Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

Riepilogo

Questo protocollo è progettato per studiare l'entità del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA. In condizioni neutre, l'induzione di rotture del DNA può essere facilmente valutata in un breve lasso di tempo. Inoltre, il protocollo è adattabile ad altri tipi di cellule e a vari reagenti per lo stress di replicazione.

Abstract

La replicazione del DNA è costantemente messa alla prova da un'ampia varietà di fattori di stress endogeni ed esogeni che possono danneggiare il DNA. Tali lesioni riscontrate durante la duplicazione del genoma possono bloccare i replisomi e convertire le forcelle di replicazione in rotture a doppio filamento. Se non riparate, queste rotture tossiche del DNA possono innescare riarrangiamenti cromosomici, portando a una maggiore instabilità del genoma e a una maggiore probabilità di trasformazione cellulare. Inoltre, le cellule tumorali mostrano uno stress di replicazione persistente, rendendo il targeting delle vulnerabilità della forcella di replicazione nelle cellule tumorali una strategia attraente per la chemioterapia. Una tecnica altamente versatile e potente per studiare le rotture del DNA durante la replicazione è il saggio della cometa. Questa tecnica di elettroforesi su gel rileva in modo affidabile l'induzione e la riparazione di rotture del DNA a livello di singola cellula. In questo articolo, viene delineato un protocollo che consente ai ricercatori di misurare l'entità del danno al DNA nelle cellule umane che si dividono mitoticamente utilizzando agenti di stallo a forcella su più tipi di cellule. L'abbinamento di questo con il punteggio automatico delle comete facilita l'analisi rapida e migliora l'affidabilità nello studio dell'induzione delle rotture del DNA.

Introduzione

Il saggio della cometa è un metodo di elettroforesi su gel utilizzato per rilevare le rotture del DNA a livello di singola cellula. Si basa sul principio che le rotture aperte del DNA migrano in condizioni elettroforetiche, mentre il DNA intatto rimane in gran parte statico. Il DNA rotto migra perché le rotture provocano il rilassamento del DNA superavvolto, causando il suo graduale trasferimento spaziale verso l'anodo nella camera elettroforetica, che si traduce in un aspetto simile a una cometa osservato dall'immunofluorescenza ^1,2. L'entità del danno al DNA viene quindi misurata quantificando la quantità di....

Protocollo

Questo protocollo (Figura 1) utilizza principalmente linee cellulari tumorali U2OS aderenti, ma è adattabile a un'ampia varietà di cellule aderenti e in sospensione coltivate in coltura tissutale. Le soluzioni e i tamponi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei materiali

1. Prima del giorno dell'esperimento, mettere il flacone fornito con agarosio a basso punto di fusione (1% di agarosio a basso punto di fusione in PBS) in un bagno d....

Risultati

Analisi dell'induzione di rottura da parte di reagenti per stress di replicazione
Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 di mM idrossiurea (HU) o 100 nM di CPT per 4 ore e analizzate per l'accumulo di rottura mediante il test NC (Figura 6A). Mentre la CPT induce rotture durante la fase S bloccando la topoisomerasi-1¹³, la deplezione dei pool nucleotidici indotta da HU blocca le forcelle di replicazione che vengono progressivamente converti.......

Discussione

Questo protocollo delinea un saggio NC per valutare le rotture del DNA nelle cellule umane sottoposte a replicazione attiva. Il protocollo è relativamente semplice da eseguire e i ricercatori possono adattarlo facilmente a condizioni di pH elevato per le analisi alcaline⁸. Include due passaggi critici, come descritto nei passaggi 3.7 e 4.5. Nella fase 3.7, è essenziale diffondere uniformemente l'agarosio fuso con le cellule attraverso il pozzetto per evitare che le comete si sovrappongano durant.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001