JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Özet

Kanser kök hücreleri (CSC) tümörigenez, tedaviye direnç ve tekrarlayan hastalıklardan sorumlu kendi kendini yenileme ve plastisite ile küçük bir popülasyondur. Bu popülasyon yüzey belirteçleri, enzimatik aktivite ve fonksiyonel profil ile tanımlanabilir. Bu yaklaşımlar, henotibik heterojenlik ve CSC plastisite nedeniyle sınırlıdır. Burada, meme ve jinekolojik kanserlerden CSC küreleri elde etmek, fonksiyonel özellikleri, CSC belirteçleri ve protein ekspresyonu değerlendirmek için küre oluşturan protokolü güncelliyoruz. Küreler, süspansiyon kültüründe düşük yoğunlukta tek hücreli tohumlama ile, göç ve agregaları önlemek için yarı katı metilselüloz orta kullanılarak elde edilir. Bu karlı protokol kanser hücre hatlarında değil, primer tümörlerde de kullanılabilir. Tümör mikroçevresini taklit ettiği düşünülen üç boyutlu non-yapışık süspansiyon kültürü, özellikle CSC-niş, epidermal büyüme faktörü ve temel fibroblast büyüme faktörü ile csc sinyalizasyon sağlamak için desteklenmektedir. CSC'nin sağlam bir şekilde tanımlanmasını hedefleyen, fonksiyonel ve henotipik değerlendirmeyi birleştiren tamamlayıcı bir yaklaşım öneriyoruz. Küre oluşturma kapasitesi, kendini yenileme ve küre projeksiyon alanı CSC fonksiyonel özellikleri oluşturur. Ayrıca, karakterizasyon, ALDH göz önünde bulundurularak CD44+/CD24- ve CD133 ve Western blot ile temsil edilen işaretçilerin akış sitometri değerlendirmesini içerir. Sunulan protokol ayrıca, çevirisel araştırmalar için yararlı olan bir örnek sindirim prosedürü nden sonra primer tümör örnekleri için optimize edildi.

Giriş

Kanser popülasyonları heterojendir, farklı morfolojiler, proliferasyon ve invazyon kapasitesi sunan hücreler, diferansiyel gen ekspresyonuna bağlı olarak. Bu hücreler arasında, bir azınlık popülasyon kanser kök hücreleri adlı var (CSC)1, kendi kendini yenileme kapasitesine sahip, primer tümör niş heterojenite recapitulating ve homeostatik kontrollere yeterince yanıt vermez anormal ayırt edici ataları üreten2. CSC özellikleri doğrudan klinik uygulamada tercüme edilebilir, olaylar ile ilişki göz önüne alındığında, tümörijenite veya kemoterapi direnci gibi3. CSC'nin tanımlanması, yüzey belirteçlerinin tıkanmasını, CSC farklılaşmasının teşvikini, CSC sinyal yol bileşenlerinin engellenmesini, niş yıkımını ve epigenetik mekanizmaları içerebilir hedefli tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir4.

CSC izolasyonu hücre hatlarında ve primer tümör örneklerinde5,6,7,8olarak gerçekleştirilmiştir. CSC için tanımlanan fonksiyonel profil klojenik kapasite, yan popülasyon ve tümöroferoluşumunuiçerir 9 . CD44yüksek/ CD24düşük fenotip sürekli meme CSC ile ilişkili olmuştur, hangi in vivo tümörijenik olduğu kanıtlanmıştır ve zaten mezenkimal geçiş epitel ile ilişkili olmuştur5,10. Yüksek ALDH aktivitesi de solid tümörlerin çeşitli tiplerinde kalsuk ve mezenkimal geçiş (EMT) epitelyal ile ilişkili olmuştur11. ALDH ekspresyonu kemoterapiye direnç ve CSC fenotip in vitro12,13,14,15,16ile ilişkili olmuştur. Cd133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 ve diğerleri gibi farklı tümör türlerinde CSC özelliklerine eklenmiştir.

Tümör küreleri çalışma ve CSC genişlemesi için üç boyutlu bir model oluşur. Bu modelde, hücre hatları ve kan veya tümör örneklerinden hücre süspansiyonları büyüme faktörleri ile desteklenen bir ortamda yetiştirilmektedir, yani epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), fetal sığır serum olmadan ve non-adherent koşullarda17. Hücre adezyonunun inhibisyonu, farklılaşmış hücrelerin anoikis tarafından ölümle sonuçlanır18. Küreler izole bir hücrenin klonal büyüme türetilmiştir. Bu amaçla, hücreler hücre füzyonu ve toplama önlemek için düşük yoğunlukta dağıtılır19. Başka bir strateji yarı katı metilselüloz kullanımını içerir20.

Küre oluşturan protokol CSC izolasyon ve genişleme popülerlik kazandı, zaman ve maliyet ve teknik nedeniyle, karlı, ve tekrarlanabilir nedenlerle21,22. Küre oluşumunun CSC'yi ne ölçüde yansıttığına dair bazı rezervlere rağmen, kök hücrelerin doğal mikroçevreye benzeyen karakteristik fenotip ile yapışık olmayan koşullarda büyüme eğilimi vardır21. CSC'nin katı tümörlerden izole edilmesi için kullanılan yöntemlerin hiçbiri tam bir verime sahip değildir ve daha spesifik belirteçler veya metodoloji ve belirteç kombinasyonları geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.

Bu protokolde, CSC'nin küre oluşturan protokolle izolasyonu, yapışık olmayan koşullarda tek hücreli büyüme prensibi ve farklılaştırılmış fenotip üretme kapasitesi ile ayrıntılarıyla açıklanmaktadır. Bu yordamın şematik bir gösterimi Şekil 1'detemsil edilir. Ayrıca meme ve jinekolojik tümör hücreleri hatları ve primer tümör örnekleri için, csc için yüzey belirteçleri ve ALDH ekspresyonu ile karakterizasyonu açıklıyoruz.

Protokol

Bu protokol Coimbra Hastanesi ve Universitary Center (CHUC) Tümör Bankası'nın etik kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi ve CHUC'nin Sağlık Etik Komitesi ve Portekiz Ulusal Veri Koruma Komisyonu tarafından onaylandı.

1. Sürekli Hücre Kültürlerinden Küre Oluşturan Protokol ve Türemiş Yapışık Popülasyonlar

NOT: Tüm prosedürleri katı steril koşullar altında gerçekleştirin.

  1. Büyüme yüzeyini poli (2-hidroksietil-metakrilat (poli-HEMA) ile kaplayarak yapışmaz süspansiyon kültür şişelerinin veya plakalarının hazırlanması
    1. Poli-HEMA'yı 65 °C'de mutlak etanolde karıştırarak 15 mg/mL çözeltihazırlayın. 50 μL/cm2ile Coat hücre kültürü şişeleri veya plakaları .
    2. Kurutma fırınında 37 °C'de kurumaya bırakın. Gerekirse, plakaları sarın ve oda sıcaklığında saklayın.
  2. Küre kültür ortamının hazırlanması (SCM)
    1. Ultra saf suda %2 oranında metilselüloz çözeltisi hazırlayın ve otoklavda sterilize edin. Metilselüloz soğutma ile solubilize etmek daha kolay olma eğilimindedir; bu nedenle tozu 80 °C'de suda dağıtın ve23dereceye kadar karıştırın.
    2. SCM'nin iki kez konsantre çözeltisini (stok çözeltisi) hazırlayın. SCM çalışma solüsyonu 100 mM putrescine, %1 insülin, transferrin, selenyum ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyon (10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amphotericin B) ile takviye edilmiş DMEM-F12 içerir.
    3. SCM'yi hazırlamak için, eşit hacimlerde SCM stok çözeltisini %2'lik metilselüloz çözeltisi ile karıştırın.
    4. 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EFG) ve 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyerek kullanımdan hemen önce ortamı tamamlayın.
    5. Daha titiz hücre hatları kullanılıyorsa, orta yı %0.4 büyükbaş serum albumin ile tamamlayın, bu da bir avantaj olabilir.
  3. MCF7 veya HCC1806 meme kanseri veya ECC-1 veya RL95-2 endometrial kanser hücreleri (veya tercih diğer kanser hücresi hattı) bir şişe ile başlayın% 80 ila% 90 biraraya.
  4. Hücre kültürü ortamını atın, fosfat tamponlu tuzlu çözelti (PBS) ile yıkayın ve hücreleri tripsin-EDTA (75 cm2 hücre kültürü şişesi için 1 ila 2 mL) ile ayırın.
  5. Hücre kültürü ortamı (75 cm2 hücre kültürü şişesi için 2 ila 4 mL) ve 200 x g'de 5 dk enzimleri atmak için santrifüj ekleyin.
  6. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre kültürü ortamı ve pipet yukarı ve aşağı bilinen bir hacimde pelet askıya alın. Bu amaçla 40 μm hücreli süzgeç kullanılabilir.
  7. Hemositometredeki hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonunu hesapla. Tek bir hücre süspansiyonunun gözlemlemesini sağlamak için bu adımdan yararlanın. Dikkatli hücre sayma doğru tedavilerin etkilerini ölçmek için gereklidir.
  8. SCM tam orta hücre süspansiyon belirlenen miktarda askıya ve poli-HEMA kaplı yemekler transfer. Tohumlama yoğunluğu için bir referans değer olarak, 500-2000 hücreleri / cm2düşünün.
    NOT: Her hücre hattı için tohumlama yoğunluğu ve kültür zamanının optimizasyonu şiddetle tavsiye edilir24.
  9. Plakaları bozmadan 2 gün boyunca 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
  10. Hücre kültürü ortamına 10 ng/mL EFG ve 10 ng/mL bFGF ekleyerek büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun yeniden oluşturulması. Bu adımı iki günde bir tekrarlayın.
  11. 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatsın ve kaplamadan 5 gün sonrasına kadar (hücre hattına göre bu durum 3 ila 12 gün arasında değişebilir) küreler elde edin ve bu da süspansiyon topu şeklindeki hücre kolonilerinin morfolojisini sunar.
  12. Deneyler için boru lama ile küreleri kullanın veya toplayın.
  13. Türemiş bağlı popülasyonları elde etmek için küreleri kullanılan hücre çizgisine göre standart kültür koşullarına yerleştirin. 1-2 gün sonra, yapışık küreler etrafında büyüyen ve hücre nin menşe hattına benzer bir morfoloji sunan tek katmanlı hücreleri gözlemlemek mümkündür.

2. İnsan Tümör Örneklerinden Küre Oluşturan Protokol

NOT: Araştırma amacıyla insan örneklerinin kullanılması her ülkenin mevzuatına uygun olmalı ve ilgili Kurumların Etik Komitesi tarafından onaylanmalıdır.

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %2 antibiyotik antimikotik solüsyon (10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amphotericin B) ile desteklenen DMEM/F12 içeren taşıma ortamını hazırlayın.
  2. %10 FBS, %1 antibiyotik antimikotik solüsyon, 1 mg/mL tip IV kollajenaz ve 100 μg/mL DNaAse I ile desteklenen DMEM/F12 içeren sindirim ortamını hazırlayın.
  3. %10 FBS ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyon (10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amphotericin B) ile desteklenen DMEM/F12 içeren enzim inaktivasyon ortamını hazırlayın.
  4. Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi SCM'yi hazırlayın.
  5. Cerrahi çıkarma işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede ameliyat parçasının makroskopik çalışması sırasında numune alın.
  6. Numuneleri taşıma ortamına yerleştirin ve işlenmesi için laboratuvara aktarın. Yordamın başarı oranını artırmak için toplamayı takip eden 1 saat içinde numune işlemeye başlanmalıdır. Örnek toplamaya dikkat edin. Örnekleri dikkatlice ele alın. Nekrotik veya körüterize bölgelerin kullanımından kaçının.
  7. Steril akış odasının altında, numuneyi bir tabağa aktarın ve neşterle daha küçük parçalara (yaklaşık 1 mm3)bölün.
  8. İnsan dokusunu bir tüpte, 37 °C'de 180 dk'ya kadar dönen bir çalkalayıcıile sindirimi ortama yerleştirin. Bu tüpü Tüp A olarak tanımlayın.
  9. Enzim çözeltisini her 15 dakikada bir değiştirin.
    1. Sindirim ortamını toplayın (doku parçalarını çıkarmadan) ve 40 μm'lik hücresüzden enzim inaktivasyon mediasıyla yarı dolu yeni bir tüpe aktarın. Bu tüpü oda sıcaklığında koruyun ve Tüp B olarak tanımlayın.
    2. Tüp A'ya yeni sindirim ortamı ekleyin ve 37 °C'de dönen çalkalayıcıya geri döndürün.
    3. Her koleksiyonda, trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre nin canlılığını kontrol edin.
    4. Bu yordamı 180 dk veya hücre sayısı önemli ölçüde daha düşük olana kadar tekrarlayın.
  10. A Tüpündeki doku parçalarını, eşit miktarda accutase ve tripsin-EDTA içeren ikinci bir sindirim çözeltisi halinde, 37 °C'de 10 dakika karıştırarak inkübiredin.
  11. Enzim inaktivasyon ortamını Tüp A'ya ekleyin ve içindekileri 40 μm'lik hücresüzden B Tüpüne süzün.
  12. 10 dk için 200 x g Tüp B hücre süspansiyon santrifüj.
  13. SCM pelet askıya ve bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu kontrol edin.
  14. SCM'de belirlenen hücre süspansiyonmiktarını askıya alın ve 4000 hücre/cm2tohumlama yoğunluğuna sahip poli-HEMA kaplamalı yemeklere (bkz. adım 1.1) aktarın.
  15. Plakaları bozmadan 2 gün boyunca 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
  16. Hücre kültürü ortamına 10 ng/mL EFG ve 10 ng/mL bFGF ekleyerek büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun yeniden oluşturulması.
    NOT: Bunu iki günde bir yapmalısınız.
  17. 37 °C ve %5 CO 2'de, süspansiyon topu şeklindeki hücre kolonilerinin morfolojisini sunan küreler elde etmek için kaplamadan 5 gün sonrasına kadar (bu 12 güne kadar değişebilir) kuluçkaya yatırın.

figure-protocol-7498
Şekil 1: İnsan endometriyal tümör örneklerinden (A) ve meme ve jinekolojik kanser hücre hatlarından (B) kanser kök hücrelerinin alınması. İnsan tümör örnekleri parçalanmış, enzimatik olarak sindirilmiş ve poli-HEMA kaplı tabaklara küre culturing ortamda kaplanır. Kanser hücre hatları ayrılır, hücre süspansiyonları sayılır ve tek hücreler uygun koşullar altında poli-HEMA kaplı plakalar içine düşük yoğunlukta dağıtılır. Elde edilen küreler, bağlı kültür koşullarına yerleştirildiğinde, elde edilen taraftar popülasyonları üretirler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Küre Oluşturma Kapasitesi, Kendini Yenileme ve Küre Projeksiyon Alanı

NOT: Küre oluşturma kapasitesi, tümör hücre popülasyonunun küre üretme yeteneğidir. Kendini yenileme, küre hücrelerinin süspansiyon da küresel hücrelerin yeni koloniler üretmek için yeteneğidir. Küre projeksiyon alanı küre tarafından işgal edilen alanı temsil eder ve bu nedenle belirli bir zaman diliminde geçirdiği boyut ve hücre bölünmesi sayısını ifade eder.

  1. Küre oluşturma kapasitesinin belirlenmesi
    1. Küre oluşturma protokolü tamamlandıktan sonra, 5 dakika boyunca 125 x g bir santrifüj tüp ve santrifüj küreler toplamak.
    2. SCM'yi atın ve bilinen taze ortam hacminde peleti nazikçe askıya alın. Saymayı kolaylaştırmak için küreleri yoğunlaştırmak amacıyla, küreleri küçük bir ortam hacminde askıya alın. Küreleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
    3. Çapı 40 μm'den fazla olan küreleri saymak için hemositometre kullanın. Alternatif olarak, küreler bir graticule25 ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak veya otomatik bir sistem26,27kullanılarak plaka üzerinde doğrudan sayılabilir.
    4. Elde edilen kürelerin yüzde oranını, başlangıçta kaplanmış hücre sayısına göre hesaplayın.
  2. Kendini yenilemeyi belirleme
    1. Küre oluşturma protokolü tamamlandıktan sonra, 5 dakika boyunca 125 x g bir santrifüj tüp ve santrifüj küreler toplamak.
    2. Küre culturing medya atın ve yavaşça trippsin-EDTA pelet askıya.
    3. 37 °C'de 5 dk'ya kadar kuluçkaya yatırın.
    4. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için enzim inaktivasyon ortamı ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin.
    5. Bir hemositometre ve trippan mavi dışlama yöntemi kullanarak, süspansiyon canlı hücreleri saymak.
    6. Bölüm 1'de açıklandığı gibi küre oluşturma protokolünü başlatın.
    7. 8 gün sonra, çapı 40 μm'den fazla olan küreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
    8. Elde edilen kürelerin yüzde oranını, başlangıçta kaplanmış hücre sayısına göre hesaplayın.
  3. Küre projeksiyon alanının belirlenmesi
    1. Küreler tarafından işgal edilen alanı değerlendirmek için, görüntü edinme modülü ile donatılmış ters bir mikroskopta, her koşul da en az 10 rasgele alanın görüntülerini elde edin. 100X ile 400X arasında büyütme önerilir.
    2. ImageJ yazılımı28gibi görüntüleme yazılımlarını kullanarak kürelere karşılık gelen ilgi alanlarını çizerek ve alanını piksellerde ölçerek görüntüleri analiz edin.
    3. Piksellerin ortalama alanı olarak küre projeksiyon alanını hesaplayın.

4. Akış Sitometri ile Kanser Kök Hücre Marker Değerlendirmesi

NOT: CD44+/CD24-/düşük fenotip sürekli meme ve jinekolojik kanser kök hücreleri ile ilişkili idi. Açıklanan yordam, bu ve diğer hücre yüzeyi işaretleyicilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

  1. Küre oluşturma protokolü tamamlandıktan sonra, 5 dakika boyunca 125 x g bir santrifüj tüp ve santrifüj küreler toplamak.
  2. SCM atın ve yavaşça tripsin-EDTA pelet askıya.
  3. 37 °C'de 5 dk'ya kadar kuluçkaya yatırın.
  4. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için enzim inaktivasyon ortamı ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin.
  5. 5 dk için 125 x g santrifüj, supernatant atın ve yavaşça PBS hücreleri askıya.
  6. Membran konformasyonunun geri kazanılması için hücrelerin 30 dakika süspansiyon içinde dinlenmesine izin verin.
  7. Bir hemositometre ve trypan mavi dışlama yöntemi kullanarak, süspansiyon hücreleri saymak.
  8. Hücre süspansiyon hacmini 106 hücre/500 μL olarak ayarlayın.
  9. Tedarikçilerin talimatlarına göre monoklonal antikorlarla (konsantrasyon, zaman, sıcaklık ve ışık/karanlık) kuluçkaya yatırın ve Tablo 2'de gösterilen deney seti veya Tablo 1'deverilen belirteçler göz önünde bulundurularak .
  10. Boyamadan hemen sonra, akış sitometrik analizini uygun algılama modülleri içeren bir akış sitometresi kullanarak gerçekleştirin.
  11. EuroFlow Konsorsiyumu29tarafından kurulan protokolleri izleyerek sitometre kurulumünü standartlaştırın.
  12. Enkaz ve ölü hücreler hariç ileri ve yan dağılıma dayalı birincil kapıları ayarlayın. Bu, ek V ile birlikte etiketleme ve negatif hücreleri gating ile geliştirilebilir.
  13. Lekelenmemiş numunelere dayalı floresan kapıları ayarlayın ve tek lekeli kontroller kullanarak spektral örtüşme için tazminat.

5. Batı Blot ile Kanser Kök Hücre Marker Değerlendirmesi

NOT: ALDH1 aktivitesine ek olarak, bu belirteç yüksek ekspresyon sürekli meme ve jinekolojik kanser kök hücreleri ile ilişkili13,14. Açıklanan yordam, bu ve diğer hücre işaretleyicileri değerlendirmek için kullanılabilir.

  1. Küre oluşturma protokolü tamamlandıktan sonra, 5 dakika boyunca 125 x g bir santrifüj tüp ve santrifüj küreler toplamak.
  2. Tüm hücre lisatlarının hazırlanması
    1. Santrifüj tüplerini buzüzerine yerleştirin ve peleti bozmadan süpernatantı atın.
    2. Peleti 1 mL soğuk PBS ile yıkayın ve santrifüj ile atın.
    3. RIPA lysis tampon30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1.50 mM pH 7.4, Triton-X100 1% vol./vol., sodyum deoksikolik asit 0.5% wt./vol., sodyum dodecyl sülfat 0.5% wt./vol.) cOmplete Mini ve dithiothreitol 1 mM ile desteklenmiştir.
    4. Numuneleri soğuk (buz üzerinde) koruyarak, %30 genlik ile girdap ve sonication gönderin.
    5. 4 °C'ye ayarlanmış soğutulmuş santrifüjde 14.000 x g'da 15 dk için numuneleri santrifüj edin.
    6. Süpernatantları yeni, düzgün tanımlanmış mikrotüplere aktarın.
    7. BCA veya Bradford tahlilleri kullanarak protein konsantrasyonlarını belirlemek31.
    8. Gerekirse numuneleri batı leke analizine kadar -80 °C'de saklayın.
  3. Örnek denatürasyon, elektroforez, elektron transferi ve protein algılama standart batı blotlama protokollerine göre gerçekleştirmek, açıklandığı gibi32,33,34.

Sonuçlar

Küre oluşturma protokolü, küresel kolonilerin birkaç endometriyal ve meme kanseri hücre hattından süspansiyon içinde(Şekil 2A)veya insan tümör örneklerinden doku ların nazik enzimatik sindiriminden sonra elde edilmesine olanak sağlar (Şekil 2E). Her iki durumda da kaplamadan birkaç gün sonra süspansiyonlu monoklonal küresel koloniler elde edilir. Hem endometrial hem de meme kanseri küreleri, hücre nin menş...

Tartışmalar

Bu protokol, kanser hücre hatları ve birincil insan örneklerinden tümör küreleri elde etmek için bir yaklaşım ayrıntıları. Tümörküreler kök hücre benzeri özelliklere sahip bir alt popülasyonda zenginleştirilmiştir36. CSC'deki bu zenginleştirme, ankrajsız bir ortamda canlılığa bağımlıyken, farklılaşmış hücreler37. Süspansiyon uyguluyor düşük bir yapışma ortamında tümör hücrelerinin birincil kaplama olarak kendi kendine yenileme (k?...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Portekiz Jinekoloji Derneği tarafından 2016 Araştırma Ödülü ve CIMAGO tarafından finanse edilmiştir. Cnc. IBILI, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (UID/NEU/04539/2013) ve FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440) tarafından finanse edilmektedir. CHUC Etik Sağlık Komitesi ve Portekiz Ulusal Veri Koruma Komisyonu tarafından onaylanan Coimbra Hastanesi ve Universitary Center (CHUC) Tümör Bankası, kurumun Jinekoloji Servisi'nde takip edilen hastaların endometrial örneklerinin kaynağı oldu. Şekil 1 Servier Tıp Sanatı kullanılarak üretildi, www.servier.com.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibodySanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Antibiotic antimycotic solutionSigmaA5955
BCA assayThermo Scientific23225Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albuminSigmaA9418
CD133 antibodyMiteny Biotec293C3-APCAllophycocyanin (APC)
CD24 antibodyBD Biosciences658331Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibodyBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Cell strainerBD Falcon35234040 µM
Collagenase, type IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
ECC-1ATCCCRL-2923Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factorSigmaE9644
Fibroblast growth factor basicSigmaF0291
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium SolutionGibco41400045
MCF7ATCCHTB-22Human mammary adenocarcinoma cell line
MethylcelluloseAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylateSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acidJMSEINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfateSigma436143
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan blueSigmaT8154
Trypsin-EDTASigmaT4049
ß-actin antibodySigmaA5316

Referanslar

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells?. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. . Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. . Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics?. PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 157neoplastik k k h crelermeme t m rlerit m r k relerijinekolojik kanserk re olu turma protokolkanser k k h cre belirte leri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır