JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Bu protokol, insan M1 veya M2 polarize makrofajlardaki Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunu, periferik-kan monositlerinin GFP etiketli virülan strain H37Rv ile enfekte olan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasına dayanan ve seçilen M1/M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen bir yöntem sağlar.

Özet

İnsan makrofajları hücre içi Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonunun birincil konak hücreleridir ve bu nedenle tüberkülozun (TB) immün kontrolünde merkezi bir role sahiptir. Miyelod türevi hücrelerin M1 (klasik olarak aktive edilmiş) veya M2 (alternatif olarak aktive edilmiş) makrofaj benzeri hücrelere immün polarizasyonunu, çeşitli makrofaj alt kümelerinde yeşil floresan protein (GFP) etiketli Mtb'nin görselleştirilmesini ve derin karakterizasyonunu sağlayan 10 renkli akış sitometri paneli ile değerlendirme yoluyla takip etmek için deneysel bir protokol oluşturduk. Sağlıklı kan bağışçılarından elde edilen monositler, granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) veya makrofaj-koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile farklılaşma ve ardından sırasıyla IFN-γ ve lipopolisakkarit (LPS) veya IL-4 ile polarizasyon kullanılarak M1 veya M2 hücrelerine polarize edildi. Tamamen polarize edilmiş M1 ve M2 hücreleri, müstakil Mtb ile enfekte makrofajlar enfeksiyon sonrası 4 veya 24 saat akış sitometrisi ile lekelendiden önce 4 saat boyunca Mtb-GFP ile enfekte edildi. Akış sitometrisi ile örnek alımı gerçeklendi ve veriler akış sitometrisi analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi. Tekdüzen Manifold Yaklaşım ve Projeksiyon (UMAP) ile manuel gatingin yanı sıra boyutsallık azaltma ve fenograf analizi yapıldı. Bu protokol, enfekte olmayan M1 hücrelerinde cd64, CD86, TLR2, HLA-DR ve CCR7 seviyelerinin yükselmesiyle karakterize etkili M1/M2 polarizasyonuna neden olurken, enfekte olmayan M2 hücreleri CD163, CD200R, CD206 ve CD80'in güçlü bir yukarı regülasyonunu sergiledi. M1 polarize hücreler tipik olarak M2 polarize hücrelere kıyasla daha az bakteri içeriyordu. Mtb enfeksiyonundan sonra birkaç M1/M2 belirteci küçültülmüştür, bu da Mtb'nin makrofaj polarizasyonunu modüle atedebileceğini göstermektedir. Ayrıca, farklı boyutlardaki 24 farklı hücre kümesinin, enfeksiyon sonrası 24 saat boyunca M1 ve M2 enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş hücreler arasında benzersiz bir şekilde dağıtıldığı bulunmuştur. Bu M1/M2 akış sitometrisi protokolü Mtb-makrofaj araştırmalarında omurga olarak kullanılabilir ve farklı araştırma alanlarındaki özel ihtiyaçlar için benimsenebilir.

Giriş

Makrofajlar, doku homeostazının, iltihabın ve hastalık patolojilerinin düzenlenmesine önemli ölçüde katkıda bulunan bağışıklık hücreleridir. Doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir bileşeni olan hücrelerin monosit-makrofaj soyu, plastisitelerini ve farklı anatomik ve immünolojik konumlara adaptasyonlarını yansıtan değiştirilmiş çevresel ipuçlarına yanıt olarak heterojen fenotipleri ifade eder1. Mikroçevrimde bulunan büyüme faktörlerine, sitokinlere ve diğer aracılara bağlı olarak, makrofajlar, her biri bakteriyel kontrol ve boşlukta farklı bir role sahip iki ana geri dönüşümlü popülasyona kategorize edilmiştir2: pro-enflamatuar, klasik olarak aktive edilmiş M1 polarize makrofajlar ve başlangıçta T yardımcı (Th) hücre isimlendirmesini taklit etmek için adlandırılan anti-enflamatuar, alternatif olarak aktive edilmiş M2 polarize makrofajlar3. Makrofaj aktivasyonu ve farklılaşması doğrusal olmadığı için, immün polarize makrofajların bu gruplanması genellikle basit olarak kabul edilir, ancak daha doğru bir şekilde, her popülasyonun hastalık gelişimi ve ilerlemesi sonucu4, 5,6,7'de farklı özelliklere ve işlevsel rollere sahip olduğu bir süreklilik olarak gösterilmiştir. Bununla birlikte, M1/M2 makrofaj modeli ile birkaç farklı araştırma alanında kullanılabilecek çok sayıda deneysel avantaj vardır.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tüberkülozun (TB) etken maddesidir ve her saniye bir kişiye bulaştığı tahmin edilmektedir ve dünyanın en ölümcül tek enfeksiyöz ajanı olarak kabul edilmektedir (Küresel TB raporu 2019). Solunum yolu Mtb enfeksiyonunun ana yolu olduğundan, alveolar makrofajlar Mtb ile enfekte olmak için tercih edilen konak hücrelerdir ve akciğerlerde Mtb için hem birincil bariyerleri hem de enfeksiyöz rezervuarı temsil eder. Farklı uyaranlara yanıt olarak makrofaj polarizasyonu7 yıl boyunca ve yayınlanan çalışmaların çoğunda kapsamlı bir şekilde incelenmiştir, Monosit kültürlerinin in vitro M1 polarizasyonu IFN-γ ve LPS8,9ile birlikte Granülosit-Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktörü (GM-CSF) tarafından indüklenirken, M2 polarizasyonu Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktörü (M-CSF) ve IL-4 10,11ile indüklenmiştir. M1 makrofajları hücre içi patojenlere karşı antimikrobiyal yanıtlara aracılık eden ve antitümör bağışıklıkta önemli bir role sahip güçlü efektör hücrelerdir12. Öte yandan, M2 makrofajları anti-enflamatuar bir işleve, yüksek fagositik kapasiteye sahiptir ve esas olarak yara iyileşmesi ve doku onarımının yanı sıra parazit enfeksiyonlarında da yer almaktadır12. Buna göre, M1 makrofajları Mtb'nin hücre içi kontrolünde M2 makrofajlara göre daha etkili olarak görülür13. Bununla birlikte, Mtb bakterileri ayrıca doğuştan gelen bağışıklığı14 , 15 , 16,17'yiyıkmak için makrofaj polarizasyonunu modüle etmepotansiyelinesahiptir.

