Aufbereitung von harten Palmsamen für die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielte darauf ab, detaillierte Leitlinien für die Vorbereitung von harten Saatgutprobenschnitten mit niedrigem Wassergehalt für die MALDI-IMS-Analyse zu beschreiben, die ursprüngliche Verteilung und Häufigkeit der Analyten beizubehalten und eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung bereitzustellen.

Zusammenfassung

Die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) wird angewendet, um Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung zu identifizieren. Derzeit wird MALDI-IMS häufig in der klinischen Analyse eingesetzt. Dennoch gibt es eine hervorragende Perspektive, um diese Technik besser anzuwenden, um die physiologischen Informationen chemischer Verbindungen in Pflanzengeweben zu verstehen. Die Vorbereitung kann jedoch für bestimmte Proben aus botanischen Materialien eine Herausforderung darstellen, da MALDI-IMS dünne Scheiben (12-20 μm) für eine angemessene Datenerfassung und erfolgreiche Analyse benötigt. In diesem Sinne haben wir zuvor ein Probenvorbereitungsprotokoll entwickelt, um dünne Schnitte von harten Samen von Euterpe oleracea (Açaí-Palme) zu erhalten, die ihre molekulare Kartierung durch MALDI-IMS ermöglichen.

Hier zeigen wir, dass das entwickelte Protokoll für die Herstellung anderer Samen derselben Gattung geeignet ist. Kurz gesagt, das Protokoll basierte darauf, die Samen 24 Stunden lang in deionisiertes Wasser zu tauchen, Proben mit Gelatine einzubetten und sie in einem akklimatisierten Kryostaten zu schneiden. Für die Matrixabscheidung wurde dann eine xy-Bewegungsplattform mit einem Elektrospray-Ionisationsnadelspray (ESI) unter Verwendung einer 1:1 (v/v) 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und einer Methanollösung mit 0,1% Trifluoressigsäure bei 30 mg/ml gekoppelt. Die Samendaten von E. precatoria und E. edulis wurden mit Hilfe von Software verarbeitet, um ihre Metabolitenmuster abzubilden.

Hexose-Oligomere wurden in Probenscheiben kartiert, um die Angemessenheit des Protokolls für diese Proben zu beweisen, da bekannt ist, dass diese Samen große Mengen an Mannan, einem Polymer der Hexose-Mannose, enthalten. Als Ergebnis wurden Peaks von Hexose-Oligomeren, dargestellt durch [M + K]⁺ Addukte von (Δ = 162 Da), identifiziert. So ermöglichte das zuvor speziell für E. oleracea-Samen entwickelte Probenvorbereitungsprotokoll auch die MALDI-IMS-Analyse von zwei weiteren harten Palmsamen. Kurz gesagt, die Methode könnte ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Morphoanatomie und Physiologie botanischer Materialien sein, insbesondere aus schnittfesten Proben.

Einleitung

Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) ist eine leistungsfähige Methode, die eine zweidimensionale Zuordnung von Biomolekülen ermöglicht, eine ungezielte Untersuchung ionisierbarer Verbindungen ermöglicht und deren räumliche Verteilung, insbesondere in biologischen Proben, bestimmt ^1,2. Seit zwei Jahrzehnten ermöglicht diese Technik den gleichzeitigen Nachweis und die Identifizierung von Lipiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen, anderen Metaboliten und synthetischen Molekülen wie therapeutischen Medikamenten ^3,4. MALDI-IMS erleichtert die chemische Analyse in einer Gewebeprobenoberfläche ohne Extraktions-, Reinigungs-, Trenn-, Markierungs- oder Färbemittel biologischer Proben. Für eine erfolgreiche Analyse ist jedoch die Probenvorbereitung ein entscheidender Schritt in dieser Technik, insbesondere in Pflanzengeweben, die aufgrund der Umweltakklimatisierung spezialisiert und zu weit verbreiteten komplexen Organen modifiziert werden⁵.

Aufgrund der inhärenten physikalisch-chemischen Eigenschaften des Pflanzengewebes besteht die Notwendigkeit eines angepassten Protokolls, das den Anforderungen der MALDI-IMS-Analyse entspricht und die ursprüngliche Form des Gewebes während der Schnittvorbereitung bewahrt ^6,7. Bei unkonventionellen Proben, wie z. B. Samen, sind etablierte Protokolle⁸ nicht anwendbar, da diese Gewebe starre Zellwände und einen geringen Wassergehalt aufweisen, was leicht zu einer Fragmentierung des Schnitts und zu einer Delokalisierung von Verbindungen^{führen kann 9}.

Unsere Forschungsgruppe hat experimentelle Daten zur molekularen Kartierung und ein angepasstes Protokoll für die MALDI-IMS-Analyse von Açaí-Samen (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12 veröffentlicht, bei denen es sich um ein Nebenprodukt handelt, das bei der Herstellung des rentablen Açaí-Zellstoffs ¹³ in großen Mengen anfällt. Die Idee war, ein Protokoll für die In-situ-Kartierung verschiedener Metaboliten in Açaí-Saatgut zu entwickeln, um mögliche Verwendungsmöglichkeiten für diese landwirtschaftlichen Abfälle vorzuschlagen, die derzeit nicht kommerziell erforscht werden. Aufgrund der Resistenz des Açaí-Saatguts war es jedoch notwendig, ein maßgeschneidertes Protokoll zu erstellen, um eine ordnungsgemäße Probentrennung aus der MALDI-IMS-Analyse zu erhalten.

In diesem Zusammenhang hat das wirtschaftlich wichtige Açaí-Fruchtfleisch die zunehmende Vermarktung anderer Früchte der Gattung Euterpe mit ähnlichen sensorischen Eigenschaften motiviert. Die beiden aufstrebenden Palmenfrüchte, die in industriellem Maßstab als Alternative zu açaí^14,15 angebaut wurden, sind E. precatoria (bekannt als açaí-do-amazonas), die im Amazonas-Trockengebiet wächst, und E. edulis (bekannt als juçara), die typisch für den Atlantischen Regenwald ist. Dennoch führt der Verzehr von Açaí-do-Amazonas und Juçara zur gleichen Anhäufung von resistentem und ungenießbarem Saatgut, das nicht genutzt wird und bisher nicht hinsichtlich seiner detaillierten chemischen Zusammensetzung untersucht wurde.

So zeigen wir hier, dass das zuvor entwickelte Protokoll mit wenigen Anpassungen verwendet werden kann, um E . precatoria - und E. edulis-Samen für die molekulare Kartierung durch MALDI-IMS zu analysieren, was sich als leistungsfähiges Werkzeug erweist, das zur Analyse der Zusammensetzung dieser Ressourcen verwendet werden kann und helfen kann, ihre potenziellen biotechnologischen Anwendungen zu bestimmen. Darüber hinaus kann die hier bereitgestellte detaillierte Beschreibung anderen mit ähnlichen Schwierigkeiten bei der Vorbereitung widerstandsfähiger Materialien für die MALDI-IMS-Analyse helfen.

Protokoll

Die Samen der Euterpe precatoria wurden freundlicherweise vom Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasilien) gespendet, und die Samen von Euterpe edulis wurden freundlicherweise vom Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasilien) nach dem industriellen Entpulpungsprozess gespendet. Die Samen wurden in verschlossenen Plastikboxen bei Raumtemperatur aufbewahrt.

1. Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektroskopie (MALDI-IMS)

1. Protokoll der Saatgutsektion
   1. Lassen Sie drei Samen jeder Art 24 Stunden lang in deionisiertem Wasser ruhen.
   2. Schalten Sie am nächsten Tag den Kryostaten (siehe Materialtabelle) ein und lassen Sie ihn -20 °C erreichen.
   3. Nehmen Sie die nassen Samen aus dem Wasser. Schneiden Sie die Samen mit einer Mikrotomklinge in zwei Hälften (siehe Materialtabelle).
   4. Bereiten Sie eine frische, warme (10%) Gelatinelösung vor (siehe Materialtabelle).
   5. Legen Sie die Hälfte des Samens auf eine Form und füllen Sie sie mit frisch hergestellter Gelatine. Bei -80 °C 2 h einfrieren, bevor Sie in den Kryostaten gebracht werden.
   6. Befestigen Sie das eingebettete Saatgut mit einer optimalen Schnitttemperaturmasse (OCT, siehe Materialtabelle) auf dem Kryostatenträger und lassen Sie es 10 Minuten lang im Kryostaten zur OCT-Aushärtung.
   7. Fügen Sie einem mit Indiumzinnoxid beschichteten Glasobjektträger (ITO-Objektträger; siehe Materialtabelle) doppelseitiges Kupferklebeband (siehe Materialtabelle) hinzu.
   8. Von jeder Art werden 20 μm dicke Schnitte hergestellt und auf das doppelseitige Kupferklebeband gelegt, das auf dem ITO-Objektträger haftet.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die auf den Objektträgern gesammelten Scheiben in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden; Alternativ können Sie mit der Matrixabscheidung fortfahren. Die Objektträger müssen in eine Halterungsträgerbox gelegt, mit gasförmigem N₂ gespült und mit Folie versiegelt werden, um eine Oxidation der Probe zu verhindern (siehe Materialtabelle).
2. Matrix-Abscheidung
   1. Legen Sie den Objektträger mit den Scheiben in einen Vakuum-Exsikkator, bis er Raumtemperatur erreicht.
   2. Machen Sie Lehrmarkierungen mit einem Korrekturstift in jeder Folienecke. Scannen Sie das Objektträger mit einem Tischscanner. Auf die Auflösung von 4.800 ppi eingestellt.
   3. Verwenden Sie eine Analysenwaage, um 30 mg 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB; siehe Materialtabelle) zu wiegen und 1 ml 1:1 Methanol herzustellen: 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA; Tabelle der Materialien) Lösung zur Auflösung des DHB.
   4. Füllen Sie eine 1-ml-Glasspritze (siehe Materialtabelle) mit DHB-Lösung und geben Sie sie in eine Spritzenpumpe (siehe Materialtabelle), die auf eine Durchflussrate von 0,8 ml/h eingestellt ist.
   5. Verbinden Sie die Spritze mit einem PEEK-Schlauch mit einer APCI-Nadel (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) (siehe Materialtabelle).
   6. Schließen Sie N₂ an die APCI-Nadel an und stellen Sie sie auf eine Durchflussrate von 12,5 psi ein.
   7. Befestigen Sie die APCI-Nadel an der xy-Bewegungsplattform (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass sich die Spitze der APCI-Nadel 4 cm über dem Objektträger befindet.
   8. Stellen Sie mit der Zeichensoftware (siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung 1) die xy-Bewegungsplattform so ein, dass sie der Schablone folgt. Die Schablone besteht aus horizontalen parallelen Linien im Abstand von 1 mm.
   9. Um eine Matrixabscheidung zu erreichen, warten Sie, bis die xy-Bewegungsplattform die Schablone 20 Mal wiederholt hat.
      ACHTUNG: Die Matrixabscheidung muss in einem chemischen Abzug erfolgen.
3. Aufnahme von Bildern
   1. Legen Sie den Objektträger in das Massenspektrometer (siehe Materialtabelle).
   2. Verwenden Sie Korrekturstiftmarkierungen, um Lehrpunkte in der referenzierten Software festzulegen (siehe Materialtabelle).
   3. Stellen Sie die Laserleistung (60 %), den Laserfokus (mittel), die Anzahl der Aufnahmen (100) und die Polarität in der Software ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Datenreduktionsfaktor von 99 % ein und speichern Sie die FID-Datei für die spätere Datenkalibrierung. Speichern Sie die Methode.
   4. Begrenzen Sie den zu analysierenden Bereich mit dem Werkzeug Polygon-Messbereich hinzufügen aus der Massenspektrometer-Software. Bearbeiten Sie die Messbereichsparameter mit Angabe der im vorherigen Schritt gespeicherten Methode und der Rasterbreite auf 100 μm (Ergänzende Abbildung S4A).
   5. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme.
4. Datenanalyse
   1. Verwenden Sie Matrixcluster und bekannte Verunreinigungen, um eine Massenliste in der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) auf der Registerkarte Kalibrierung (Ergänzende Abbildung S4B) zu erstellen.
      1. Öffnen Sie die zu kalibrierenden Daten in der referenzierten Software (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die erstellte Massenliste und öffnen Sie ein Dialogfenster durch Rechtsklick und wählen Sie die Option Sperrmassen einstellen (Ergänzungsbild S4C).
      2. Wählen Sie den Gaußschen Fenstermodus mit 0,5 Gaußscher Verbreiterung und 3,5 Strichverbreiterung. Lassen Sie die Online-Kalibrierung deaktiviert. Wählen Sie den Modus (einzeln), den Schwellenwert (1.000) und die Massentoleranz (5 ppm). Kalibrieren Sie die Daten mit dem Prozess und speichern Sie das 2D-Datenwerkzeug (Ergänzungsbild S4C).
   2. Exportieren Sie die Daten nach der Kalibrierung in SCiLS lab oder eine andere kompatible Software und stellen Sie den gewünschten m/ z-Wert-Schwellenwert ein (gewählter Bereich: 150 bis 2.500).
      HINWEIS: Je nach Dateigröße oder den Eigenschaften des Computers kann dies einige Zeit dauern.
   3. Wählen Sie eine Normalisierungsmethode zwischen der Gesamtionenzahl (TIC) oder dem mittleren Quadrat (RMS).
      HINWEIS: Für diese Analyse wurde TIC ausgewählt.
   4. Wenn die zu kartierenden Analyten bekannt sind, zeichnen Sie jeden m/z-Wert für jeden Analyten und speichern Sie die generierten Bilder und das Spektralmitteldiagramm.
      HINWEIS: In dieser Arbeit wurden m/z-Werte von Hexose-Oligomeren unter Berücksichtigung des Kaliumaddukts ausgewählt.

2. Energiedispersive Spektroskopie (EDS)

1. Protokoll der Saatgutsektion
   1. Erwerben Sie eine dünne Saatgutscheibe in einer Trennsägemaschine (siehe Materialtabelle).
   2. Schneiden Sie die Samen mit den folgenden Parametern: Schnittgeschwindigkeit von 500 U/min, 100 N Lastladung und 15 HC-Diamant-Wafering-Klinge (siehe Materialtabelle).
      Anmerkungen: Führen Sie die manuelle Entfernung von Fasern aus den Samen aufgrund der erforderlichen Haftung am Halt in den am Goniometer angebrachten Präzisionsschraubstöcken durch. Reinigen Sie die Klinge vor dem Gebrauch und schneiden Sie einen Teil des Samens ab, um zu verhindern, dass während der Analyse unerwünschte Mineralien hinzugefügt werden.
   3. Reinigen Sie die Proben mit Druckluft, um alle Partikelrückstände aus dem Schnitt zu entfernen (siehe Materialtabelle).
   4. Befestigen Sie einen Saatgutabschnitt mit doppelseitigem leitfähigem Carbonband (siehe Materialtabelle) in der Halterung.
2. Analyse-Bedingungen
   1. Befestigen Sie den Träger mit einem Seed-Abschnitt in der Vakuumkammer eines Rasterelektronenmikroskops (REM), das mit EDS gekoppelt ist (siehe Materialtabelle).
   2. Elektronenmikroskopische Aufnahmen an einem Modellmikroskop mit 20 kV Beschleunigung und einer Punktgröße von 4,0 unter Verwendung von Sekundärelektronensignalen (siehe Materialtabelle), rückgestreuten Elektronen (Festkörperdetektor auf dem Polstück) und Mischungen dieser beiden Signaltypen (MIX) aufnehmen, um künstlich gefärbte Bilder zu erstellen.
   3. Verwenden Sie für die Aufnahme von EDS-Spektren ein Spektrometer (siehe Materialtabelle), das mit dem oben genannten REM gekoppelt ist. Die Bedingungskonfiguration der Bildaufnahme von EDS ist die gleiche wie beim REM.
   4. Legen Sie Neigungsgrad, Höhe und Azimut auf 0,0, 35,0 bzw. 0,0 fest.
3. Datenerfassung
   1. Stellen Sie drei verschiedene Bereiche mit 91-facher Vergrößerung des Saatgutabschnitts ein, um Daten zu erfassen.
   2. Identifizieren Sie die Spitzen im Spektrum nach Beendigung der Erfassung oder während der Erfassung. Verwenden Sie die Schrittschaltfläche Elemente bestätigen , um die Peaks manuell zu identifizieren.
   3. Stellen Sie die Aufnahmezeit für jeden ausgewählten Bereich auf 60 s ein. Stellen Sie die Prozesszeit auf fünf ein. Die Parameter stehen für eine Prozesszeit von ein bis sechs zur Verfügung.
      HINWEIS: Die Vorzeichen der Elemente sind konstant und summieren sich, während die Geräusche zufällig und schädlich sind. Je länger die Verarbeitungszeit, desto geringer das Geräusch.
   4. Die Standardeinstellungen für die Anzeige signifikanter quantitativer Ergebnisse liegen über zwei Sigmas (Standardabweichung). Setzen Sie zwei Sigmas auf Null, um unerwünschte Ergebnisse zu reduzieren.
   5. Normalisieren Sie jede Intensität der Elemente; Dies ist ein standardisierter Parameter in der Software (siehe Materialtabelle).
   6. Um die Daten zu analysieren, exportieren Sie sie in eine DOC-Datei.
4. Datenanalyse
   1. Stellen Sie die genaue Messung von Spitzenintensitäten für die quantitative Elementaranalyse sicher.
   2. Überlappende Peaks erfordern eine Dekonvolution für eine bessere Peaktrennung; Ziehen Sie bei Bedarf einen verrauschten Hintergrund ab.
   3. Wenn es keine Überlappung gibt, erhöhen Sie die Verstärkung, um die Signale zu verstärken und die Spektrumsqualität zu verbessern.

Ergebnisse

Das entwickelte Protokoll ermöglichte die MALDI-IMS-Analyse von E . precatoria - und E. edulis-Samen . Als Ergebnis konnten wir das Molekulargewicht und den Polymerisationsgrad (DP) von Kohlenhydraten als partielle Strukturaufklärung bestätigen. Die molekularen Informationen, die durch die MALDI-IMS-Analyse (Abbildung 1 und Abbildung 2) geliefert wurden, zeigten Peaks, die [M+K]⁺ Addukte von Hexose-Oligomeren (Δ ...

Diskussion

Pflanzen bestehen aus spezialisierten Geweben für bestimmte biochemische Funktionen. Daher muss das Probenvorbereitungsprotokoll für MALDI-IMS entsprechend verschiedenen Pflanzengeweben mit spezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften entworfen werden, da die Proben ihre ursprüngliche Analytverteilung und -häufigkeit für eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung beibehalten müssen⁸.

Vor der MALDI-IMS-Analyse geht es in erster Linie darum,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK