バイオエンジニアリング材料の研究のための咬筋体積筋損失のげっ歯類モデル

要約

ここでは、ラット咬筋の体積筋損失(VML)損傷を外科的に作成するためのプロトコルについて説明し、頭蓋顔面筋損傷の研究と新規ヒドロゲルなどの生体材料を使用したその治療のための再現性とアクセス可能なモデルを提供します。

要約

頭蓋顔面容積筋喪失(VML)損傷は、重度の外傷、外科的切除、炎症、および先天性またはその他の後天性の状態の結果として発生する可能性があります。頭蓋顔面VMLの治療には、外科的で機能的な筋肉移植が含まれます。しかし、これらの処置では正常な機能、感覚、表現を回復することはできず、より一般的には、これらの状態は治療されないままです。頭蓋顔面VMLの動物モデルにおける骨格筋の再生に関する研究はほとんど行われていません。この原稿では、頭蓋顔面VML損傷の研究のためのラットモデルと、これらの損傷の治療における生体材料の組織学的評価のためのプロトコルについて説明します。外科的VMLの作成時には液体ハイドロゲルと凍結乾燥足場が適用され、咬筋は12週間までの終末時点で切除され、保持率が高く、合併症はごくわずかです。ヘマトキシリンとエオシン(HE)、マッソントリクローム、および免疫組織化学分析を使用して、骨格筋の再生、生体適合性、免疫調節のパラメーターを評価します。ヒアルロン酸ベースのハイドロゲルの研究を示していますが、このモデルは、VML損傷における材料のその後の反復を評価する手段を提供します。

概要

重度の外傷、外科的切除、炎症、およびその他の後天的な状態は、内因性骨格筋修復メカニズムを圧倒する程度の組織喪失を引き起こす可能性があります。一次再生プロセスを促進する常在細胞と構造の喪失は、病理学的リモデリングと組織線維化を引き起こし、機能と感覚の長期的な欠損をもたらす可能性があり、体積筋喪失(VML)^{と呼ばれます1,2,3}。VML損傷に対する炎症反応には、マクロファージ、サイトカイン、および筋原性細胞が関与する十分に文書化された複雑なメカニズムが関与しており、^{再生医療4}において多くの理論的標的を提示します。多くの in vitro 研究では、四肢 VML 治療の動物モデルでこれらのターゲットが利用されていますが、頭蓋顔面 VML ^5,6,7 の動物モデルにおける骨格筋の再生に関する研究は不足しています。

頭蓋顔面組織の喪失は、前述したような状態から生じる可能性があり、頭蓋顔面組織の欠損は、裂け目などの先天性疾患でも発生する可能性があり、場合によっては筋肉組織の真の体積欠損が関与します^8,9。頭蓋顔面領域の筋肉は機能だけでなく審美的な外観にとっても重要であるため、VML の長期的な影響は重大な心理的苦痛をもたらす可能性があります。頭蓋顔面骨格筋のいくつかの側面は、遺伝子発現、胚起源、衛星細胞表現型、衛星細胞量、線維組成、および構造10,11,12,13のバリエーションを含む、四肢に見られる体節由来の骨格筋とは異なる。これらの変動により、VML損傷が頭蓋顔面筋に異なる影響を与える可能性があります 体節由来の筋肉^14,15。今日まで、四肢VMLの動物モデルで再生を増加させることが示された組織工学的アプローチは、頭蓋顔面VML動物モデル¹⁶と同等に変換されていません。このことは、動物の頭蓋顔面VMLモデルに対するin vivoアプローチを最適化する必要性を強調しています。

頭蓋顔面VMLのいくつかのin vivo研究が実施されていますが、研究は小規模であり、動物モデルで堅牢な頭蓋顔面筋の欠陥を作成することは困難です^8,13。Kimらは、マウス咬筋VMLモデルの開発を報告しました。しかし、この研究では、損傷後28日までの組織型のみを評価し、時点間の組織学的転帰の違いを検出する力が不明でした¹⁷。Rodriguezらは、ヒツジの頭蓋顔面VMLモデルの開発を報告しました。しかし、彼らは実験群内で高いばらつきを報告し、最初の外科的損傷の重症度に不均一性があることを示唆している¹⁶。ここでは、ラット咬筋VMLモデルのプロトコルを報告し、組織工学的アプローチの評価におけるその有用性を実証します。

プロトコル

この研究は、『The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals』に概説されている推奨事項の遵守を含む、適用されるすべての規制に従って実施されました。UCSFのInstitutional Animal Care and Use Programは、すべての動物処置と術後ケア(IACUCプロトコル #AN195944-01)を承認しました。

1. VML手術

1. 12週齢の雄Sprague-Dawleyラットを、密閉容器内で276〜300 gの体重で、イソフルオラン全身麻酔を使用して1%〜5%の割合で麻酔してから、滅菌手術野に移します。
   1. げっ歯類を左側に配置して、首をニュートラル位置に伸ばし、鼻を麻酔薬の鼻円錐に収まるようにして、顔の右側に露出できるようにします。
   2. 誘導から保守までのイソフルオラン流量(約2%)をテーパーします。
2. げっ歯類の目に眼科用軟膏を塗ります。
3. 脱毛クリームを使用して、口の右隅、右耳の付け根、および下顎骨の角度と下との間に線で囲まれた手術部位をクリアにします。
   1. エタノールとベタジンスクラブの両方を使用して、手術部位を円を描くように数回消毒します。.
      注:このプロトコルでは、アクセスのサイズと位置を考慮して、滅菌ドレープは使用されません。この手順は、動物管理ガイドラインに従った無菌技術を使用して行われます。
4. 下右ひげパッドから右耳までの長さ3〜4cmの縦切開を作成します。
   1. 皮膚フラップを持ち上げ、右咬筋と顔面神経の頬側および下顎側の枝を視覚化できるようにします(図1A)。
   2. 鈍い分離を使用して下にある筋膜から皮膚を取り除き、外科的クランプを使用して皮膚の端を収縮位置に保持して、下にある筋肉を最適に視覚化します。
5. 咬筋の前部を覆う筋膜に長さ1〜2cmの横切開を行います。鈍器分離を使用して、筋膜と咬筋の間のスペースを慎重に拡張し、残りの筋膜の全体的な完全性を維持します。
6. 筋膜切開を表在性咬筋への窓として使用し、滅菌された使い捨てパンチ生検を使用して、幅 5 mm、深さ 5 mm の筋肉に円形の損傷を作成します。神経への外傷を避けるように注意しながら、欠損が顔面神経の頬側と下顎側の枝の間の中心にあることを確認します(図1B)。
7. 円形咬筋損傷に生体材料を追加します(図1C)。
8. 薬剤が適切に配置されたら、移動を避けるために、単一の5-0モノフィラメント縫合糸を使用して筋肉を投入する筋膜窓を縫合します。
   注:固形剤は傷口に直接配置され、組織を攪乱して血液の飽和を促進することができますが、液体剤は添加され、必要に応じてゲル化させるか、不要な動きを避けるために筋膜を使用してすぐに所定の位置に閉じます。今回紹介する実験では、アクリル化ヒアルロン酸をベースとしたクライオゲルを投与します。
9. 単純な中断または5-0モノフィラメントを使用したランニング皮下技術を使用して皮膚を閉じます。
   1. 縫合糸に皮膚接着剤を塗布して、術後の切開裂開を防ぎます。
10. ラットを外部熱源(ケージの下の加熱パッドまたはケージ内の滅菌ハンドウォーマー)を備えたケージで回復させ、術後30分間観察します。
11. トリメトプリム-スルファメトキサゾール抗生物質(トリメトプリム200mgとスルファメトキサゾール40mgを5mL)で飲料水(5mL / 200mL水)で希釈し、術後7日間げっ歯類の飲料水に投与します。.周術期鎮痛が施設のプロトコルに従って実施されていることを確認してください。
    注:この研究では、外科的切開の前に0.25%SCブピバカインが投与され、麻酔からの回復前に0.05mg / kgSCブプレノルフィンが投与され、麻酔からの回復前に2mg / kgIPメロキシカムが投与されました。

2. 咬筋の採取・凍結・分析

1. 所定の時点で、麻酔薬誘導チャンバー内で化学物質(_CO2 または麻酔薬など)の過剰投与を誘発することにより、ラットを犠牲にします。
2. げっ歯類の犠牲を確認するために、腹側 4^番目の 肋骨から 1 つのメス切開を使用して両側開胸術を行い、肺を穿刺します (両側開胸術)。
3. 咬筋が視覚化できるように外科的切開を再度開き、アクセスを容易にするために咬筋の上にある皮膚を取り除きます。
4. 下顎骨の角度での分離から始めて、下顎骨から咬筋を解剖して取り外します。咬筋の厚さ全体を捉えるために、解剖が骨表面に沿って行われることを確認します。
   1. 下顎骨に沿って前方に解剖し、腱の付着点を切断します。次に、頬骨弓に沿って後方に解剖します(図1D)。最後に、出血のリスクが高まるため、後部の付着部を解剖します。
5. 切除した咬筋を室温(RT)で1x PBSですすぎ、ペーパータオルで試料を完全に吸い取って余分な水分を取り除きます。
6. 筋肉をクライオモールドに入れ、前端を下向き、後端を上に向けて、最適な切断温度(OCT)埋め込み媒体に沈めます。
7. 金属製のカップにイソペンタンを加え、液体窒素が入らないように注意して液体窒素に浸して冷まします。
   1. イソペンタンが最適温度(-140〜-149°C)に達し、わずかに増粘したら、OCTを含むクライオモールドと咬筋を部分的にイソペンタンに沈め、OCTが凍結するまで保持します。凍結したクライオモールドをドライアイスの上に置いて、-80°Cの冷凍庫に移します。
8. 凍結した咬筋サンプルを、前極が最初に切片化され、サンプルを後方に移動するような向きで凍結します。ティッシュブロックの温度を-20°Cに、クライオ切片ブレードの温度を-15°Cに設定します。 200 μmごとに、4枚のスライド(10 μm切片で2枚、6 μm切片で2枚)をカットしてから、さらに200 μm移動し、さらに4枚のスライドをカットしてサンプル全体で繰り返します。
9. 組織学分析には10 μm切片(Masson's Trichrome、Hematoxylin and Eosin、Picrosirius Redなど)を、免疫組織化学には6 μm切片を使用します。
   注:組織学には、6μm切片も使用できます。
10. 光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。
11. Image Jソフトウェアを使用して、咬筋の~200筋線維の断面積を測定します。

3. 免疫組織化学解析

1. 胚性ミオシン重鎖の免疫組織化学的分析では、スライドを4% PFAに室温で1時間固定します。
2. スライドをPBSでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
3. スライドを0.5% Triton X-100と室温で15分間インキュベートすることにより、組織を透過化します。
4. スライドをPBSでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
5. 宿主マウス由来の一次モノクローナル抗体(1:200)と2%正常ヤギ血清(NGS)に4°Cで一晩インキュベートします。
6. スライドをPBS-TweenでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
7. ウサギ宿主(1:500)由来の蛍光色素標識抗マウス二次抗体と、2% NGS中でRTで2時間インキュベートします。
8. スライドをPBS-TweenでRTで3回洗浄し、各洗浄を10分間放置します。
9. カバースリップを配置する前に、DAPI蛍光マウントを3滴使用してスライドをマウントします。

結果

生体材料を用いた頭蓋顔面VMLの評価と組織再生の結果には、定量的および定性的な結果の両方が含まれます。

図2 は、前述のモデルを用いた定性的評価の一例を示しています。当社のハイドロゲル内で のde novo 筋線維の成長の観察は、定性的な肯定的な結果であり(図2A)、生体材料が十分な建築?...

ディスカッション

プロトコルには、最適な結果を得るために特別な注意が必要ないくつかの重要なステップがあります。ステップ1.4では、表在性咬筋筋膜からの皮膚の初期切開と鈍的分離について説明します。鈍的解剖は、傷がついたり、意図せずに筋膜に窓を作ったりするのを防ぐために、はさみを下に向け、ハサミで下にある筋肉や筋膜から離れた方向を向いて、皮膚に沿って直...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
F1.652 Myosin heavy chain (embryonic) monoclonal antibody	DSHB	F1.652
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Integra Standard Biopsy Punches, Disposable Standard biopsy punch; 5 mm, Diameter: 0.19 in., 0.5 cm	Integra	12460411
Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) preadsorbed	Abcam	ab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim Oral Suspension, Cherry Flavored, 473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP