Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

Riepilogo

Questo protocollo è progettato per studiare l'entità del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA. In condizioni neutre, l'induzione di rotture del DNA può essere facilmente valutata in un breve lasso di tempo. Inoltre, il protocollo è adattabile ad altri tipi di cellule e a vari reagenti per lo stress di replicazione.

Abstract

La replicazione del DNA è costantemente messa alla prova da un'ampia varietà di fattori di stress endogeni ed esogeni che possono danneggiare il DNA. Tali lesioni riscontrate durante la duplicazione del genoma possono bloccare i replisomi e convertire le forcelle di replicazione in rotture a doppio filamento. Se non riparate, queste rotture tossiche del DNA possono innescare riarrangiamenti cromosomici, portando a una maggiore instabilità del genoma e a una maggiore probabilità di trasformazione cellulare. Inoltre, le cellule tumorali mostrano uno stress di replicazione persistente, rendendo il targeting delle vulnerabilità della forcella di replicazione nelle cellule tumorali una strategia attraente per la chemioterapia. Una tecnica altamente versatile e potente per studiare le rotture del DNA durante la replicazione è il saggio della cometa. Questa tecnica di elettroforesi su gel rileva in modo affidabile l'induzione e la riparazione di rotture del DNA a livello di singola cellula. In questo articolo, viene delineato un protocollo che consente ai ricercatori di misurare l'entità del danno al DNA nelle cellule umane che si dividono mitoticamente utilizzando agenti di stallo a forcella su più tipi di cellule. L'abbinamento di questo con il punteggio automatico delle comete facilita l'analisi rapida e migliora l'affidabilità nello studio dell'induzione delle rotture del DNA.

Introduzione

Il saggio della cometa è un metodo di elettroforesi su gel utilizzato per rilevare le rotture del DNA a livello di singola cellula. Si basa sul principio che le rotture aperte del DNA migrano in condizioni elettroforetiche, mentre il DNA intatto rimane in gran parte statico. Il DNA rotto migra perché le rotture provocano il rilassamento del DNA superavvolto, causando il suo graduale trasferimento spaziale verso l'anodo nella camera elettroforetica, che si traduce in un aspetto simile a una cometa osservato dall'immunofluorescenza ^1,2. L'entità del danno al DNA viene quindi misurata quantificando la quantità di DNA rotto che è migrato rispetto al DNA compatto.

I due metodi di analisi delle comete più comunemente usati sono il saggio della cometa alcalina (AC) e il saggio della cometa neutra (NC). Il saggio AC viene eseguito in condizioni di denaturazione utilizzando una soluzione ad alto pH alcalino, mentre il test NC viene eseguito in una soluzione a pH neutro. Sia i saggi NC che AC possono rilevare in modo affidabile le rotture del DNA che si verificano nel nucleo. Tuttavia, la versione alcalina è vantaggiosa anche per rilevare i siti alcalino-labili³. Entrambi i formati del test richiedono l'uso di condizioni di lisi per garantire che il DNA sia privo di proteine prima dell'elettroforesi.

Questo test è un metodo semplice per rilevare le rotture del DNA e offre diversi vantaggi unici per determinare il danno al DNA cellulare. Il metodo è relativamente facile da configurare e richiede reagenti che possono essere preparati in laboratorio o acquistati da fornitori commerciali. Essendo una tecnica di risoluzione a singola cellula, il saggio richiede pochissimo materiale di partenza. In particolare, il test NC è in grado di misurare le rotture con un'elevata sensibilità, in grado di rilevare tra le 50 e le 10.000 rotture per cellula⁴. La versatilità di questa tecnica è dimostrata dalla sua vasta gamma di applicazioni, tra cui l'ecotossicologia⁵, il biomonitoraggio umano⁶ e gli studi di genotossicità⁷. Il test può anche essere utilizzato in modo affidabile su vari tipi di cellule e adattato per saggi ad alto rendimento⁸ e per la valutazione delle rotture in specifiche regioni genomiche⁹. Pertanto, questo test funge da tecnica rapida e affidabile per studiare la formazione di rotture a livello di singola cellula.

Il processo di replicazione del DNA è costantemente sfidato da diversi fattori di stress endogeni ed esogeni^10,11. Lo stallo dei replisomi a causa di tali lesioni può causare rotture del DNA e provocare una maggiore instabilità del genoma. Le rotture del DNA spesso si verificano anche come intermedi di replicazione per facilitare la riparazione del DNA¹². Inoltre, diversi agenti chemioterapici inducono rotture del doppio filamento replication-dipendenti (DSB), come la camptotecina (CPT)^13,14,15 e gli inibitori di PARP ^16,17. Pertanto, questo test funge da potente metodologia per studiare la natura delle lesioni del DNA, valutare l'elaborazione delle forcelle di replicazione e indagare il potenziale terapeutico degli agenti dannosi per il DNA. Gli adattamenti del test che comportano la marcatura del DNA di nuova sintesi con BrdU sono stati utili per studiare i fenotipi di stress associati alla replicazione 18,19,20,21. In particolare, il saggio NC è un metodo affidabile per studiare l'induzione della rottura del DNA nel contesto della replicazione, come dimostrato in studi che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine fork ^22,23, l'analisi degli intermedi di replicazione^24,25 e l'indagine dei conflitti di trascrizione-replicazione nel mantenimento del genoma^26,27. In questo articolo, delineiamo un protocollo di analisi NC con l'obiettivo di quantificare le rotture del DNA durante la replicazione nelle cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente implementato dai ricercatori interessati a valutare il danno associato allo stress di replicazione in un'ampia varietà di cellule umane in divisione.

Protocollo

Questo protocollo (Figura 1) utilizza principalmente linee cellulari tumorali U2OS aderenti, ma è adattabile a un'ampia varietà di cellule aderenti e in sospensione coltivate in coltura tissutale. Le soluzioni e i tamponi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei materiali

1. Prima del giorno dell'esperimento, mettere il flacone fornito con agarosio a basso punto di fusione (1% di agarosio a basso punto di fusione in PBS) in un bagno di acqua calda per 5-10 minuti per assicurarsi che l'agarosio si sia completamente sciolto.
   NOTA: Non riscaldare la bottiglia nel microonde.
2. Una volta fuso, aliquotare rapidamente 100 μL di agarosio in provette da centrifuga da 1,5 mL secondo necessità e conservare le provette a 4 °C. L'agarosio solidificato può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 anno.
3. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il numero richiesto di provette da centrifuga dalla conservazione a 4 °C. Sciogliere l'agarosio ponendo i tubi in un blocco termico o in un bagno d'acqua a 42 °C.
   NOTA: Posizionare le provette a 42 °C prima di prelevare le cellule per assicurarsi che l'agarosio sia completamente fuso per la risospensione (passaggio 3.7).
4. Preparare il tampone di lisi fresco e il tampone TAE il giorno dell'esperimento e conservarli rispettivamente a temperatura ambiente e a 4 °C fino al momento dell'uso. Inoltre, aliquotare 1x PBS in provetta conica da 15 mL e metterlo in frigorifero per utilizzarlo nella fase di risospensione (passaggio 3.5).
5. Contrassegnare le identificazioni dei campioni sull'estremità smerigliata dei vetrini a 2 pozzetti e conservarli a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

2. Preparazione dei campioni

1. Prima del giorno dell'esperimento, seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti e coltivare per una notte a 37 °C con il 5% di CO₂. Per le cellule U2OS, sono state seminate circa 2-3 x 10⁵ cellule per ogni campione.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare i numeri di cella a seconda del tipo di cella utilizzato per le analisi.
2. Il giorno dell'esperimento, trattare le cellule con le condizioni previste dal disegno sperimentale. Come controllo positivo per dimostrare l'induzione della rottura dipendente dalla replicazione, trattare le cellule con 1 μM di CPT per 1 ora. CPT è un inibitore della topoisomerasi-1 che induce rotture a doppio filamento in modo dipendente dalla replicazione¹⁴.

3. Risospensione e lisi cellulare

1. Aspirare i terreni di coltura cellulare e risciacquare due volte con 1x PBS.
2. Aggiungere 300 μL di tripsina a ciascun pozzetto. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2-3 minuti.
   NOTA: L'incubazione prolungata nella tripsina può generare risultati spuri durante le analisi delle comete.
3. Aggiungere 700 μl di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Risospendere delicatamente e trasferire i campioni in provette da centrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: Si consiglia di contare le cellule in questa fase per ottenere la densità appropriata delle celle nella fase 3.6 per ridurre la frequenza delle code sovrapposte durante l'analisi.
4. Centrifugare la sospensione in cella a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Aspirare il terreno e risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo.
6. Ripetere due volte i passaggi 3.4 e 3.5 e risospendere le cellule in 1x PBS freddo a una densità cellulare di 2 x 10⁵ cellule per ml.
   NOTA: Si raccomanda di valutare la vitalità cellulare in questa fase per garantire la presenza di un numero adeguato di cellule vitali. Si raccomanda una vitalità di almeno il 90%.
7. Risospendere 10 μl della sospensione cellulare in 100 μl di aliquota di agarosio fuso e, utilizzando lo stesso puntale della pipetta, mescolare delicatamente e distribuire uniformemente la miscela in un pozzetto del vetrino. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni in base alle esigenze.
   NOTA: Evitare di rimuovere tutte le aliquote dal bagnomaria a 42 °C in una sola volta per evitare che l'agarosio si solidifichi. Questo passaggio deve essere eseguito preferibilmente a bagnomaria e ogni campione viene risospeso e distribuito in modo scaglionato. Evitare di introdurre bolle durante la diffusione dell'agarosio sul vetrino poiché le sacche d'aria influenzeranno la migrazione delle code di cometa durante l'elettroforesi (passaggio 4.5) e introdurranno crepe nella fase di essiccazione (passaggio 5.3)
8. Conservare i vetrini a 4 °C al buio per 15-20 minuti per assicurarsi che l'agarosio si sia completamente solidificato (Figura 2A).
9. Posizionare i vetrini nei barattoli Coplin e immergerli nel tampone di lisi per 1 ora a temperatura ambiente.
10. Sciacquare una volta i vetrini con tampone TAE freddo e immergerli in tampone TAE freddo per 30 minuti a 4 °C.

4. Elettroforesi

1. Posizionare la camera elettroforetica su una superficie piana e livellare il sistema utilizzando le quattro manopole di livellamento sui bordi dell'apparato. Inserire gli impacchi freddi nella camera inferiore per mantenere la soluzione fredda durante l'elettroforesi.
2. Versare circa ~850 mL di tampone TAE 1x freddo nell'apparato.
3. Rimuovere i vetrini da 4 °C e posizionarli sul vassoio per elettroforesi con l'orientamento corretto per consentire la migrazione del DNA rotto.
   NOTA: Il vassoio contiene dieci vetrini a 2 pozzetti. Posizionare i vetrini al centro del vassoio se si lavora con un numero inferiore di campioni. Se si lavora con un numero dispari di diapositive, includere una diapositiva vuota in modo che ciascuna possa contenere 2 diapositive.
4. Posizionare delicatamente il vassoio per vetrini in dotazione sopra il vassoio per coprire i vetrini.
   NOTA: Per il corretto funzionamento dell'apparecchio, il volume del tampone TAE non deve essere inferiore alla superficie inferiore del rivestimento e non deve superare la superficie superiore del rivestimento.
5. Dopo aver collegato i cavi, impostare l'alimentazione a 21 V ed eseguire l'elettroforesi (1 V/cm) per 40 min.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare il tempo di elettroforesi a seconda del tipo di cella utilizzata per le analisi. Code lunghe nei campioni non trattati indicano un'autonomia eccessiva. Al contrario, le code corte nei campioni di controllo positivo possono riflettere un tempo di esecuzione insufficiente.

5. Colorazione

1. Dopo il completamento dell'elettroforesi, rimuovere i vetrini dall'apparecchio e immergerli in una soluzione di precipitazione del DNA per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Scartare la soluzione di precipitazione del DNA e immergere i vetrini in una soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Scartare la soluzione di etanolo al 70%. Rimuovere i vetrini e asciugarli in un forno di ibridazione a 45 °C per 30 minuti al buio (Figura 2B).
   NOTA: I vetrini possono essere lasciati in un luogo buio e asciutto durante la notte per la fase di asciugatura.
4. Incubare i pozzetti con 100 μl di 1x soluzione SYBR Green per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
5. Decantare la soluzione SYBR Green inclinando i vetrini e rimuovendo l'eccesso tamponando delicatamente il bordo del pozzetto con un panno privo di lanugine.
6. Mettere i vetrini in un cassetto e lasciare asciugare per 30 minuti.
7. Procedere con l'imaging dei vetrini.

6. Imaging e analisi

1. Configurare il microscopio per scopi di imaging.
   NOTA: Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza. È stato utilizzato un ingrandimento 10x con apertura numerica di 0,45 con un tempo di esposizione di 1/40 di secondo e un guadagno di +6 dB. La modalità di acquisizione monocromatica a 8 bit è stata utilizzata con binning 2 x 2 e correzione del bilanciamento del nero.
2. Posizionare i vetrini sul tavolino del microscopio e iniziare l'imaging utilizzando il filtro FITC.
   NOTA: Utilizzare prima il campione non trattato per testare il tempo di esposizione. La maggior parte delle cellule non presenta code di cometa poiché il DNA è più compatto. Passare al pozzetto con cellule trattate con CPT e ottenere l'immagine utilizzando lo stesso tempo di esposizione. In questo campione si osserveranno code di comete con lunghezze maggiori a causa della migrazione delle estremità del DNA rotte.
3. Acquisire immagini per almeno 100 comete per campione utilizzando lo stesso tempo di esposizione in tre repliche tecniche.
   NOTA: Le code delle comete alla fine dei vetrini coprioggetti tendono a migrare in modo non uniforme e ad agire come valori anomali nella distribuzione del campione. La maggior parte delle comete catturate per le analisi sono presenti vicino al centro del vetrino coprioggetti (Figura 3).
4. Esporta le immagini e assegna un punteggio alle comete manualmente (utilizzando l'immagine J) o utilizzando il software di punteggio delle comete disponibile gratuitamente. Le comete che sono distinguibili individualmente e completamente contenute nel campo visivo vengono selezionate per il punteggio. Le comete sovrapposte o parzialmente visibili non sono prese in considerazione per ulteriori analisi (Figura 4).
   NOTA: Gli utenti possono segnare le comete sull'immagine J utilizzando il seguente plugin: https://cometbio.org/index.html. I dettagli per il punteggio delle comete utilizzando il software CometScore sono inclusi nella Figura 5.
5. Tracciare i momenti di coda acquisiti dalle analisi come grafici a scatola e baffi che raffigurano valori percentili 10-90. Eseguire test di normalità per determinare se i test parametrici o non parametrici devono essere utilizzati per le analisi statistiche.
   NOTA: Nella maggior parte dei casi, i test non parametrici vengono applicati utilizzando il test di Mann-Whitney se si confrontano solo due campioni o il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn se si confrontano tre o più campioni.

Risultati

Analisi dell'induzione di rottura da parte di reagenti per stress di replicazione
Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 di mM idrossiurea (HU) o 100 nM di CPT per 4 ore e analizzate per l'accumulo di rottura mediante il test NC (Figura 6A). Mentre la CPT induce rotture durante la fase S bloccando la topoisomerasi-1¹³, la deplezione dei pool nucleotidici indotta da HU blocca le forcelle di replicazione che vengono progressivamente converti...

Discussione

Questo protocollo delinea un saggio NC per valutare le rotture del DNA nelle cellule umane sottoposte a replicazione attiva. Il protocollo è relativamente semplice da eseguire e i ricercatori possono adattarlo facilmente a condizioni di pH elevato per le analisi alcaline⁸. Include due passaggi critici, come descritto nei passaggi 3.7 e 4.5. Nella fase 3.7, è essenziale diffondere uniformemente l'agarosio fuso con le cellule attraverso il pozzetto per evitare che le comete si sovrappongano durant...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Gibco	14190144
Camptothecin	Selleckchem	S1288
Comet LMAgarose (LMA)	R&D systems	4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System II	R&D systems	4250-050-ES	Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay
CometScore software	TriTek		open-sourced
CometSlide	R&D systems	4250-050-03
DMEM, high glucose	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	FisherSci	D128-4
Epifluorescence microscope	Keyence	BZ-X810
Fetal Bovine Serum - Premium	Bio-Techne	S11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
GraphPad Prism 10.0	GraphPad
HEK293T cells	ATCC	CRL-11268
hTERT-RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000
Hydroxyurea	Millipore Sigma	H8627
PARP inhibitor Olaparib	Selleckchem	S8096
PowerPac	FisherSci	FB300Q
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate	FisherSci	FB012927
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)	FisherSci	S7567
U2OS cells	ATCC	HTB-96
UVP HB-1000 Hybridization Incubator	FisherSci	UVP95003001