Periferik kan18'denelde edilen monositlerin farklılaşmasından makrofajlar üretmek yaygın olsa da, makrofajlar indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler)19 veya farelerden kemik iliği türevi makrofajlardan da üretilebilir20,21. Bunlar, monosit/makrofaj progenitörlerinden elde edilen ve olgun makrofaj benzeri hücrelerin homojen popülasyonuna çoğalacak ve farklılaşacak birincil makrofaj hücrelerini incelemek için uygulanabilir tekniklerdir. Bununla birlikte, bu protokoller nadiren elde edilen hücrelerin fenotipi ve işlevi hakkında derinleşmiş bilgi sağlar veya in vivo elde edilen makrofajlar arasında gözlenen doğal heterojenliği hesaba katmaz. Mtb sıkı bir insan patojeni olduğundan, Mtb'yi insanlaştırılmış model sistemlerinde incelemenin de bir avantajı vardır. Akış sitometrisi, süspansiyon22'dekitek hücrelerin birden fazla fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini değerlendirme imkanı sunan güçlü bir teknolojidir Otofluoresan 23,24olarak da bilinen makrofajlar gibi yapışan hücrelerle oldukça zor olabilecek bir şey. Sıkı yapışan makrofajların kimyasal müfrezesine ek olarak, Mtb enfeksiyonu, Mtb ile enfekte makrofajların akış sitometrik analizlerinde başka bir karmaşıklık seviyesi ekleyen hücrelere önemli bir stres faktörü oluşturabilir.

Bu deneysel protokolde, virülan laboratuvar Mtb strain H37Rv ile enfekte olan primer periferik-kan-monosit türevi hücrelerin immün polarizasyonuna dayanan ve seçilen M1 ve M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen daha önce kurulmuş bir insan makrofaj enfeksiyonu modeli kullandık25. Bu protokol, M1 veya M2 polarize monosit türevli makrofajlarda Mtb enfeksiyonuna verilen yanıtları incelemek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ek olarak, yapışan Mtb ile enfekte makrofajlarda akış sitometrisi kullanımı, geleneksel M1 ve M2 makrofajları ile ilişkili çeşitli yüzey belirteçlerini ve Mtb enfeksiyonuna boyuna yanıtlarını incelememizi sağlar. Daha da önemlisi, bu protokol diğer patojenlerle enfeksiyonların araştırılması, anti-tümör çalışmalarında veya enflamatuar durumların çalışmalarında, ilaç taraması vb.

Protokol

Sağlıklı anonim kan bağışçılarından insan periferik kanı, İsveç'in Huddinge kentindeki Karolinska Üniversite Hastanesi'ndeki kan bankasından elde edildi (etik onay Dnr 2010/603-31/4). Canlı virülan Mtb'yi içeren tüm deneysel adımlar, İsveç Halk Sağlığı Ajansı (FOHM), Solna, İsveç'teki Biyogüvenlik Seviye-3 (BSL-3) laboratuvarında gerçekleştirildi.

1. Medya, tamponlar ve bakteri kültürlerinin hazırlanması

NOT: Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri ile ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda verilmiştir.

