Validazione preliminare delle coordinate di iniezione stereotassiche tramite criosezione

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una strategia pratica per accelerare la fase di verifica delle coordinate di iniezione stereotassiche prima di eseguire il tracciamento virale utilizzando coloranti e sezioni congelate.

Abstract

L'iniezione stereotassica di una specifica regione del cervello costituisce una tecnica sperimentale fondamentale nelle neuroscienze di base. I ricercatori basano comunemente la loro scelta dei parametri di iniezione stereotassica su atlanti cerebrali di topo o materiali pubblicati che impiegano varie popolazioni/età di topi e diverse apparecchiature stereotassiche, richiedendo un'ulteriore convalida dei parametri delle coordinate stereotassiche. L'efficacia dell'imaging del calcio, delle manipolazioni chemiogenetiche e optogenetiche si basa sull'espressione precisa dei geni reporter all'interno della regione di interesse, che spesso richiede diverse settimane di sforzo. Pertanto, è un compito che richiede tempo se le coordinate della regione del cervello bersaglio non vengono verificate in anticipo. Utilizzando un colorante appropriato al posto di un virus e implementando la criosezione, i ricercatori possono osservare il sito di iniezione immediatamente dopo la somministrazione del colorante. Ciò facilita le regolazioni tempestive per coordinare i parametri nei casi in cui esistano discrepanze tra il sito di iniezione effettivo e la posizione teorica. Tali aggiustamenti migliorano significativamente l'accuratezza dell'espressione virale all'interno della regione target negli esperimenti successivi.

Introduzione

Quasi tutti i moderni strumenti di neuromodulazione, compresi gli strumenti di registrazione del calcio in vivo, optogenetici e chemiogenetici, richiedono l'uso di coordinate stereotassiche per colpire l'area cerebrale di interesse ^1,2,3, costituendo la base della manipolazione neurale. Le coordinate stereotassiche per le regioni cerebrali del topo sono definite in relazione a bregma e lambda, i punti di riferimento ossei sul cranio, che formano il cosiddetto sistema di coordinate stereotassiche derivato dal cranio. Sia bregma che lambda possono fungere da punto zero delle coordinate tridimensionali. I tre assi sono anteroposteriore (AP), mediolaterale (ML) e dorso-ventrale (DV), che rappresentano gli assi y, x e z sul display digitale degli strumenti stereotassici. Per regioni cerebrali ben note, i parametri delle coordinate stereotassiche di un'area specifica possono essere ottenuti dagli atlanti del cervello di topo⁴ (ad esempio, Paxinos e il cervello di topo di Franklin in coordinate stereotassiche) e/o dalla letteratura pubblicata ^5,6. Tuttavia, è necessaria un'ulteriore convalida a causa delle variazioni nell'attrezzatura stereotassica e dell'età/popolazione dei topi utilizzati da diversi ricercatori.

La struttura è la base della funzione. I circuiti neurali costituiscono la base di molte funzioni cerebrali, come le attività cognitive, le emozioni, la memoria,^{le funzioni sensoriali} e motorie. Etichettare la struttura e manipolare l'attività dei circuiti neurali è vitale per comprendere la funzione di uno specifico circuito neurale. Negli ultimi decenni, i traccianti neurali si sono evoluti attraverso molte generazioni; le prime ricerche hanno adottato l'agglutinina del germe di grano (WGA) e l'agglutinina phaseolus vulgaris (PHA) come traccianti anterogradi, e il fluorogold (FG), la subunità B della tossina del colera (CTB), la carbocianina come traccianti retrogradi. Tuttavia, a differenza dei traccianti virali, questi traccianti neurali tradizionali non possono integrare geni esogeni nell'ospite, né hanno selettività per tipo di cellula. Al giorno d'oggi, la strategia virale è diventata una proposta importante durante la ricerca di base sulle neuroscienze. Per diversi scopi di ricerca, è possibile selezionare vari strumenti virali ^7,8. Esistono virus non transsinaptici, virus trans-multisinaptici (retrogradi e anterogradi) e virus trans-monosinaptici (retrogradi e anterogradi). Ogni categoria contiene diversi tipi con le rispettive caratteristiche.

Il processo di somministrazione ed espressione virale richiede molto tempo e risorse, spesso richiede settimane o anche di più. Tra i vari vettori virali, il virus adeno-associato è stato identificato come un mezzo promettente per la consegna genica, fornendo un'ampia finestra che va da 3 a 8 settimane dopo l'iniezione per la procedura sperimentale ^7,8. Con l'evolversi dell'AAV, l'analisi può essere eseguita 2-3 settimane dopo la somministrazione ^9,10. Anche altri traccianti di circuiti neurali, come il virus della pseudorabbia (PRV) e il virus della rabbia (RV), richiedono un periodo di tracciamento di almeno 2-7 giorni 11,12,13,14,15. Pertanto, una verifica preliminare del sito di iniezione prima di osservare i segnali di fluorescenza è efficace sia in termini di tempo che di costi.

Per facilitare una verifica semplice e rapida delle iniezioni stereotassiche, in questo studio, viene somministrato un colorante prima dei vettori virali e la criosezione consente ai ricercatori di osservare il sito di iniezione e tracciarlo entro 30 minuti dopo l'iniezione.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE (Animal Research Reporting In Vivo Experiments) e la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il presente studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di otto settimane. Gli animali sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in gabbie standard (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h ciclo luce/buio, cibo e acqua ad libitum).

1. Selezione delle regioni cerebrali bersaglio

NOTA: Questa è una procedura sterile. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterilizzati. Spruzzare i guanti con alcool prima del contatto con gli strumenti chirurgici. Evitare di toccare la punta degli strumenti o l'area chirurgica con i guanti. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato prima di iniziare la procedura controllando la perdita dei riflessi di raddrizzamento e l'assenza di risposta alla stimolazione cutanea. Prima della perforazione e dell'iniezione, monitorare attentamente la frequenza respiratoria (60-220 respiri al minuto, in media 100-150 respiri al minuto) e l'ampiezza della respirazione (deve essere costante e non eccessivamente superficiale o profonda). Eventuali variazioni significative della frequenza respiratoria o dell'ampiezza devono essere annotate.

1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo all'1,25% (250 mg/kg) utilizzando un ago da 29 G. Radere i peli del cranio una volta che il riflesso di raddrizzamento scompare. Fissare il mouse nel telaio stereotassico (vedi Tabella dei materiali) fissando gli incisivi superiori con una pinza nasale e stabilizzando la testa utilizzando due barre auricolari.
2. Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare. Disinfettare il cuoio capelluto tamponandolo tre volte con Anerdian (soluzione disinfettante; vedi Tabella dei materiali). Iniettare 0,2 ml di lidocaina all'1% per via sottocutanea utilizzando un ago da insulina da 29 G per fornire analgesia locale.
3. Fai un'incisione di 0,5 cm usando le forbici per gli occhi per esporre il cranio. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di 3% di H₂O₂ per strofinare il cranio esposto per rimuovere il periostio. Lasciare asciugare il cranio.
4. Fissare il trapano allo strumento stereotassico. Regolare le manopole dei bracci stereotassici per posizionare la punta del trapano con precisione sulla bregma con l'aiuto di una lente d'ingrandimento e registrare il valore dell'asse z utilizzando il display digitale LCD.
   1. Regolare le manopole e posizionare la punta del trapano in corrispondenza della lambda e registrare il valore dell'asse z. Regolare il morsetto per il naso e le barre auricolari per avvicinare i due valori z e ripetere i passaggi precedenti fino a quando la differenza tra i due valori z è inferiore a 0,1 mm.
      NOTA: Gli assi x, y e z sul display digitale LCD corrispondono rispettivamente al mediolaterale (ML), anteroposteriore (AP) e dorso-ventrale (DV). La bregma e la lambda possono essere considerate sullo stesso piano orizzontale quando la differenza tra i due valori z è inferiore a 0,1 mm.
5. Garantire la planarità sinistra-destra del cervello. Regolare le barre auricolari attaccate alla montatura stereotassica con la stessa scala. Prendiamo ad esempio il nucleo tegmentale latero-dorsale, la parte ventrale (LDTgV); le sue coordinate stereotassiche sono -5,2 per x, +0,8 per y, -4,0 per z, secondo Paxinos e Franklin's mouse brain atlas¹⁶.
   1. Regolare la barra auricolare per fare il trapano a (-5.2, +0.8) per misurare il valore z in direzione dorso-ventrale e spostare il trapano a (-5.2, -0.8) per misurare il valore z.
      NOTA: La differenza tra sinistra e destra è considerata allo stesso livello quando la differenza tra i due valori z è inferiore a 0,2 mm. Le barre auricolari devono essere inserite nel posto giusto perché il meato uditivo esterno è simmetrico. Se la differenza tra i due valori z è superiore a 0,5 mm, la barra auricolare potrebbe essere inserita nel punto sbagliato.
6. Posizionare nuovamente il trapano sulla bregma e impostare tre coordinate sul display digitale LCD su zero. Posiziona il trapano sopra la regione di interesse utilizzando le coordinate di riferimento. Inizia l'esercizio.
   1. Abbassare gradualmente il trapano utilizzando il braccio verticale fino a quando non penetra nel cranio. Elimina detriti e sangue usando tamponi di cotone.
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale.

2. Preparazione della soluzione colorante e microiniezione cerebrale

1. Prelevare 25 μl di tampone di caricamento SDS-PAGE contenente blu di bromofenolo (vedere la tabella dei materiali) in una provetta per microcentrifuga da 200 μl. Aggiungere 50 μl di ddH₂O alla provetta per preparare la soluzione colorante.
2. Copri la finestra cranica con un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina. Garantire la pervietà della microsiringa aspirando ed espellendo ripetutamente la soluzione fisiologica. Caricare 0,3 μl di colorante nella micro siringa. Collegare la siringa e il microiniettore stereotassico motorizzato al braccio stereotassico.
3. Posizionare la punta della siringa sul bregma e impostare le coordinate su zero sul display digitale LCD. Regolare l'ago nella regione di interesse in base alle coordinate di riferimento. Impostare la velocità di iniezione su 0,1 μL/min e avviare il microiniettore motorizzato, erogando 0,3 μL di colorante blu nella regione target. Lasciare la siringa in posizione per almeno 10 minuti prima di estrarre lentamente l'iniettore.
   NOTA: Coloranti di colore diversi possono essere utilizzati negli stessi topi per distinguere le regioni vicine. Testare altri coloranti per ottenere concentrazioni adeguate in base alle loro proprietà fisiche. Si consiglia di utilizzare la formula blu di bromofenolo e di sciacquare accuratamente la siringa prima e dopo l'uso per evitare ostruzioni. Regolare i volumi di iniezione in base alla diffusione del colorante.

3. Prelievo di tessuto cerebrale e criosezione

1. Rilasciare il mouse dal fotogramma stereotassico. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico utilizzando un ago da 29 G. Fissare il mouse su una tavola di gommapiuma con del nastro adesivo.
2. Aprire entrambi i lati del torace per indurre un rapido soffocamento. Praticare un'incisione di 1-2 mm nell'appendice atriale destra. Inserire un ago per infusione nel ventricolo sinistro. Mettere in infusione 20 mL di soluzione salina pre-raffreddata e 20 mL di soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4%.
3. Decapitare il topo con forbici da dissezione tissutale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Rimuovere la pelle praticando un'incisione lungo la linea mediana dal collo al naso e quindi esporre il cranio. Elimina il muscolo residuo sul cranio con una pinza o una forbice.
4. Posizionare la punta di una lama delle forbici sottili tra il forame magno e il cervello, con il bordo affilato rivolto verso l'osso, all'estremità rostrale della sutura medio-sagittale. Procedere a far scorrere e tagliare il cranio lungo la sutura medio-sagittale. Impiega una pinza per rimuovere il cranio, rivelando il cervello esposto.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare di causare danni al cervello durante l'operazione. Prima di rimuovere i frammenti ossei, staccare con cura eventuali meningi che potrebbero essere attaccate al cranio. Questa precauzione è fondamentale per prevenire l'affettatura involontaria del tessuto cerebrale durante il processo.
5. Accendere l'alimentazione del criostato a microtomo rotante (vedi Tabella dei materiali) e impostare la temperatura della camera a -20 °C. Versare un po' di composto OCT per coprire uniformemente la superficie del disco campione. Posizionarlo nella criocamera e lasciare che l'OCT si solidifichi.
6. Fissare il disco alla testa del campione. Avvicinare la lama al blocco e tagliare il blocco OCT per creare un piano piatto parallelo al disco.
7. Tagliare il cervello in direzione coronale lontano dal sito di iniezione in uno stampo a fetta di cervello con una lama da barba. Posizionare il tessuto cerebrale contenente il sito di iniezione con il lato tagliato rivolto verso il basso sul piano piatto dell'OCT.
   1. Versare l'OCT sul cervello e inserire il disco nella criocamera, consentendo al blocco del campione di solidificarsi. Versare ripetutamente l'OCT sul cervello fino a quando il cervello non è completamente incorporato nell'OCT.
      NOTA: Aggiungere il composto OCT strato per strato. Una volta che lo strato precedente di OCT è stato congelato, versare lo strato successivo di composto OCT sul cervello.
8. Tagliare il blocco del campione fino a quando la regione target non si avvicina. Eseguire diverse sezioni dal livello del sito di iniezione. Raccogliere le fette di cervello coronale in una piastra a 6 pozzetti contenente PBS a temperatura ambiente utilizzando un piccolo pennello da scrittura mantenuto a -20 °C.
   NOTA: Impostare lo spessore di taglio su uno maggiore per rifilare il blocco, quindi impostare lo spessore di taglio su 40 μm quando la lama si avvicina al sito di iniezione. Se vengono utilizzati traccianti di circuiti neurali, i topi non vengono sacrificati immediatamente. Posizionare il topo in una gabbia di recupero postoperatoria sterile sopra una coperta riscaldante per il recupero dall'anestesia. Riporta i topi nella gabbia originale o in una nuova gabbia una volta svegli.

4. Imaging

1. Lavare l'OCT con PBS a temperatura ambiente. Usa un pennello per raccogliere le sezioni del cervello e posizionarle su un vetrino. Lasciare asciugare le sezioni all'aria a temperatura ambiente.
2. Osservare visivamente la regione iniettata o utilizzare un microscopio quando i nuclei bersaglio sono minuscoli. Confronta la posizione del colorante iniettato con la regione corrispondente nell'atlante cerebrale.
   NOTA: Regolare i valori degli assi x, y e z in base alla direzione e alla distanza della deviazione del punto di iniezione. Potrebbe essere necessario ripetere più volte tutti i passaggi di questo protocollo per determinare le coordinate in modo accurato.

Risultati

Questo studio ha identificato con successo il sito di iniezione entro 30 minuti utilizzando il metodo dimostrato. Inizialmente, una soluzione di caricamento del campione SDS-PAGE contenente blu di bromofenolo è stata iniettata nell'LDTgV nei topi C57/BL. La Figura 1A mostra una rappresentazione schematica dell'iniezione della soluzione colorante. La distribuzione del colorante blu nell'LDTgV è illustrata nella Figura 1B.

Il blu di b...

Discussione

Questo articolo ha descritto una strategia stabile per verificare l'accuratezza delle iniezioni cerebrali stereotassiche ^5,6 più rapidamente e semplicemente prima del tracciamento virale, ma l'aspetto insostituibile dell'espressione genica reporter nella regione del cervello è cruciale per la marcatura della regione del cervello. Il colorante blu che abbiamo utilizzato ha permesso la visualizzazione immediata del sito di iniezione.

D...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910