저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 논문에서는 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 모델로 올레산 유도 HepG2 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 유병률은 경제 및 생활 패턴의 변화로 인해 급증하여 심각한 건강 문제로 이어지고 있습니다. 이전 보고서에서는 MASLD에 대한 동물 및 세포 모델의 확립을 연구하여 이들 간의 차이점을 강조했습니다. 이 연구에서는 MASLD에서 지방 축적을 유도하여 세포 모델을 만들었습니다. HepG2 세포를 다양한 농도(0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)의 불포화 지방산 올레산으로 자극하여 MASLD를 모방했습니다. 모델의 효능은 세포 계수 키트-8 분석, Oil Red O 염색 및 지질 함량 분석을 사용하여 평가되었습니다. 이 연구는 MASLD 세포에 대한 작동이 간편한 세포 모델을 만드는 것을 목표로 했습니다. 세포 계수 키트-8 분석 결과에 따르면 HepG2 세포의 생존은 GI50 이 1.875mM인 올레산 농도에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 0.5mM 및 1mM 그룹의 세포 생존율은 대조군보다 유의하게 낮았습니다(P < 0.05). 또한 Oil Red O 염색 및 지질 함량 분석은 HepG2 세포에서 다양한 올레산 농도(0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)에서 지방 침착을 검사했습니다. 0.25mM, 0.5mM, 1mM군의 지질 함량은 대조군보다 유의하게 높았다(P < 0.05). 또한, OA 그룹의 트리글리세라이드 수치는 대조군보다 유의하게 높았습니다(P < 0.05).

서문

대사기능 장애 관련 지방성 간 질환(metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD)은 단순 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경변증, 간세포 암종 1,2,3,4,5,6 등 다양한 질환을 포함하며, 모두 알코올 섭취 이외의 요인에 기인한다 7 . MASLD는 대사성 간 손상으로 인해 발생하는 가장 흔한 간 질환으로, 전 세계 인구의 거의 4분의 1이 영향을 받습니다 8,9,10,11,12. MASLD의 정확한 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 다양한 이론이 그 발병을 설명하려고 시도합니다. 한 가지 지배적인 개념은 고전적인 "2 히트" 이론에서 "다중 히트" 모델1로 출발할 것을 제안합니다. 이러한 가설의 핵심은 인슐린 저항성의 역할이며, 이는 MASLD 발병기전에서 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다13. 연구에 따르면 간세포의 인슐린 저항성은 유리 지방산 수치를 증가시켜 간 내에 저장된 트리글리세라이드를 형성합니다14,15.

연구원들은 MASLD에서 지방 침착을 시뮬레이션하기 위해 in vivo 및 in vitro 모델을 모두 사용했습니다. 그러나 그 병리기전을 완전히 복제하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 한계에도 불구하고 이러한 모델은 MASLD에 대한 잠재적인 치료 표적을 연구하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 MASLD의 안정적인 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 동물 모델은 효과적이지만 시간과 비용이 많이 들기 때문에 체외 세포 모델에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이러한 모델은 종종 올레산(OA) 및 팔미트산과 같은 단일 또는 다중 유리 지방산을 사용하여 식이 유발 MASLD를 재현합니다. 이 중 인간 간모세포종 세포주인 HepG2는 MASLD의 시험관 내 세포 모델을 확립하는 데 자주 사용됩니다.

OA 유도는 HepG2 세포를 자극하여 역사가 잘 확립된 방법인 MASLD와 유사한 지방 침착을 복제합니다. 이 연구의 목적은 0.25mM OA로 처리된 HepG2 세포의 생존율, ORO(Oil Red O) 염색, 지질 함량 및 트리글리세리드(TG) 수준을 입증하는 것이었습니다. 이 실험의 목적은 MAFLD 모델링 연구의 개발을 위한 추가 증거를 제공하는 것이었습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 세포 배양

  1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(10% 소 태아 혈청[FBS], 100단위/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신 포함)을 함유한 배양 플라스크에서 HepG2 세포 배양. 배양 플라스크를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C로 유지합니다.

2. cell counting kit-8로 측정한 올레산이 세포 생존율에 미치는 영향

  1. 특정 부피의 OA를 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 200mM의 농도를 달성합니다. 나중에 사용할 수 있도록 용액을 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 웰당 6 × 103 개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 HepG2 세포를 파종합니다. 각 웰에 100μL의 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양하고 배양합니다. HepG2 세포를 두 그룹으로 나눕니다.
    1. 대조군: 세포 배양 배지를 추가합니다.
    2. OA 그룹: 세포 배양 배지에 OA를 첨가하여 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM 및 1mM의 최종 농도를 얻습니다.
  3. 초기 배양 24시간 후 각 웰에서 상층액을 버리고 지정된 그룹화에 따라 OA를 추가하여 웰당 100μL를 추가합니다. 대조군의 경우 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 24시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
    참고: 각 그룹에 6개의 반복 웰이 있는지 확인합니다. 증발을 방지하려면 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 96웰 플레이트에 있는 웰의 외부 링에 추가합니다.
  4. 24시간 배양 후 각 웰에 10μL의 세포 계수 키트-8(CCK-8)을 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 마이크로플레이트 리더에 넣고 450nm(A450)에서 흡광도 값을 측정합니다. GI50 값은 OD에 따라 계산되었습니다.

3. 세포 내 지질 방울 형성을 관찰하기 위한 Oil Red O 염색

  1. 웰당 5 × 105 개의 세포 밀도로 6웰 세포 배양 플레이트에 HepG2 세포를 파종하고 플레이트를 항온 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 설명된 단계의 시각적 표현은 그림 1 을 참조하십시오.
  2. 세포 배양 24시간 후 OA가 포함된 세포 배양 배지 2mL를 각 웰에 추가하여 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM 및 1mM의 최종 농도를 달성합니다. 추가 24시간 후 각 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 각 웰에 ORO 고정제 1mL를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
  3. 염색 용액 A와 염색 용액 B를 3:2의 비율로 혼합하여 ORO 염색 용액을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 방치한 다음 0.45μm 필터를 통해 한 번 여과합니다. 여과된 용액을 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 원심분리기 튜브에 보관하십시오.
  4. 정착제를 버리고 증류수로 두 번 씻으십시오. 각 웰에 60% 이소프로판올 1mL를 추가하고 30초 동안 배양합니다. 이소프로판올 용액의 60%를 버리고 20분 동안 배양하기 전에 갓 준비한 ORO 염색 용액 1mL를 각 웰에 추가합니다. ORO 염색 용액을 버리고 각 웰에 60% 이소프로판올 1mL를 넣고 30초 동안 배양합니다. 과도한 염료를 제거하기 위해 물로 5번 씻습니다.
  5. 세포를 증류수로 덮고 현미경으로 관찰합니다. 이미지가 수집되면 접시에 있는 액체를 버리고 건조시킵니다. 그런 다음 각 웰에 2mL의 이소프로판올을 추가하고 오비탈 셰이커에 플레이트를 10분 동안 흔듭니다. 액체를 각 그룹에 16개의 웰이 있는 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 웰당 100μL를 추가합니다. 510nm(A510)에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하여 지질 함량을 계산합니다.

4. HepG2 세포 상층액의 총 트리글리세라이드에 대한 다양한 농도의 올레산의 효과

  1. 키트를 실온에서 20분 동안 평형화하고 실험에 필요한 플레이트를 준비합니다.
  2. 세포 상층액과 원심분리기를 1,570× g 에서 10분 동안 수집합니다. 표준 웰을 설정하고 샘플 웰을 테스트합니다. 50 μL의 표준물질([S0 → S5] 농도 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol/L)을 표준 웰에 추가합니다. 블랭크 웰 및 표준 웰 외에도 10μL의 다양한 시료를 시료 웰에 추가한 다음 각 웰에 40μL의 시료 희석제를 추가합니다. 각 웰에 100μL의 검출 항체-양 고추냉이 과산화효소를 추가하고 플레이트 멤브레인으로 밀봉한 다음 37°C에서 항온 오븐에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 상층액을 버리고 먼지가 없는 종이에 물기를 닦아낸 다음 각각 1x 세척액으로 잘 세척합니다. 실온에서 1분 동안 그대로 두십시오. 세탁 과정을 5번 반복합니다.
  4. 각 웰에 50μL의 기판 A와 50μL의 기판 B를 추가합니다. 부드럽게 섞고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 각 웰에 50μL의 터미네이션 용액을 추가하고 15분 이내에 450nm(A450)에서 각 웰의 OD 값을 측정합니다.
  5. x축을 따라 표준물질의 농도를 플로팅하고 y축을 따라 해당 흡광도(OD) 값을 플로팅하여 선형 회귀를 수행하고 곡선 방정식을 도출하여 각 샘플의 농도 값을 계산합니다.

5. 통계 분석

  1. 정량적 데이터에서 유의미한 차이를 확인할 수 있습니다.
  2. 평균± 표준 편차(SD)를 계산하고 데이터를 그래픽으로 표현합니다. P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

결과

세포 생존율에 대한 올레산의 효과
HepG2 세포는 다양한 농도의 OA(0mM, 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)에 노출되어 0mM에 비해 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM에서 세포 생존율이 감소했습니다. 통계적 유의성은 0.5mM(P < 0.05) 및 1mM(P < 0.05)에서 관찰되었습니다. CCK-8 키트로 평가한 OA가 세포 생존율에 미치는 영향은 그림 2에 나와 있습니다. OA-처리된 HepG2 세포...

토론

MASLD는 알코올 및 기타 확립된 간 손상 물질 이외의 요인으로 인해 간세포에 과도한 세포 내 지방 침착을 특징으로 하는 임상병리학적 증후군이다18. MASLD는 후천성 대사 스트레스 간 손상과 복잡하게 연결되어 있으며, 특히 인슐린 저항성 및 유전적 감수성과 관련이 있습니다. MASLD에 대한 약물을 효과적으로 연구하고 스크리닝하려면 적절한 실험 모델을 선택하는 것이 중요합니?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이번 연구는 2018년 내몽골 자치구 과학기술부 과학기술사업 지원사업의 '몽골 의학의 지역질병에 대한 쿠미스의 치료효과 핵심과제 연구'에 의해 부여되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm filterMillex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µm filterMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 Cell Culture FlaskCORNING430639
6-well cell culture plateCORNING3516
96-well cell culture plateCORNING3599
Blood Count PlateShanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.02270113
Cell Counting Kit-8 assaysBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. CA1210-1000T
CO2 incubatorNUAIRENU-5710E
 DMSO Dimethyl sulfoxide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco10099141
HepG2 cells lineBeijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instructionNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Inverted Microscope for Cell CultureLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured CellsBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. G1262
Oleic acid Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502071
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0Statistics software

참고문헌

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238 (2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476 (2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494 (2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541 (2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유