  1. RPMI komple orta: Takviye RPMI 1640 ile 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES ve% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS). Mtb enfeksiyonu ile çalışırken hücre kültürü ortamında antibiyotiklerden kaçının.
  2. Serumsuz RPMI ortamı: 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile takviye RPMI 1640.
  3. Yıkama tamponu: %0,05 (v/v) Ara-80 içeren fosfat tampon salin (PBS) hazırlayın.
  4. FACS tamponu: %2,5 (v/v) FBS ve 0,5 mM EDTA içeren PBS'yi hazırlayın.
  5. Fiksasyon arabelleği: PBS'ye %4 formaldehit içeren PBS hazırlayın. Kullanımdan önce taze olarak hazırlandığından emin olun, örneğin% 37 formaldehit stok çözeltisinden karıştırılır.
  6. Permeabilizasyon tamponu: İyonize suya %0,1 sodyum sitrat ve %0,1 Triton X-100 ekleyin.
  7. Yıkama tamponu (immünoresans için): %0,1 BSA ve %0,1 Ara-20 içeren PBS'yi hazırlayın.
  8. Engelleme tamponu: %0,1 BSA ve %10 normal keçi serumu (NGS) içeren PBS'yi PBS'ye hazırlayın.
  9. Boyama tamponu (immünoresans için): %0,1 BSA içeren PBS'yi PBS'ye hazırlayın.
  10. TB komple orta: %0,05 (v/v) Ara-80, %0,5 (v/v) gliserol, kanamycin (20 μg/mL), %10 (v/v) Middlebrook oleik asit, albümin, dekstroz ve katalaz zenginleştirme (Middlebrook OADC Zenginleştirme) ile Ek Middle Brook 7H9 suyu.
  11. Bakteri kültürleri: Monosit türevi hücrelerin enfeksiyonu için yeşil floresan proteini (GFP) tutarlı bir şekilde ifade eden standart virülan Mtb laboratuvar suşu H37Rv'u kullanın. Bu Mtb suşu, GFP'yi kodlayan bir genin yanı sıra kanamycin direnci için bir gen içeren bir pFPV2 plazmid taşır. Antibiyotik direnci, kanamycin içeren kültürlerde plazmid eksprese edici bakterilerin sürekli seçilmesini sağlar. Bakterileri TB komple orta ve %70 gliserol (1:1 seyreltme) içinde -80 °C'de saklayın.

2. Periferik kan mononükleer hücre izolasyonu buffy coats

NOT: Tüm çalışmaları sınıf II biyogüvenlik kabini içinde insan kanıyla (potansiyel olarak bulaşıcı) gerçekleştirin. Artık kan ürünlerini atmadan önce 15 dakika boyunca dezenfektanlarla inaktive edin. Bu durumda sağlıklı gönüllülerden kan alındı. Bu in vitro makrofaj farklılaşma protokolü 10 x 106 izole PBMC/donör/kuyu içerecek şekilde kuruldu. Her donörden, bir buffy coat, normalde yaklaşık% 10 veya 50-80 x 10 6 monositlerin alınabileceği 500-800 x10 6 PBMC sağlayan tam kandan kaynaklanan konsantre bir lökosit süspansiyonunun yaklaşık 50 mL'sini içerir.

  1. 50 mL tüpte hazırlanan 15 mL yoğunluk degrade ortamının üzerine 15 mL buffy kat kanı yükleyin. Pipet ucunu tüpün duvarına yaslayarak yoğunluk gradyan tabakasının üzerine yavaşça kan yerleştirin.
  2. Tüpleri 0 hızlanma ve 0 yavaşlama ile oda sıcaklığında (RT) 25 dakika boyunca 600 x g'da döndürün.
    NOT: Santrifüjlemeden önce kapakları dikkatlice kapatın ve santrifüjlemeden sonra tüp tutucuları her zaman potansiyel dökülme olup olmadığını kontrol edin.
  3. Üst plazma tabakasını steril bir Pasteur pipetle çıkarın ve daha sonra mononükleer hücre tabakasını steril bir Pasteur pipet kullanarak yeni bir 50 mL tüpe dikkatlice toplayın. 50 mL'lik son bir hacim elde etmek için PBMC peletine serumsuz RPMI ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlemeden önce tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın.
  4. Süpernatant dikkatlice atın ve parmaklar içinde tüpün altını çevirerek hücre peletini yeniden atın.
  5. PBMC'lerden yoğunluk gradyan orta kontaminasyonını gidermek için, hücreleri serumsuz RPMI ile 2-3 kez yıkayarak 50 mL'lik son bir hacim elde edin. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj.
  6. Süpernatantı atın ve hücreleri 20 mL serumsuz RPMI ortamında yeniden biriktirin.
  7. Trypan mavi boyama, manuel olarak hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu trypan mavisi içinde 1:2 veya 1:10 seyreltmede seyreltin, hücre-trippan mavi örneğini 96 kuyu plakasında karıştırın, örneğin 50 μL + 50 μL (hemositometre sayımı için) veya 10 μL + 10 μL (otomatik hücre sayımı için) ve canlı hücre / mL sayısını elde etmek için hücreleri sayın.
    DİkKAT: Trypan mavisi toksiktir ve ayrı bir kimyasal atıkta atılmalıdır.

3. Monosit türevi hücrelerin farklılaşması ve polarizasyonu

NOT: Monosit türevi hücrelerin farklılaşması ve polarizasyonu için, daha önce M0, M1 benzeri ve M2 benzeri hücrelerin yanı sıra tamamen M1 ve M2 polarize hücreler için oluşturduğumuz bir protokol takip edildi25. Basitlik için, burada sadece tamamen polarize M1 ve M2 makrofajları açıklanmıştır.

  1. Monositlerin izolasyonu için plastik yapışlık kullanın. Kısaca, 2 mL serumsuz RPMI ortamında 10 x 10 6 PBMC/ kuyu gibi uygun bir konsantrasyonda6 kuyulu bir kültür plakasında taze izole PBMC'leri tohumlar ve 37 °C ve% 5 CO2'dekuluçkaya yaslar.
  2. 2-3 saat sonra, yapışmayan hücreleri bir pipetle çıkarın ve kuyuları 1 mL serumsuz ortamla 3 kez yıkayın. Ekli hücreler monositlerdir ve kuyuya eklenen toplam PBMC'lerin yaklaşık% 10'unu, yani kuyu başına eklenen 10 x10 6 PBMC'den alınan 106 monositten oluşur.
  3. Makrofaj farklılaşması için, kuyu başına 2 mL RPMI tam orta olarak eklenen sırasıyla M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için 50 ng/mL GM-CSF veya M-CSF içeren bir çalışma çözümü hazırlayın. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde kültüre edin.
  4. 3. günde, hücre kültürü ortamının 1 mL'lik kısmını her kuyunun üst tabakasından dikkatlice çıkarın ve kuyularda 50 ng/mL son konsantrasyon elde etmek için hücre kültürlerini M-CSF veya GM-CSF'nin çift konsantrasyonu içeren 1 mL taze RPMI komple ortamı ile tamamlayın. Büyüme faktörlerini 100 ng/mL/kuyudan oluşan önceden yapılmış bir çalışma çözümüne ekleyin.
  5. 6. günde, tamamen polarize ve olgun M1 (interferon-γ elde etmek için son 18-20 saatlik hücre farklılaşması için farklı uyaranlar ekleyin; IFN-γ ve lipopolisakkarit; LPS (E. coli O55:B5)) veya M2 (interlökin 4; IL-4) makrofajlar. M1 polarizasyonu için, IFN-γ ve LPS'yi RPMI komple ortasına hazırlayın ve hücre kültürlerinde 50 ng/mL IFN-γ ve 10 ng/mL LPS'lik son konsantrasyon elde etmek için kuyu başına 50 μL ekleyin. M2 polarizasyonu için IL-4'ü RPMI komple orta olarak hazırlayın ve hücre kültürlerinde 20 ng/mL'lik son bir konsantrasyon elde etmek için kuyu başına 50 μL ekleyin.
  6. M0 polarize makrofajların farklılaşması için, herhangi bir ek sitokin olmadan (M2 benzeri bir fenotip sağlayan) sadece M-CSF ile hücreleri uyarın25.
  7. Monosit türevli hücre kültürlerinin morfolojisini, daha küçük monositlerin daha büyük makrofaj benzeri hücrelere ayırt edildiğinden emin olmak için ışık mikroskopisi ile düzenli olarak kontrol edin. Ayrıca, M1 ve M2 polarizasyonu arasındaki potansiyel morfolojik farklılıkları izleyin, yani daha yuvarlak bir şekle sahip M2 hücrelerine kıyasla uzun ve gerilmiş M1 hücreleri25.
  8. 7. günde, monosit türevi hücrelere sahip plakaları virülan Mtb enfeksiyonu için bir BSL-3 laboratuvarına aktarın.

4. Mtb kültürlerinin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki adımlar bir BSL-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Virülan Mtb ile yapılan tüm çalışmalar için koruyucu giysiler, solunum koruması ve etanol dirençli eldivenler kullanın.

  1. Bir şişeyi 1 mL bakteriyel aliquot ile çözün ve 50 mL filtrelenmiş kapak tüpünde 9 mL TB komple orta (1:10 seyreltme) ile karıştırın. Süspansiyonu 37 °C ve%5 CO2'debir inkübatörde kültüre edin.
  2. 24 saat sonra, bakteri süspansiyonunu 10 dakika boyunca 2.300 x g'da döndürün ve ortayı dikkatlice dökün. Bakteri peletini 15-20 mL taze TB komple orta ile yeni bir 50 mL filtrelenmiş kapak kültürü tüpünde yeniden ıslatın ve 37 °C ve% 5 CO2'dekuluçkaya yatırın. Tüm bakteri hücreleri için homojen bir besin kaynağı sağlamak için tüpteki yerleşik bakterileri her 2-3 günde bir karıştırın.
  3. 7-10 gün sonra, 50 mL vidalı kapak tüpüne aktarmadan önce yukarı ve aşağı pipetleme yaparak bakteri süspansiyonu düzgün bir şekilde karıştırın.
  4. 50 mL'lik tüpe 35-40 mL steril yıkama tamponu ekleyin ve bakteri süspansiyonu 10 dakika boyunca 2.300 x g'da döndürün. Yıkama adımlarını bir kez tekrarlayın. Bakteri peletini bir mikropipette ile pipetleme yaparak 1 mL serumsuz RPMI ortamında yeniden ıslatın.
  5. 9 mL daha serumsuz RPMI ortamı ekleyin ve bakteri kümelerini bozmak için 37 °C'de 5 dakika boyunca sınıf II biyogüvenlik kabininin içindeki bakteri süspansiyonunu sonicate edin. Bakteri kümelerinin maksimum bozulmasını sağlamak için tüpü su banyosu sonicator'a tekrar tekrar (3-4 kez) batırın. Biyogüvenlik kabininin içine yerleştirilen bir spektrofotometre kullanarak 600 nm dalga boyunda 1 mL bakteri süspansiyonunun optik yoğunluğunu (OD) ölçün. Referansı ayarlamak için serumsuz RPMI ortamı kullanın.
  6. Şu formülü kullanarak koloni oluşturma birimlerinin (CFU) sayısını hesaplayın: (OD+0.155)/0.161 = Y ve Y x 107= Y x 106 CFU/mL, Örneğin, 0,32 OD değeri bakteriyel bir konsantrasyon sağlar (0,32 + 0,155)/0,161 = 2,95 x 107= 29,5 x 106 CFU/mL.

5. Monosit türevi hücrelerin Mtb enfeksiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar bir BSL-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir.

  1. Serumsuz RPMI ortamındaki bakteri peletini yeni bir steril 50 mL tüpte yeniden depola ve son bakteri konsantrasyonu yaklaşık 5 x 106 CFU/mL'ye ayarlayın.
  2. Hücre kültürü ortamını monosit türevi hücreler içeren 6 kuyu plakasından çıkarın. Her kuyuya 1 mL serumsuz RPMI ortamı ekleyin. Çokluk enfeksiyon elde etmek için kuyu başına 1 mL bakteri süspansiyonu ekleyin (MOI) 5:1, yani 10 başına 5 x10 6 CFU2 mL / kuyuda 6 makrofaj ve plakaları 37 ° C ve% 5 CO2'de4 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Enfeksiyondan sonra, hücre dışı bakterileri gidermek için hücreleri 1 mL steril yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın. Plakayı eğin ve tüm yıkama tamponu köşelerden dikkatlice çıkarın. Mtb ile enfekte monosit türevi hücreleri 2 mL RPMI tam ortamda antibiyotiksiz olarak yeniden biriktirin ve akış sitometrisi lekelemesine devam edin veya akış sitometrisinden önce hücreleri 24 saat (veya diğer zaman noktaları) için kuluçkaya yatırın.

6. Mtb ile enfekte monosit türetilmiş hücrelerin akış sitometrisi boyama

NOT: Aşağıdaki adımlar bir BSL-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Akış sitometrisi lekeleme tüpler yerine 96 kuyulu bir plakada yapılabilir.

  1. Mtb ile enfekte olmuş hücreleri (ve enfekte olmayan kontrolleri) kuyu başına 1 mL FACS tamponu ile 37 °C'de en az 30 dakika ve% 5 CO2ile inkübasyonla 6 kuyu plakasındaki kuyulardan ayırın.
  2. Hücrelerin ayrıldığından emin olmak için birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Mümkünse, hücre müfrezesini mikroskopi ile onaylayın. Hücre süspansiyonu her kuyudan vidalı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Pipet ile süpernatant dikkatlice atın.
  3. Hücre peletini her tüpte FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
  4. Hücreleri (yaklaşık 0,5 x 106 ila 1 x10 6 hücre/tüp) TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV) dahil olmak üzere florokrom konjuge anti-insan antikorlarının yaklaşık 50 μL kokteyli ile lekeleyin650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Göz Kamaştırıcı 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tablo 1) ile birlikte karanlıkta 4 °C'de (buzdolabı) 30 dakika boyunca canlı boya Zombie-UV.
  5. Lekeli hücreleri 400 μL FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
  6. Mikobakterilerin tam inaktivasyonunu sağlamak için lekeli hücreleri karanlıkta RT'de 30 dakika boyunca 200 μL fiksasyon tamponu (taze hazırlanmış) ile sabitlayın.
  7. Hücreleri 400 μL FACS tamponu ile iki kez yıkayın ve fazla düzeltme tamponu çıkarmak için 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
  8. Sabit hücreleri 400 μL FACS tamponunda yeniden biriktirin ve numuneleri BSL-2'de akış sitometrisi için BSL-3 laboratuvarından çıkarmadan önce yeni 1 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Lekeli hücreleri numune alınana kadar +4 °C'de saklayın.
    NOT: Tüpleri BSL-3 laboratuvarından çıkarmadan önce% 70 etanol ile püskürtün. Formaldehit toksiktir (kanserojen) ve sınıf II biyogüvenlik kabininde ele alınmalıdır. Formaldehit atıklarını ayrı bir kimyasal atıkta atın.

7. Akış sitometrik veri toplama ve Mtb ile enfekte monosit türetilmiş hücrelerin analizi

NOT: 7.1–7.2 arası adımlar yukarıda açıklanan akış sitometrisi lekeleme öncesinde yapılmalıdır. Hücre fiksasyonundan sonra hücre topaklanması ve tandem boyaların ayrışması ile ilgili sorunları önlemek için primer antikor lekelenmesinden sonra 4-10 saat içinde hem Mtb ile enfekte olmuş hem de enfekte olmayan hücrelerin örnek alımı gerçekleştirilir.

  1. Yukarıda açıklanan akış sitometrisi boyamadan önce, boyama panelindelistelenenher florokrom konjuge antikor için floresan sinyalini telafi boncukları (hem pozitif hem de negatif) kullanarak telafi edin.
  2. Her florokrom için en uygun sinyali elde etmek için insan makrofajlarının boyanmasını sağlamak için antikor seyreltmesini titrat.
  3. Lekeli hücrelerin görselleştirilmesine izin vererek negatif hücre popülasyonu için kapı ayarlamak için gerekli arka plan floresan düzeyini belirlemek için etkilenmemiş hücreleri kullanın (makrofajlar son derece otomatik floresandır).
  4. Veri toplama için önerilen yazılımı kullanarak akış sitometresinde en az 50.000 hücre/örnek elde edin.
  5. Alma dosyalarını akış sitometresinden akış sitometri standardı (FCS) formatı 3.1'de dışa aktarın.
  6. Akış sitometri analiz yazılımında FCS dosyalarını analiz edin.
  7. İleri ve yan dağılım (FSC ve SSC) özelliklerine göre kapı makrofajları ve Zombie-UV canlılık boyası kullanılarak canlı/ölü hücre gating ile ölü hücreleri hariç tutun.
  8. FITC kanalında H37Rv-GFP virüslü makrofajları görselleştirin.
  9. Pozitif lekeli hücrelerin sıklığını ve tüm belirteçler için geometrik ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) tanımlayın (Tablo 1).

8. Mtb ile enfekte monosit türevi hücrelerin immünoresans lekesi

NOT: Mtb enfeksiyonu bir BSL-3 tesisinde yapılmalıdır.

  1. İmmünasyon için, 2 x 104 monosit / kuyu elde etmek için 8 kuyu odası kaydıra içine serumsuz RPMI ortamının 500 μL'sinde tohum 2 x 105 PBMC / kuyu. Monositlerin farklılaşması ve M1/M2 polarizasyonu sonrasında, yukarıda açıklandığı gibi Mtb enfeksiyonu ile devam edin. 24 saat Mtb enfeksiyonundan sonra slaytları 30 dakika boyunca sabitleme tamponu ile sabitleyin. Sabit slaytlar, daha fazla analize kadar dondurucuda -20 °C'de saklanır.
  2. Monosit türevi hücreleri her biri 10 dakika boyunca 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
  3. RT'de 5 dakika boyunca 200 μL permeabilizasyon tamponu ile hücrelerin dengesini bozun.
  4. Hücreleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS ile 3 kez yıkayın.
  5. Hücreleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
  6. RT'de 30 dakika boyunca 200 μL engelleme tamponu ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin.
  7. Birincil antikorları boyama tamponunda 1:100 seyreltin ve M1 hücrelerini yargılanmamış bir CD64 antikoru (Klon: 10.1) ve M2 hücrelerini RT'de 2 saat boyunca yargılanmamış bir CD163 antikoru (poliklonal) ile kuluçkaya yatırın.
  8. Daha sonra, hücreleri her biri 10 dakika boyunca 200 μL yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın.
  9. Floresan etiketli ikincil antikorları 1:1.000 boyama tamponunda seyreltin ve M1 hücrelerini bir anti-fare IgG-Alexa Fluor 594 ve M2 hücrelerini RT'de 1 saat boyunca bir anti-tavşan IgG-Alexa Fluor 594 ile kuluçkaya bırakın.
  10. Hücreleri her biri 10 dakika boyunca 200 μL yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın.
  11. Hazne ızgarasını çıkarın ve her kuyuya ~20 μL DAPI montaj ortamı ekleyin ve her slayda 1,5 mm coverlip koyun.
  12. Kapak kapağını bir oje tabakası ile kapatın.
  13. GFP 'nin (yeşil kanal) çıkarılması için 486 nm, DAPI (mavi) için 402 nm ve ikincil antikor (kırmızı) için 560 nm'de yayılan lazerlerle konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.

Sonuçlar

Monosit türevi hücrelerin M0 (M2 benzeri hücreler), M1 (tamamen polarize M1 hücreleri) ve M2'ye (tamamen polarize M2 hücreleri) polarizasyonu için kullanılan sitokin stimülasyonlarının şematik bir örneği Şekil 1A'dasunulurken, M0, M1 ve M2 hücre kültürlerinin yanı sıra M1 kültürlerinin 0, 3 ve 7. Enfekte olmayan M0 hücreleri temel gating stratejisini göstermek için kullanılmıştır (Şekil 2A). Başlangıçta, miyeloid hücreler (~%85) yüksek taneliliğe sahip daha büyük hücreler de dahil olmak üzere ileri saçılma (FSC) ve yan dağılım (SSC) özelliklerine göre kapılıydı ve nokta çiziminin sol alt köşesinde bulunan düşük SSC ve FSC'ye sahip küçük boyutlu kalıntıları hariç tuttu. İkinci çizimde, çiftler (yani hücre kümeleri) tek hücrelere kıyasla artan bir alana ancak benzer yüksekliğe sahip olarak tanımlanmış ve daha fazla analizden çıkarılmıştır. Bu nedenle, eğimli şekil kapısının içine yalnızca FSC-Area ve FSC-Height (tek hücreler) arasında orantılı hücreler dahil edildi. Daha sonra, ölü hücrelerin içindeki sitoplazmik proteinleri lekeleyen Zombie-UV canlılık boyası, ölü hücreleri sonraki analizlerin dışında tutmak için kullanıldı. Beklendiği gibi, fitc kanalında görselleştirilen Mtb-GFP ekspresyleri için canlı enfekte olmayan M0 hücreleri negatifti.

Daha sonra, enfekte olmayanların yanı sıra Mtb enfekte M1 ve M2 makrofajlarına enfeksiyon sonrası 4 saatte aynı gating stratejisini uyguladık (Şekil 2B,C). Enfekte olmayan M1 polarize makrofajların FCS/SSC kapısında iki alt popülasyon tespit edildi; daha küçük boyutlu (FCS) ve daha yüksek taneliliğe (SSC) sahip bir popülasyon ve daha büyük boyutlu ve daha düşük taneliliğe sahip diğer popülasyon (Şekil 2B), enfekte olmayan M2 hücrelerinin ana kapısı daha homojen görünüyordu (Şekil 2C). Hem M1 hem de M2 monosit türevli hücreler, hücre içi Mtb bakterilerinin alınmasından kaynaklanan hücrelerin içinde artan bir karmaşıklığı yansıtabilecek Mtb enfeksiyonu üzerine daha yüksek tanecikliliğe dikey bir kayma ve hücre boyutunu azalttı (Şekil 2B,C). Ayrıca, canlılık lekesi gelişmiş bir hücre ölümünü ortaya çıkardı (%17-22) Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 hücreleri arasında 5 MOI'de, enfekte olmayan M0 hücrelerine kıyasla (%99) (Şekil 2A-C) veya enfekte olmayan M1 ve M2 hücreleri (veriler gösterilmez). Temsili veriler, Mtb-GFP ekspresyonunun (yani Mtb enfektivitesinin) M2 'de (%77 GFP pozitif hücreler) 4 saatlik enfeksiyondan sonra M1 (%19 GFP pozitif hücreler) hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunugöstermiştir (Şekil 2B,C). 24 saatlik enfeksiyondan sonra, Mtb-GFP ekspresyonu M1 ve M2 hücrelerinde sırasıyla %43 ve %85 idi ve M1 hücrelerinin MTB enfeksiyonundan sonraki 4-24 saat arasında GFP ekspresyonunda M2 hücrelerine göre nispeten daha yüksek bir artış olduğunu, M1 ve M2 hücrelerinde GFP ekspresyonunda sırasıyla 4-24 saatten %10,4 artış olduğunu düşündürdü.

