному протоколу дифференцировки, и клеткам давали созревать в течение 5 недель. Полученная клеточная культура действует как модель in vitro , которой можно манипулировать с помощью различных методов лечения, чтобы имитировать дисфункцию RPE при таких заболеваниях, как ВМД и болезнь Штаргардта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные образы успешной и неудачной дифференциации и созревания RPE. Два изображения светлого поля при 10-кратном увеличении TJP1 RPE показаны на 42-й день протокола iRPE. (A) Успешная дифференциация и созревание продемонстрируют слияние RPE с пигментацией и полигональной морфологией. (B) Неудачная дифференцировка и созревание покажет скопления умирающих клеток, как показано здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Подготовка сред для технического обслуживания СИЗОД (СИЗОД-ММ)
3. Посев пластин на 96 лунок
4. Модели заболеваний in vitro
5. Окрашивание для отложений суб-РПЭ
6. Автоматизация и обработка изображений
7. Сегментация и количественная оценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа LipidUNet была обучена на 40-кратных изображениях с 96-луночной пластины. Настоятельно рекомендуется использовать изображения, полученные с помощью 40-кратного объектива.
Рисунок 4: Пользовательский интерфейс LipidUNet. Программное обеспечение LipidUNet имеет различные разделы для выбора для каталога обучающих данных, где изображения липидных отложений были правильно идентифицированы; справочник весов модели, который создается на основе обучающих данных; и каталог данных прогнозирования, в который пользователь будет вводить свои изображения для сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол обеспечивает рабочий процесс для идентификации липидных отложений, окрашенных Nile Red, BODIPY и APOE. Разработанное программное обеспечение может автоматически идентифицировать и количественно определять липидные отложения и лучше всего работает при оптимизации изложенного протокола. Приведены примеры успешно дифференцированного RPE (рис. 3A) и низкодифференцированного RPE (рис. 3B), поскольку качество модели ячеек сильно влияет на качество правильной сегментации изображения.
Два из трех маркеров, описанных в протоколе, Nile Red и BODIPY, идентифицированы как небольшие круглые точки, которые отчетливо ярки на флуоресцентных изображениях (рис. 5 и рис. 6). «Позитивное» изображение из протокола было бы подходящей идентификацией этих отдельных отложений (рис. 5A-D и рис. 5E-H). «Отрицательный» результат покажет неправильную сегментацию изображения, ошибочно приняв фоновую флуоресценцию за отложение, либо из-за слабого окрашивания (рис. 6A-C и рис. 6D-F), либо из-за высокой интенсивности фона (рис. 6G-I).
Месторождения APOE имеют различные размеры и формы, выглядя более овальными или нерегулярными, чем круглые отложения Nile Red и BODIPY. Эти отложения также менее точечные, и интенсивность сигнала может различаться между отложениями из-за различий в пермеабилизации образца. Правильная идентификация позволит идентифицировать каждое месторождение, включая менее насыщенные (рис. 5I-L), в то время как неправильная сегментация не выявит эти отложения (рис. 6J-L). Поэтому важно оптимизировать методы окрашивания и визуализации, чтобы избежать резких изменений. Один из способов сделать это — обратить пристальное внимание на этапы пермеабилизации образца во время иммуноокрашивания. Для оптимизации флуоресцентного сигнала клетки могут быть лизированы перед фиксацией и иммуноокрашиванием для APOE, что приводит к равномерному насыщению и лучшей сегментации отложений APOE.
Представлены также сегментированные изображения клеток, созревших на культуральной платформе, отличной от 96-луночной пластины. Программное обеспечение LipidUNet было запущено на изображениях клеток, культивируемых на трансвелле, и, хотя липидные отложения являются пороговыми, то же самое можно сказать и о порах в трансвелл-мембране (рис. 6M-O). Из-за сходства формы и размера программное обеспечение LipidUNet в его нынешнем виде будет маскировать как липидные отложения, так и прозрачные поры.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты. (A, E, I) 96-хорошо покрытый RPE окрашивается ядерным окрашиванием Хёхста (синий) и нильским красным (пурпурный), BODIPY (зеленый) или APOE (оранжевый) и являются проекциями максимальной интенсивности Z-стека. (Б, Ф, Дж) Входные изображения в оттенках серого для программного обеспечения LipidUNet после обработки изображений. (С,Г,К) Маски, генерируемые LipidUNet, где все отложения идентифицированы правильно. (Д,Ч,Л) Контуры каждой замаскированной частицы пронумерованы. Эти метки позволяют связать каждую частицу на изображении с записью в спреде с необработанными данными. (A-D) показывает окрашивание Nile Red, и программное обеспечение способно точно распознавать отложения на фоне, несмотря на более слабый сигнал. (E-H) показывает сильный контраст между сигналом BODIPY и фоном, что является идеальным. LipidUNet правильно идентифицирует каждое отложение на изображении. (I-L) показывает сильный сигнал APOE и представляет собой вариабельность насыщения сигнала, которая часто наблюдается с этим окрашиванием. Тем не менее, сегментация изображений способна идентифицировать границы каждого месторождения APOE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Неоптимальные результаты. (A, D, G, J, M) 96-хорошо покрытые RPE окрашиваются ядерным окрашиванием Хёхста (синий) и нильским красным (пурпурный), BODIPY (зеленый) или APOE (оранжевый) и являются проекциями максимальной интенсивности Z-стека. (Б, Э, Х, К, Н) Входные изображения в оттенках серого для программного обеспечения LipidUNet после обработки изображений. (С, Ф, И, Л, О) Неправильные маски, сгенерированные LipidUNet. Красные круги указывают, где программное обеспечение неправильно идентифицировало липидное отложение. (А-С) Обработка Nile Red неверна, потому что программное обеспечение определило фоновое окрашивание как отложение. Это может происходить чаще, когда на изображении высокий фон, но мало липидных отложений. Показаны два примера окрашивания BODIPY: некачественное изображение из-за (D-F) слабого окрашивания BODIPY и (G - I) сильный сигнал BODIPY с высоким фоном. В обоих случаях программное обеспечение не может отличить небольшие круглые липидные отложения от фонового кольцевого кольца, окружающего ядро. Хотя окрашивание и визуализация должны быть оптимизированы, чтобы избежать этих ошибок, самая последняя версия LipidUNet в значительной степени улучшена для этих изображений. (Ж-Л) Некорректная сегментация APOE. Поскольку депозиты более изменчивы по размеру и насыщенности сигнала, программное обеспечение испытывает трудности с распознаванием некоторых депозитов. (М-О) РПЭ посеян на трансвелл и окрашен нильским красным цветом. Здесь показан срез Z-стека как с отложениями липидов Nile Red, так и с трансвеллированными порами. Программное обеспечение не может различить их, о чем свидетельствует красный круг, содержащий поперечные поры, и зеленая стрелка, указывающая на отложения Nile Red. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Сравнение инструментов маски. (А, В, В) 96-хорошо покрытые РПЭ с переменным количеством осаждения липидов идентифицируются с красным нильским (красным). Изображения маскируются с использованием трех различных распространенных методов маскировки: Find Maxima, Max Entropy и Renyi Entropy, и сравниваются с маской, сгенерированной LipidUNet. Исходное изображение сопровождается ручным подсчетом липидных отложений, в то время как маски отображают прогнозируемые подсчеты по каждому методу сегментации. Средняя частота ошибок была рассчитана для каждого метода сегментации по следующей формуле: среднее[(|Прогнозируемый подсчет - ручной подсчет|/ручной подсчет) x 100]. Маска, сгенерированная LipidUNet, более точно идентифицирует липидные отложения на изображениях с переменным осаждением по сравнению с другими методами маскирования (средняя частота ошибок: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Компонент | Номер кошки | Биржевой конс. | Заключительный конс. | мл |
МЕМ альфа | 12571-063 | Н.А. | 500 | |
Дополнение N2 | 17502-048 | Н.А. | 1% | 5 |
Инактивированный теплом FBS | Ш30071.03 | Н.А. | 5% | 25 |
НМЭМ, НЕАА | 11140-050 | 10мМ | 0,01 мМ | 5 |
Пируват натрия | 11360-070 | 100 мМ | 1 мМ | 5 |
Пенициллин-стрептомицин | 15140-122 | 10000 ед/мл | 100 Ед / мл | 5 |
Таурин | Т4571 | 50 мг/мл | 250 мкг/мл | 2.5 |
Гидрокортизон | Н6909 | 18,1 мг/л | 20 мкг/л | 0.553 |
Т3 | Т5516 | 20 мкг/л | 0,013 мкг/л | 0.33 |
Общий объем, мл | 548.383 |
Таблица 1: Состав реагентов РПЭ-ММ. Перечень реагентов и оптимальных концентраций для РПЭ-ММ.
Этот протокол обеспечивает метод эффективной маркировки, изображения и количественного определения липидных отложений в моногенных и полигенных моделях заболеваний in vitro для дегенеративных заболеваний глаз. Программное обеспечение на основе искусственного интеллекта LipidUNet может быть применено к трем распространенным липидным маркерам, APOE, Nile Red и BODIPY, и обеспечивает быстрый автоматический метод анализа, который позволяет количественной оценке быть стандартной и объективной.
Основным ограничением LipidUNet является тот факт, что набор обучающих данных для ИИ был ограничен изображениями клеток с 40-кратным увеличением, культивируемых в 96-луночном планшете. В результате набора обучающих изображений LipidUNet в его нынешнем виде ограничен анализом изображений с 40-кратным увеличением. Программное обеспечение может быть использовано для анализа 40-кратных изображений клеток, культивируемых на других культуральных поверхностях, помимо 96-луночной пластины, но следует позаботиться о проверке сгенерированных выходных масок для проверки точного порогового значения программным обеспечением. Потребуется больше наборов изображений (с разным увеличением), чтобы расширить область применения образцов/изображений, которые он может анализировать.
Протокол состоит из нескольких важных этапов. На этапе липидного маркера пользователь должен подтвердить, что выбранное им маркировочное соединение (BODIPY, APOE, Nile Red) эффективно маркировало его образец. Зрелые клетки RPE часто сильно пигментированы, что может ухудшить флуоресцентный сигнал иммуноокрашивания антителами. Когда сигнал флуоресценции слабый или когда слишком много фонового окрашивания, LipidUNet не может точно различать липидные капли. По той же причине необходимо использовать правильно выбранные параметры сбора данных для этапа автоматической визуализации протокола. Если полученные изображения имеют низкое качество, LipidUNet будет изо всех сил пытаться правильно маскировать изображения, и, следовательно, количественная оценка будет неточной (рис. 6A-L). Наконец, постобработка изображений является важным шагом, поскольку LipidUNet предъявляет особые требования к программному обеспечению для работы.
По сравнению с рабочими процессами для анализа липидов, в которых используется ручная пороговая оценка, или методами, включающими автоматическое пороговое значение в программном обеспечении, таком как Fiji, LipidUNet предлагает непредвзятую и надежную сегментацию по изображениям с переменным отложением липидов, что отражается в небольшой частоте ошибок при идентификации липидных частиц (рис. 7). Программное обеспечение позволяет пользователю вводить дополнительные обучающие изображения, что позволяет анализировать наборы изображений, выходящие за рамки тех, которые используют объектив 40-кратного увеличения, или даже тех, которые используют другой липидный маркер, как указано в протоколе. В будущем программное обеспечение будет обучено анализировать 3D-изображения, чтобы можно было количественно оценить объем липидных отложений. Дегенеративные заболевания глаз, которые связаны с отложением липидов в качестве основного фактора патологии, широко распространены, и, по прогнозам, случаи будут увеличиваться по мере увеличения пожилого населения13. Точные модели заболеваний и эффективные инструменты анализа, как мы изложили в этом протоколе, позволят разработать новые терапевтические вмешательства.
Мы благодарим гистологическое ядро Национального института глаз (NEI) за использование конфокальной системы Zeiss. Эта работа была поддержана фондами NEI IRP (номер гранта ZIA EY000533-04).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved