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요약

우리는 유전자 조작 쥐의 신경계 신생물이 인간 쥐의 병리를 정확하게 재현하는지 여부를 평가하는 방법론을 개발했습니다. 여기서는 이러한 조직학적 기술, 정의된 병리학적 기준 및 배양 방법론을 P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 발생하는 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양에 적용합니다.

초록

상염색체 우성 종양 감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1) 환자는 일반적으로 망상신경섬유종(PN)이 발생하며, 이후 매우 공격적인 악성 말초 신경초초 종양(MPNST)으로 변합니다. PN이 MPNST로 전환되는 과정을 이해하는 것은 NF1이 있는 인간에게서 볼 수 있는 PN-MPNST 진행을 정확하게 복제하는 유전자 조작 마우스(GEM) 모델의 가용성에 의해 촉진될 것입니다. 불행히도 Nf1 절제가 있는 GEM 모델은 이 프로세스를 완전히 재현하지 못합니다. 이를 통해 슈반(Schwann) 세포에서 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)이 과발현되어 고주파의 MPNST로 발전하는 PN이 발생하는 GEM 모델인 P 0-GGFβ3 마우스를 개발하게 되었습니다. 그러나 P 0-GGFβ3 마우스의 종양형성 및 종양 진행이 NF1 환자에서 관찰되는 과정을 정확하게 모델링하는지 여부를 결정하기 위해서는 먼저 P0-GGFβ3 말초 신경초 종양의 병리학이 인간 종양의 병리를 재현한다는 것을 증명해야 했습니다.

여기에서는 P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 사용하여 GEM 모델에서 말초 신경계 신생물을 정확하게 진단하고 등급을 매기는 데 사용되는 특수 방법론을 설명합니다. Trp53+/- 마우스를 예로 들 수 있습니다. PN 및 MPNST를 진단하는 데 사용되는 조직학적, 면역조직화학적, 조직화학적 방법, 이러한 신생물을 병리학을 모방하는 다른 종양 유형과 구별하는 방법 및 이러한 신생물의 등급을 매기는 방법에 대해 설명합니다. GEM MPNST의 초기 배양 확립, 면역세포화학을 사용하여 이러한 배양을 특성화하는 방법, 동종 이식편을 설정하여 종양원성을 검증하는 방법에 대해 논의합니다. 종합적으로 이러한 기술은 GEM 모델에서 발생하는 PN 및 MPNST의 병리를 특성화하고 이러한 쥐 종양의 병리학을 인간 종양과 비판적으로 비교합니다.

서문

지난 30년 동안 수많은 실험실에서 인간 암 관련 돌연변이를 마우스 게놈에 도입하거나 인간 암에서 과발현되는 유전자 산물을 과발현하여 인간 암의 마우스 모델을 만들려고 시도했습니다. 그 결과 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 새로 도입된 게놈 변형이 종양 형성을 시작한다는 것을 확립하고, 종양 진행에 기여하는 다른 후속 유전적 또는 후성유전학적 변화를 식별하고, 종양 시작 및 진행을 유도하는 주요 신호 전달 경로를 정의하는 등 다양한 목적으로 사용할 수 있습니다. 면역 결핍 마우스의 사용에 의존하는 orthotopic 이종이식 모델과 달리 GEM 암 모델은 완전한 기능을 갖춘 면역 체계를 가지고 있으므로 후보 치료제에 대한 반응을 보다 정확하게 모델링할 수 있습니다. 그러나 이와 같은 목적으로 GEM 암 모델을 사용할 때는 조사관이 GEM 신생물로 관찰한 것이 인간 신생물과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 검증에는 GEM 신생물의 병리학에 대한 철저한 평가와 GEM 신생물의 병리학적 특징이 해당 인간 종양 유형의 병리를 재현하는지 여부에 대한 결정이 포함되어야 합니다.

종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1)은 인간 신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 유전 질환으로, 출생아 3,000-3,500명당 약 1명꼴로 발생합니다 1,2,3. NF1에 감염된 개인은 피부(피부 신경 섬유종)와 큰 신경 및 신경총(망상 신경 섬유종)에 신경 섬유종으로 알려진 여러 양성 말초 신경초 종양이 발생합니다. 진피 신경섬유종과 망상신경섬유종은 모두 신체적, 행동적, 사회적 장애를 일으켜 환자의 삶의 질을 악화시키지만, 망상신경섬유종(PN)은 특히 위험하다 4,5. 이는 PN이 생존율이 매우 낮은 공격적인 방추세포 신생물인 악성 말초신경초종양(MPNST)으로 자주 변형되기 때문입니다 1,2. 이러한 낮은 생존율은 대부분 현재 MPNST를 치료하는 데 사용되는 방사선 및 화학 요법이 효과가 없기 때문입니다. 그러나 새롭고 더 효과적인 치료법을 개발하는 것은 어려운 일이었습니다. 이는 NF1 환자에서 MPNST가 얼마나 흔하게 발생하는지에도 불구하고 여전히 희귀한 신생물이기 때문입니다. 결과적으로, 연구를 위해 많은 수의 인간 종양을 얻는 것은 매우 어렵습니다. 임상시험을 위해 MPNST를 가진 충분한 환자를 모집하는 것도 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경섬유종 발병기전 및 PN-MPNST 진행을 유발하는 이상에 대한 추가 통찰력을 얻고 후보 치료제에 대한 전임상 시험을 촉진하는 것을 목표로 여러 GEM 모델이 생성되었습니다.

NF1 환자는 NF1 유전자의 한 사본에 불활성화 돌연변이가 있습니다. 신경섬유종 발병기전은 Schwann 세포 계통의 세포에서 나머지 기능적 NF1 유전자의 불활성화 돌연변이가 발생할 때 유발됩니다. 그러나 놀랍게도, 생식세포가 Nf1 돌연변이를 비활성화한 마우스를 생성했을 때, 그들은 신경섬유종 6,7을 개발하지 않았다. 다른 모든 세포 유형에서 Nf1-null Schwann 세포 및 Nf1 하플로불충분을 가진 마우스(Krox20-Cre;Nf1flox/- 마우스)가 발달한 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibromas)은 신경섬유종 발병기전을 위해 추가적인 세포 유형에서 감소된 Nf1 유전자 투여량이 필요하다는 것을 시사했다8. 그럼에도 불구하고 Krox20-Cre의 망상 신경 섬유종; Nf1flox/- 마우스는 MPNST로 진행되지 않았으므로 인간 마우스의 생물학을 부분적으로만 모방했습니다. MPNST 발병기전은 Nf1 돌연변이가 Trp539 또는 Cdkn2a10과 같은 추가 종양 억제 유전자의 돌연변이와 짝을 이룰 때 발생했지만, 이러한 GEM 모델의 MPNST는 기존의 양성 신경총형 신경섬유종(benign plexiform neurofibromas)이 아닌 불확실한 생물학적 전위(ANNUBP)의 비정형 신경섬유종 신생물(atypical neurofibromatous neoplasm)에서 발생하거나 발생했다(13,14 참조). Suz12 및 Pten15와 같은 유전자에서 추가적인 MPNST 관련 기능 돌연변이를 도입하는 다른 모델뿐만 아니라 이러한 모델에 대한 우수한 검토를 위해).

이러한 마우스 모델은 NF1, TP53 및 CDKN2A와 같은 유전자가 NF1 관련 말초 신경계 신생물의 발병기전에서 수행하는 역할을 규명하고 후보 치료제를 테스트하는 전임상 시험에 매우 중요합니다. 그러나 우리는 여전히 망상형 신경섬유종이 불확실한 생물학적 잠재력(ANNUBPs16)의 비정형 신경섬유종성 신생물이 된 다음 MPNST가 되는 과정에 대해 불완전하게 이해하고 있습니다. Nf1 및 Arf에서 결실이 있는 마우스가 MPNST로 진행되는 ANNUBP를 개발한다는 최근 보고와 함께 이 과정을 이해하는 데 약간의 진전이 있었습니다11. 그러나 인간에서 볼 수 있는 망상형 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 완전히 재현하는 Nf1 돌연변이 기반 마우스 모델은 아직 존재하지 않습니다. 또한 MPNST의 개발로 이어지는 여러 가지 뚜렷한 경로가 있는지 여부도 명확하지 않습니다. 이를 감안할 때, 위에서 설명한 GEM은 신경섬유종-MPNST 진행 및 MPNST 발병기전으로 이어지는 여러 다른 경로의 하위 집합만 모델링할 수 있습니다. 이 점은 MPNST가 또한 산발적으로 발생한다는 사실과 일부 산발적인 MPNST는 명백히 NF1 돌연변이를 가지고 있지 않다는 사실에 의해 강조된다17,18.

NF1 돌연변이가 결핍된 적어도 일부 산발성 MPNST는 흑색종 또는 다른 유형의 육종이라는 Magollon-Lorenz et al.의 최근 제안에 의해 이 후자의 주장에 도전받았지만, 우리는 최근에 산발적인 MPNST와 NF1 야생형20인 이 종양(2XSB 세포)에서 유래한 세포주를 보고했습니다. 모종양과 2XSB 세포주를 특성화하는 동안, 흑색종 및 산발성 악성 말초신경초 종양의 감별 진단에서 일상적으로 고려되는 여러 다른 육종 유형을 포함한 대체 진단 가능성을 체계적으로 배제했다20. 또한, Magollon-Lorenz 등은 그들이 연구한 3개의 산발적인 MPNST 세포주에서 발견한 결과가 산발성 MPNST로 확인된 모든 종양이 MPNST가 아니라는 것을 나타내기 위해 일반화할 수 없다는 것을 인정했습니다.

신경섬유종과 MPNST 발병기전이 특정 종양 억제 유전자 돌연변이에 반드시 의존하지 않는 GEM 모델을 구축하기 위해, 슈반(Schwann) 세포 특이적 미엘린 단백질 제로(P0) 프로모터(P 0-GGFβ3 마우스)에 의해 강력한 슈반(Schwann) 세포 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)의 과발현이 유도되는 형질전환 마우스를 생성했습니다.21. 우리는 이전에 인간 신경섬유종, MPNST 및 MPNST 세포주가 NRG1 신호전달을 매개하는 erbB 수용체 티로신 키나아제(erbB2, erbB3 및 erbB4)와 함께 여러 NRG1 동형을 발현하고 이러한 erbB 수용체가 구성적으로 활성화됨을 보여주었습니다22. 또한 erbB 키나아제의 약리학적 억제제가 MPNST 증식22, 생존23 및 이동을 강력하게 억제한다는 것을 입증했다24. 인간에 대한 우리의 관찰에 따라, P 0-GGFβ3 마우스는 고주파 21,25에서 MPNST로 진행되는 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibroma)25을 발달시킨다. P0-GGFβ3 MPNST는 인간과 마찬가지로 일반적으로 Trp53 및 Cdkn2a의 돌연변이뿐만 아니라 종양형성에 잠재적으로 기여할 수 있는 수많은 다른 유전체 이상을 발생시킨다는 것을 보여주었다25. P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 MPNST는 비활성화 Nf1 돌연변이를 갖지 않습니다. 그러나, 유전자 보완을 이용하여, NRG1이 Nf1 손실에 의해 변경되는 동일한 신호전달 캐스케이드를 통해 주로 P 0-GGFβ3 마우스에서 종양형성을 촉진한다는 것을 보여주었다26; 이 결론은 Trp53 하플로인부전(haploinsufficiency)이 있는 상태에서 Nf1 손실을 NRG1 과발현으로 대체한다는 우리의 발견에 근거한다(P0-GGFβ3;Trp53+/- 마우스)는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있듯이 MPNST가 de novo로 발달하는 동물을 생산합니다. Trp53+/- 마우스27.

P 0-GGFβ3 마우스가 NF1을 가진 인간에서 볼 수 있는 신경섬유종 발병 및 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 정확하게 모델링한다는 것을 입증하는 이 정보와 기타 정보를 얻기 위해 당사는 이러한 동물의 조직을 처리하고, 종양을 정확하게 진단하고, 이러한 마우스에서 발생하는 MPNST의 등급을 매기고, 초기 통과 P0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 확립하고 특성화하는 특수 방법론을 개발했습니다. Trp53+/- MPNST 배양 및 P 0-GGFβ3 PN 및 MPNST와 P0-GGFβ3의 병리학을 비판적으로 비교; Trp53+/- MPNST를 인간과 비교합니다. 이러한 방법론 중 다수는 신경계 종양의 다른 GEM 모델로 일반화할 수 있습니다. 또한 이러한 방법론 중 일부는 다른 장기 부위에서 신생물이 발생하는 GEM 모델에 더 광범위하게 적용할 수 있습니다. 따라서 여기서는 이러한 방법론에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

프로토콜

여기에 설명된 절차는 사우스캐롤라이나 의과대학의 IACUC의 승인을 받았으며 NIH 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 및 MUSC의 기관 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련된 직원이 수행했습니다.

1. P 0-GGFβ3 마우스의 종양 침투 및 생존 결정 및 추가 특성 분석을 위한 이러한 동물의 종양 식별

  1. 종양 형성에 대해 평가할 마우스 코호트를 생성합니다. 필요한 마우스의 수는 종양 표현형의 침투도에 따라 다릅니다. 이와 같은 손실을 보상하려면 원하는 최종 동물 수보다 10-15% 더 높은 코호트로 시작하십시오.
    참고: 50마리의 마우스로 구성된 초기 코호트에서 P 0-GGFβ3 마우스의 종양 침투율을 경험적으로 측정했습니다(이 중 6개는 신생물과 관련이 없는 이유(예: 싸움)로 손실됨)25.
  2. 일주일에 세 번 동물의 건강을 평가하고 각 검사에서 체중 및 행동 변화를 포함한 신체 상태 점수를 기록합니다. 종양이 있거나 죽은 쥐(아래 참고 참조)를 이산화탄소 안락사 후 자궁경부 탈구를 사용하여 제거한다. 사망 시 나이를 며칠 단위로 기록합니다. 종양이 외부에서 보이는 경우 종양 치수(길이, 너비 및 높이)를 기록합니다.
    참고: 동물은 IACUC가 승인한 최대 허용 종양 크기 및/또는 인도적 종점을 초과하여 진행해서는 안 됩니다.
  3. 사망 시 연령을 사용하여 Kaplan-Meier 생존 곡선을 설정하여 평균 사망 연령과 생존 범위를 결정합니다.
    참고: P 0-GGFβ3 마우스의 평균 사망 연령은 261.5일, 범위는 74-533일이었습니다. 코호트의 91%는 다발성 신경섬유종을 가지고 있었고 71%는 MPNST를 가지고 있었다21.
  4. 눈에 잘 띄는 종양이 있는지 확인하고, 있는 경우 무균 상태에서 종양을 절개하여 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 확인한 다음 종양을 절제합니다. P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3에서; Trp53+/- 마우스, 말초 신경초 종양은 삼차 신경과 좌골 신경에서 가장 흔하게 발견됩니다. 이러한 신경과 관련하여 눈에 잘 띄는 종양이 보이지 않더라도 아래에 설명된 대로 이러한 신경을 고정하고 매립하여 미세 종양의 존재 여부를 검사할 수 있습니다. 미세 종양은 일반적으로 이러한 신경과 관련된 신경절 내에서 발생합니다.
  5. 눈에 잘 띄는 종양을 세 조각으로 자릅니다(그림 1A). 조직학(파라핀 절편, 면역조직화학 및 조직화학)을 위해 1편을 사용합니다. 조각 2를 사용하여 초기 통로 문화를 확립하십시오. 가능한 향후 실험(예: 면역 블록, RNA 및 DNA 분리)을 위한 스냅 동결 조각 3(액체 질소 사용).
  6. 4% 파라포름알데히드를 4 °C에서밤새 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드에 담가 나머지 부분을 고정합니다.

2. 심하게 보이는 종양의 파라핀 포매 및 초기 진단 평가를 위한 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편 준비

  1. 심하게 보이는 종양의 파라핀 삽입
    1. 4% 파라포름알데히드에 종양 조각 1을 밤새 고정한 후 15분 동안 조직 부피보다 10배 이상 큰 PBS 부피에 넣어 조직을 헹굽니다. 이후의 모든 헹굼에 동일한 양을 사용하십시오. 헹굴 때마다 새로운 양의 PBS를 사용하여 15분 PBS 헹굼을 두 번 더 반복합니다.
    2. 종양 조각 1을 70% 에탄올로 옮깁니다. 조직을 70% 에탄올에 넣고 4°C에서 24시간 동안 유지합니다. 원하는 경우 이러한 조건에서 조직을 장기간 보관하십시오.
      참고: 2.1.1단계부터 2.1.7단계까지는 상업용 조직 처리 기계에 접근할 수 없는 연구자를 위해 제공됩니다. 연구자가 조직 처리기에 접근할 수 있는 경우 조직은 프로그래밍된 기기 프로토콜에 따라 등급이 매겨진 에탄올과 크실렌을 통해 처리됩니다.
    3. 종양 조각 1을 80% 에탄올로 실온에서 30분 동안 옮깁니다. 80% 에탄올의 신선한 부피에서 추가로 30분 동안 배양을 반복합니다.
    4. 종양 조각 1을 95% 에탄올로 실온에서 75분 동안 옮깁니다. 배양을 두 번 더 반복하고, 매번 95% 에탄올의 신선한 부피에서 추가로 75분 동안 반복합니다.
    5. 종양 조각 1을 100% 에탄올로 옮기고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 60분 배양을 두 번 더 반복하되 매번 100% 에탄올을 새로 사용합니다.
    6. 종양 조각 1을 d-리모넨 기반 용매로 옮기고 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 종양 조각 1을 d-리모넨 기반 용매의 새로운 부피로 옮기고 실온에서 추가로 30-60분 동안 배양합니다.
    7. 종양 조각 1을 1:1 파라핀/d-리모넨계 용매에 60°C에서1시간 동안 옮깁니다. 1:1 파라핀/d-리모넨계 용매를 버리고 종양 조각 1을 60°C 파라핀으로 옮기고 60°C에서 20분 동안 배양합니다. 종양 조각 1을 60oC에서 밤새 파라핀에 배양합니다.
    8. 파라핀의 기본 층을 강철 조직학 주형에 붓고 응고시킵니다. 종양 조각 1을 베이스 파라핀의 표면으로 옮기고 위치 지정 직후 조직을 60oC 파라핀으로 덮고 조직 카세트를 용융된 파라핀 위에 놓고 접촉시킵니다. 몰드를 임베딩 스테이션의 차가운 쪽으로 옮기고 10-15분 동안 응고시킵니다.
    9. 티슈 카세트가 부착된 파라핀 블록을 금형에서 제거합니다. 부착된 티슈 카세트를 사용하여 절편하는 동안 블록을 마이크로톰에 고정합니다.
      알림: 파라핀 블록은 이제 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
  2. 심하게 보이는 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편을 준비합니다.
    1. 마이크로톰을 사용하여 종양 조직의 4-5μm 절편을 잘라내고 양전하를 띤 유리 슬라이드에 장착합니다.
    2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하려면 실온에서 10분 동안 d-리모넨 기반 용매에 슬라이드를 배양하여 조직 절편을 탈파라핀화합니다. d-리모넨 기반 용매의 새로운 부피에서 10분 동안 배양을 반복합니다.
    3. 슬라이드를 100% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 슬라이드를 100% 에탄올의 신선한 부피로 옮기고 실온에서 5분 더 배양합니다.
    4. 슬라이드를 95% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 슬라이드를 95% 에탄올의 새로운 부피로 옮기고 실온에서 5분 더 배양합니다.
    5. 슬라이드를 70% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 50% 에탄올로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    6. 슬라이드를 증류수로 옮기고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    7. 슬라이드를 실온에서 5분 동안 헤마톡실린에 담가 염색합니다. 흐르는 수돗물로 1-2분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 70% 에탄올에 0.5% 염산에 2-5배 담궈서 분화합니다. 흐르는 수돗물에서 1-2분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 95% 에탄올과 0.5% 아세트산에 10초 동안 넣습니다.
    8. 실온에서 30초 동안 에오신-Y로 슬라이드를 염색한 다음 슬라이드를 5분 동안 100% 에탄올로 옮깁니다. d-리모넨 기반 용매에서 5분 동안 샘플을 투명화합니다.
    9. 슬라이드가 d-리모넨 기반 용매로 젖어 있는 동안 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다. 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
      알림: 수성 장착 매체 를 사용하지 마십시오 .
  3. 망상형 신경섬유종과 마이크로 MPNST를 식별하기 위해 심하게 보이는 종양이 없는 조직을 준비합니다. 조직을 파라핀에 삽입하고, 조직학적 절편을 준비하고, 이 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색합니다.
    1. 내부 장기를 제거하고 각 장기의 대표 부분을 파라핀에 삽입하여 종양의 현미경적 증거를 검사할 H&E 염색 절편을 준비합니다(그림 1B). 머리, 앞다리, 뒷다리 및 꼬리를 제거합니다(그림 1C). 신경근 종양의 증거를 찾기 위해 척수와 신경근을 제자리에서 검사하려면 4oC에서 0.3-72시간 동안 0.3M EDTA/4% 파라포름알데히(pH 8.0)에 담가 척추 기둥과 관련 갈비뼈 및 연조직을 석회질화합니다. 그런 다음 샘플을 1x PBS로 헹굽니다. 석회질 제거가 끝나면 바늘로 척추를 뚫어 석회질 제거가 완료되었는지 확인합니다. 석회질 제거는 바늘이 으스러지지 않고 뼈에 쉽게 침투하면 성공적입니다.
    2. 석회질이 제거된 척추 기둥과 관련 구조물을 조직 카세트에 맞는 블록으로 자릅니다. 2.1.2-2.1.7 단계에 설명된 대로 등급이 매겨진 에탄올을 통해 탈수한 후 d-리모넨 기반 용매를 사용합니다. 파라핀에 삽입하고 2.1.7-2.2.1단계에 설명된 대로 4-5μm 절편을 준비합니다. 2.2.2-2.2.9 단계에 설명된 대로 H&E 염색을 수행합니다. 장착 매체를 밤새 굳히십시오.

3. 잠재적인 망상형 신경섬유종을 식별하고 진단을 확인하기 위해 특수 염색을 수행합니다.

참고: H&E 및 GEM 종양 절편의 특수 염색 평가에 숙련된 인간 또는 수의학 병리학자를 포함할 것을 강력히 권장합니다.

  1. 명시야 현미경을 사용하여 위에서 설명한 대로 준비된 H&E 염색 슬라이드를 검사하여 잠재적인 말초 신경초 종양을 식별합니다. 신경섬유종과 MPNST는 말초 신경 내에서 발생하기 때문에 미세한 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 잠재적인 말초 신경초 종양이 있는 블록을 식별하여 면역염색 및 기타 특수 염색을 수행하여 진단을 확인하거나 반박할 수 있습니다.
  2. H&E 염색 절편의 명시야 검사 중에 관찰된 조직학적 특징을 기반으로 잠재적인 PN을 MPNST/기타 고급 신생물과 구별합니다. 인간 PN은 주로 길쭉하고 종종 물결 모양의 핵을 가진 세포로 구성된 약한 과세포 신생물입니다. 많은 영역에서, 세포는 느슨하게 포장되어 있으며 점액성 세포외 물질에 의해 분리될 수 있습니다. P 0-GGFβ3 마우스의 PN은 유사한 모양을 가지고 있습니다. 유사 분열은 전형적으로 존재하지 않습니다; 종양이 중등도에서 고도의 과세포성인 경우, 종양은 MPNST 또는 다른 유형의 고급 신생물입니다(아래 참조).
  3. PN은 종양성 슈반(neoplastic Schwann) 세포와 비만세포(mast cell)와 같은 다른 비종양 세포 유형의 혼합물로 구성됩니다. PN의 정체를 확인하려면 H&E 검사에서 식별된 잠재적 PN이 포함된 블록의 절편에서 Schwann 세포 마커 S100β 및 Sox10과 비만 세포 마커 CD117(c-Kit)에 대한 면역염색을 수행합니다(대체 비만세포 마커 염색 옵션은 섹션 3.4 참조). Ki67 면역염색을 수행하여 낮은 증식률을 확인합니다.
    참고: 표 1 은 GEM 망상형 신경섬유종(S100β, Sox10, CD117, Ki67)의 일상적인 식별, MPNST의 진단 및 신경섬유종에 존재하는 다른 세포 유형의 완전한 평가에 사용되는 항원 마커를 나열합니다. 우리는 새로운 GEM 모델을 처음 설명할 때만 이러한 후자의 항원에 대해 염색합니다. 권장 조건에 대해서는 항체 제조업체의 데이터시트를 참조하십시오. 항체 제조업체의 삽입물이 항원 회수를 권장하는지 여부를 확인하십시오. 모든 항원을 검출하기 위해 회수가 필요한 것은 아닙니다.
    1. 선택한 파라핀 블록에서 4-5μm 절편을 준비하고 양전하를 띤 슬라이드에 장착합니다. 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 섹션을 분리합니다.
    2. 1x PBS로 3-5분 동안 섹션을 헹굽니다.
    3. 항체 제조업체가 항원 회수를 권장하는 경우 구연산염 완충액을 준비합니다. 구연산 용액 9mL(증류수 500mL에 구연산 10.5g)와 구연산나트륨 용액 41mL(증류수 500mL에 구연산나트륨 14.7g)를 혼합합니다.
    4. 가열된 밥솥에서 20분 동안 구연산염 완충액에 슬라이드를 넣어 항원 검색을 수행합니다.
    5. 슬라이드를 3% 과산화수소/1x PBS로 10분 동안 옮겨 조직의 과산화효소 활성을 제거합니다.
      알림: 이 용액을 매번 신선하게 만들고 과산화수소 원액이 3-4개월 이상 된 경우 사용하지 마십시오.
    6. 1x PBS에서 섹션을 헹굽니다.
    7. 차단 완충액(2x PBS에서 0.1% BSA, 100% Triton X-1)을 사용하여 1시간 동안 섹션을 차단합니다. 1x PBS에서 슬라이드를 짧게 헹굽니다.
    8. 조직 절편에 1차 항체를 추가합니다. 희석된 차단 완충액에 1차 항체를 준비합니다. 37 oC에서 2 시간 동안 또는 4 oC에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
    9. 1x PBS에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 3회 반복합니다.
    10. 비오틴화된 2차 항체로 조직을 1-2시간 동안 배양합니다.
    11. 제조업체의 프로토콜에 따라 디아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비하고 슬라이드를 용액에 2-10분 동안 담급니다. 슬라이드를 물에 5분 동안 씻습니다.
    12. 섹션을 헤마톡실린에 10-15분 동안 담가 대조염색합니다. 맑아질 때까지 흐르는 물에 노출시키십시오. 슬라이드를 알코올에 빠르게 담그고 슬라이드를 물로 헹굽니다.
    13. 70% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올에 용액당 4-5회 슬라이드를 빠르게 담궈 등급이 매겨진 에탄올의 슬라이드를 탈수합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매에서 2분 동안 배양합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매의 두 번째 배치에서 2분 동안 배양합니다.
    14. 크실렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다.
    15. 명시야 현미경으로 슬라이드를 검사합니다.
    16. 면역형광의 경우 3.3.10-3.3.15단계를 생략합니다. 대신, 차단 완충액에 희석된 종 특이적 2차 항체로 조직을 1-2시간 동안 배양합니다.
    17. 슬라이드를 1x PBS에서 5분 동안 헹굽니다. 3x 반복합니다.
    18. 1x PBS/글리세롤을 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
    19. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다.
  4. 비만세포 염색을 위한 대체 방법: 톨루이딘 블루 염색
    1. 톨루이딘 블루 O 1g을 70% 에탄올 100mL에 녹여 톨루이딘 블루 원액을 준비합니다.
    2. 1mL의 증류수에 0.5g의 NaCl을 녹여 50% 염화나트륨(NaCl) 용액을 준비합니다. 섞어서 녹입니다. HCl을 사용하여 pH를 약 2.0-2.5로 조정합니다.
      알림: 이 NaCl 용액은 얼룩이 수행될 때마다 신선하게 만들어야 합니다.
    3. 1% NaCl 용액 45mL에 톨루이딘 블루 원액 5mL를 첨가하여 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비합니다. 잘 섞고 pH가 약 2.3이 되도록 합니다.
      알림: pH가 2.5보다 높으면 변색이 적고 염색이 가능합니다. 염색을 수행할 때마다 이 용액을 신선하게 만드십시오.
    4. 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 양전하를 띤 슬라이드에 장착된 4-5μm 섹션을 탈파라핀화합니다. 탈파라핀화된 부분을 흐르는 물에 2분 동안 씻습니다.
    5. 톨루이딘 블루 작업 용액에서 2-3분 동안 섹션을 염색합니다. 증류수로 2분 동안 씻습니다.
    6. 95% 에탄올에 10배 담가 섹션을 탈수합니다. 100% 에탄올에 10x 담그십시오. 신선한 100% 에탄올을 10번 더 담그십시오.
    7. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매에서 2분 동안 배양합니다. 슬라이드를 d-리모넨 기반 용매의 두 번째 배치에서 2분 동안 배양합니다.
    8. 슬라이드가 d-리모넨 기반 용매로 젖어 있는 동안 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
      알림: 수성 장착 매체 를 사용하지 마십시오 .
    9. 명시야 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 비만세포의 세포질에 짙은 보라색 과립이 존재하는지 확인합니다. 다른 세포 유형은 하늘색으로 염색됩니다.

4. MPNST를 진단하고 대체 진단을 배제하기 위한 특수 염색

  1. 인간 MPNST의 조직학적 양상은 매우 다양하며, 여러 종양 유형이 MPNST와 유사한 양상을 보인다28. MPNST는 Schwann 세포 계통에서 유래하기 때문에 종양이 말초 신경에서 발생하는지 아니면 기존 양성 PN 내에서 발생하는지 H&E 염색 절편의 전체 검사 또는 명시야 현미경 검사를 통해 결정합니다. MPNST는 때때로 말초 신경 또는 PN과 관련이 없는 것으로 발견되지만(일반적으로 절제 중 신경에서 부주의하게 분리되거나, MPNST 과증식으로 인해 기존 PN이 파괴되거나, 병변이 전이성이기 때문에), 종양이 신경 또는 PN과 관련이 없는 경우 진단 가능성이 낮으므로 종양과 신경 또는 PN의 연관성을 찾으십시오.
  2. 잠재적인 MPNST를 포함하는 파라핀 블록에서 4-5μm 절편을 준비하고 2.2.1단계에 설명된 대로 양전하를 띤 슬라이드에 장착합니다. 2.2.2-2.2.6 단계에서 설명한 대로 섹션을 분리합니다.
  3. 단계 3.3.1-3.3.15에 기술된 바와 같이 표 2 에 나타낸 항체 패널로 면역조직화학을 수행한다.
  4. 명시야 현미경으로 면역염색을 검사합니다. MPNST는 슈반니안 분화를 보여주기 때문에 S100β, nestin 및 Sox10에 대한 균일하거나 고르지 않은 면역 반응을 찾습니다. 종양이 이 세 가지 마커에 대해 양성이 아닌 경우 표 2 를 참조하여 진단을 확립하십시오.
    참고: 인간과 마우스 MPNST는 발산 구분을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 일부 인간 MPNST는 국소 횡문근아세포 분화(이러한 변이체를 악성 트리톤 종양이라고 함)를 나타냅니다. 이러한 신생물은 Schwannian 마커에 대해 염색되지만 desmin, MyoD1 및 myogenin과 같은 근육 마커도 발현합니다. 이러한 후자의 표지자에 대한 면역 반응은 연구자들이 종양을 MPNST로 진단하는 것을 단념시켜서는 안 됩니다. 활막 육종 발병기전을 모델링하기 위해 SS18-SSX 융합 유전자를 조건부로 발현하는 여러 마우스 모델이 확립되었지만, 우리가 아는 한, 동등한 융합 전사체를 자발적으로 생성하는 활막 육종 모델은 알려져 있지 않습니다. 결과적으로, 우리는 GEM 종양에서 SS18-SSX 융합 전사체를 찾지 않고 대신 면역조직화학적 프로파일에 의존합니다.

5. MPNST 등급

  1. WHO 등급 IV MPNST의 특징인 종양 괴사가 존재하는지 여부를 확인합니다. 등급 IV MPNST의 경우 두드러진 과세포성, 활발한 유사분열 활성(10개의 고출력(40x) 필드당 ≥4개의 유사분열) 및 세포학적 이형성을 찾습니다.
    1. 괴사가 없는 경우 종양을 평가하여 과세포성, 활발한 유사분열 활성 및 세포학적 이형성이 있는지 여부를 확인합니다. 괴사가 없는 상태에서 이러한 특징이 모두 존재하는 경우 종양을 WHO 등급 III MPNST로 등급을 매깁니다.
    2. WHO 등급 II 종양은 세포성이 증가하는 것이 특징이지만 WHO 등급 III 및 IV MPNST보다 정도가 낮습니다. WHO 등급 II MPNST에서 종양 세포의 핵은 증가된 크기(신경섬유종의 종양 세포 핵 크기의 3배 이상)와 과색증을 나타냅니다. 증가된 유사분열 활동 (10의 고성능 분야 당 <4의 유사분열)는 WHO 급료 II 종양을 위한 필요조건 아닙니다 관련됩니다.
      참고: 높은 등급의 종양은 일반적으로 낮은 등급에서 진행되기 때문에 낮은 등급과 높은 등급의 부위가 동일한 MPNST에 존재할 수 있습니다. 이 상황에서 종양의 등급은 존재하는 가장 높은 등급 부위에 의해 결정됩니다.
      참고: 위에서 설명한 WHO 등급 시스템이 환자 결과를 예측할 수 있는지에 대해 인간 병리학자들 사이에 논란이 있으며, 이러한 병리학자 중 일부는 MPNST를 단순히 낮은 등급 또는 높은 등급으로 분류하는 것을 선호합니다. 이 체계 하에서 고급 MPNST는 두드러진 세포학적 이형성, 활발한 유사분열 활성(10개의 고출력장당 >5개의 유사분열) 및 괴사 유무에 관계없이 현저한 과세포성을 가지고 있습니다. 저등급 MPNST는 괴사가 없지만 유사분열 활성, 세포학적 이형성 및 높은 등급의 MPNST와 생물학적 전위가 알려지지 않은 비정형 신경섬유종 신생물(ANNUBP) 사이의 중간인 세포성을 보입니다. ANNUBP와 낮은 등급의 MPNST를 구별하는 것은 이러한 기관에 대한 오랜 경험이 없는 조사관에게 어려울 수 있기 때문에 위에서 설명한 시스템을 선호합니다.

6. 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포의 배양 준비

  1. 신선한 종양 조각 2에서 초기 통로 P 0-GGFβ3 종양 세포를 배양합니다(단계 1.5, 그림 1A). 이 시점부터 멸균 상태를 유지하십시오.
    1. 종양을 작은(2-4mm) 조각으로 자르고 100mm 조직 배양 접시에 10% 태아 송아지 혈청, 2μmol/L 포스콜린, 10nmol/L 뉴레굴린 1β(NRG1β)가 포함된 DMEM10(Dulbecco의 최소 필수 배지)을 다져 종양을 해리합니다.
    2. 플레이트가 합류할 때까지 37%CO2에서 5oC의 다진 조직 조각에서 세포가 자라도록 합니다. 3-4일마다 미디어를 교체하십시오.
    3. 세포 배양을 분할합니다. 100mm 접시에서 매체를 제거하고 PBS로 셀을 세척합니다. 다진 조직을 제거하고 버립니다. PBS를 제거하고 실온에서 2-5분 동안 0.25% 트립신 1mL를 추가합니다. 세포 분리를 촉진하려면 플레이트를 부드럽게 두드리고 광학 현미경을 사용하여 박리를 확인하십시오. 필요에 따라 트립신 배양을 연장합니다.
    4. DMEM10 2mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브와 펠릿 셀로 5분 동안 500× g 으로 옮깁니다. 배지를 제거하고 펠릿에 신선한 DMEM10 5mL를 추가합니다.
    5. 셀 현탁액을 DMEM10이 포함된 2-4개의 100mm 접시에 분배합니다. 5개 이상 통로 (단계 6.1.3 및 6.1.4)를 위한 세포를 분할하지 않으며 forskolin와 NRG1β 없이 DMEM에서 그(것)들을 유지하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 통로 2에서 세포를 동결하는 것을 잊지 마십시오.

7. 면역세포화학에 의한 초기 통과 MPNST 세포의 식별 확인

  1. 멸균 18mm #1.5 원형 유리 커버슬립을 6웰 멸균 조직 배양 접시의 웰에 넣습니다.
    1. 폴리-L-라이신/라미닌 용액을 커버슬립을 덮기에 충분한 부피로 웰에 넣습니다. 증발을 최소화하기 위해 플라스틱 랩으로 플레이트를 밀봉하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 멸균 PBS로 커버슬립을 3번 세탁합니다.
      참고: 코팅되지 않은 커버슬립에 초기 통과 MPNST 세포를 도금하려고 시도한 결과 폴리-L-라이신/라미닌 코팅이 없는 경우 세포가 잘 부착되지 않는 것을 발견했습니다.
    2. 성장 배지에 있는 세포 현탁액 2mL를 커버슬립이 들어 있는 각 웰에 부드럽게 추가하여 10,000개의 세포를 커버슬립에 플레이트합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 5 % CO2 로 37 ° C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
    3. 다음날 아침, PBS로 커버슬립을 2 x 5분 동안 헹굽니다.
    4. PBS에서 4% 파라포름알데히드로 세포를 실온에서 18분 동안 고정합니다.
    5. PBS로 커버슬립을 3 x 5분 동안 헹굽니다. 원하는 경우 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 이 시점에서 4°C에서 보관합니다.
    6. PBS에서 신선한 50mM NH4Cl을 만드십시오. 실온에서 10분 동안 PBS의 50mM NH4Cl에서 커버슬립을 배양하여 알데히드를 소멸시킵니다.
    7. PBS의 0.3% Triton X-100에서 실온에서 15분 동안 커버슬립을 배양하여 세포를 투과시킵니다. PBS로 커버슬립을 3 x 5분 동안 세탁합니다.
    8. 차단 완충액(1% 소 혈청 알부민, 0.2% 무지방 분유 및 0.3% Triton X-100을 함유한 PBS 1개)에 커버슬립을 실온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
    9. 차단 완충액을 제거하고, 모종양에 존재하는 MPNST 마커(전형적으로 S100β, Nestin, Sox10)를 인식하는 1차 항체를 차단 완충액에 미리 결정된 최적 희석액으로 희석하여 첨가한다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 싸서 가습 챔버에서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
    10. PBS로 3 x 5분 동안 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다. 차단 완충액에 희석한 형광 표지된 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
    11. PBS로 3 x 5 분 동안 씻으십시오. 커버슬립을 1-5 μg의 Hoechst 염료에 10분 동안 배양합니다. 빛 으로부터 계속 보호하십시오.
    12. PBS로 커버슬립을 5분 동안 세탁합니다. 1:1 1x PBS/글리세롤을 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 형광 현미경을 사용한 이미지.

8. 종양원성을 입증하기 위한 초기 통로 종양 세포의 동종이식

  1. DMEM10에서 초기 통과 P 0-GGFβ3 MPNST 세포를 80% 밀도로 성장시킵니다. 실온의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 세포를 한 번 헹굽니다. 세포를 비효소 세포 해리 용액으로 30초에서 1분 동안 처리하여 기질에서 제거합니다. 비효소 세포 해리 시약 1mL당 DMEM10 5mL를 추가합니다.
    알림: 셀룰러 해리는 최대 10-20분까지 훨씬 더 오래 걸릴 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.
    참고: 이식 효과가 감소하므로 세포를 합류하도록 성장시키지 마십시오.
    1. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 세포를 5분 동안 5 × g 으로 스핀 다운시키고 DMEM10 100 μL당 106 세포× 1-2 농도로 재현탁시킵니다. 주입할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
    2. 이소플루란 기화기의 유도 챔버에서 NOD-SCIDγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) 마우스를 마취합니다. 동물을 엎드려 눕히고 70% 에탄올로 주사 부위를 소독합니다. 주입하기 전에 해당 부위를 공기 중에서 건조시키십시오. 주입하기 전에 세포가 실온에 오도록 하십시오.
    3. 오른쪽 측면에 1-2 x 106 세포를 피하 주사합니다. 침구가 없는 케이지에 마우스를 혼자 넣고 회복할 수 있도록 합니다. 저체온증을 방지하기 위해 케이지의 일부만 가열 패드 위에 있는지 확인하십시오. 이것은 마우스가 과열될 경우 이동할 수 있는 영역을 제공합니다.
      참고: 일부 이식편은 취하지 않을 수 있으므로 각 초기 통로 배양에 최소 3마리의 마우스를 접목합니다.
    4. 이식편이 15-60일 동안 자라도록 두십시오. 매주 3회 동물 건강을 평가하고 각 검사에서 체중 및 행동 변화를 포함한 신체 상태 점수를 기록합니다. 최대 허용 이식편 크기에 도달한 쥐를 제거하거나 이산화탄소 안락사 후 자궁경부 탈구를 사용하여 생쥐를 제거한다. 사망 시 나이를 며칠 단위로 기록합니다. 종양이 외부에서 보이면 종양 치수(길이, 너비 및 높이)를 기록합니다.
      참고: 경험에 비추어 볼 때, 다양한 초기 통과 MPNST 배양은 다양한 효율성으로 접목하고 접목 성장에 필요한 시간도 다릅니다. 동물은 IACUC가 승인한 최대 허용 종양 크기 및/또는 인도적 종점을 초과하여 진행해서는 안 됩니다.
  2. 종양을 채취하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀에 포함하고, 섹션 2.1-2.2.9에 설명된 대로 H&E 염색을 수행하여 동종 이식편이 반응성 조직이 아닌 종양인지 확인합니다. 필요한 경우 모종양에 존재했던 마커에 대한 이식편을 면역염색합니다.

결과

그림 2는 P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 매우 명백한 신생물의 예를 보여줍니다. 육안으로 쉽게 식별할 수 있는 종양은 그림 2A(화살표)와 같이 신체 부위를 팽창시키는 종괴로 보일 수 있습니다. 신생물이 잠재적으로 말초 신경초 종양인지 여부를 결정할 때 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우 MRI 스캔(

토론

여기에 제시된 조직학적 및 생화학적 방법은 신경섬유종 및 MPNST 발병기전의 GEM 모델을 진단하고 특성화하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 수년에 걸쳐, 우리는 이러한 방법론이 GEM 모델 21,25,26에서 발생하는 말초 신경초 종양의 병리학을 평가하는 데 매우 유용하다는 것을 발견했다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 GEM 모...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 - D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 - S.L.C.) 및 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 - S.L.C.).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

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