Enfekte olmayan monosit türevi hücrelerde M1/M2 polarizasyonunun etkinliğini karakterize etmek için, CD64 ve CD86 (CD64+CD86+) için çift pozitif olan M1 hücrelerini ve CD163 ve CD200R (CD163+CD200R+ içinçift pozitif olan M2 hücrelerini tanımlamak için nokta çizimleri kullanılmıştır; Şekil 3A,B). M1/M2 belirteçlerinin seçimi öncelikle önceki çalışmamızdan elde edilen sonuçlara dayanarakyapılmıştır 25, aynı zamanda diğer çalışmalardan26,27,28,29. Lekeli hücrelerin kadranları, lekesiz M1/M2 hücreleri için ilgili kapılar kullanılarak ayarlanmıştır (Şekil 3A). Bu belirteçlerin hiçbiri sadece M1 veya M2 hücreleri tarafından ifade değildir, ancak pozitif hücrelerin oranı ve yüzey ekspresyonunun yoğunluğu farklıdır. Bu özellikle M1 hücrelerinin yaklaşık% 95'inin ve M2 hücrelerinin% 79'unun CD64+CD86+olduğu M1 lekesinden belirgindi, ancak boyama yoğunluğu M1 alt kümesinde önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 3A). M1 hücrelerinin %27'si M2-marker CD200R için pozitif iken, CD163 için sadece %1'i pozitifti ve %63 CD163+CD200R+ M2 hücrelerine kıyasla %0,5 CD163+CD200R+ M1 hücreleri sağladı (Şekil 3A). 4 saatlik Mtb enfeksiyonundan sonra Mtb-GFP pozitif M1 polarize hücrelerde (%16) CD200R+ hücrelerinin sıklığında artış gözlenirken, M2 hücrelerinde CD163 ekspresyonu azaltılmıştır (Şekil 3B). Isı haritası, CD163 + CD200R + M2 hücrelerinde, aynı zamanda CD64+CD86 +M2 alt kümesinde, karşılık gelen M1 hücreleri alt kümelerine kıyasla yüksek miktarda GFP ekspresyonunun olduğunu gösterir ( Şekil3B). Genel olarak, ilgili M1 ve M2 işaretçilerinin ifadesindeki kayma, Şekil 3C'dekihistogramlarda da görselleştirilir. Ayrıca, Mtb-GFP bakterileri CD64+ M1 hücrelerinde ve CD163+ M2 hücrelerinde, M1 hücrelerine kıyasla M2 içinde gelişmiş hücre içi alımı ve / veya büyümesini destekleyen konfokal mikroskopi ile görselleştirildi (Şekil 3D).

Manuel gating sonuçlarını doğrulamak için Tekdüzen Manifold Yaklaşım ve Projeksiyon (UMAP) kullanarak boyutsallık azaltma uyguladık. UMAP analizi, 4 saat boyunca Mtb enfeksiyonunun makrofajların polarizasyonunu etkilemek için yeterli olmadığını, 24 saatlik enfeksiyonun aksine, M1 ve M2 enfekte olmayan ve enfekte olmuş hücre kümelerinin açıkça ayrılmasına neden olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). Enfekte olmayan M1 makrofajları, M2 makrofajlarına kıyasla CD64, CD86, TLR2, HLA-DR ve CCR7'nin daha yüksek ifadesini gösterirken, enfekte olmayan M2 hücreleri CD163, CD200R, CD206 ve CD80(Şekil 4B,C)M2 fenotip belirteçlerinin güçlü bir yukarı düzenlemesini sergiledi. Manuel gating'e ek olarak, 24 saat sonra Mtb enfeksiyonu, M2 hücrelerinde CD163, CD200R ve CD206'nın açık bir şekilde küçültülmesine ve M1 hücrelerinde CD86 ve HLA-DR'nin kabarmasına neden oldu (Şekil 4B,C), bu da Mtb'nin makrofaj polarizasyonunu modüle edebildiğine işaret ediyor. Sonraki fenograf analizi (Şekil 4D-F) UMAP grafiklerinde gösterildiği gibi M1 ve M2 enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş hücreler arasında benzersiz olarak dağıtılan farklı boyutlarda 24 farklı küme tanımlamıştır (Şekil 4D), pasta grafikler (Şekil 4E) ve ısı haritaları (Şekil 4F). Sonuç olarak, bu sonuçlar, Mtb enfeksiyonu tarafından daha da modüle edilen fenotipik ve fonksiyonel olarak çeşitli M1 ve M2 polarize hücreleri in vitro üretmek için bu protokolün umut verici verimliliğini göstermektedir.

figure-results-7513
Şekil 1: İnsan miyeloid türevi hücrelerin in vitro farklılaşması ve polarizasyonunun şematik illüstrasyonu. (A) M0 (M2 benzeri), M1 (klasik olarak aktif) ve M2 (alternatif olarak etkinleştirilmiş) hücreler tasvir edilir. Sağlıklı kan bağışçılarından elde edilen monositler, protokolde açıklandığı gibi farklı sitokinlerle polarize edildi ve 10 renkli akış sitometrisi ile analizden önce 4 saat boyunca GFP etiketli Mtb suşu olan H37Rv ile enfekte edildi. M1 polarize hücreler tipik olarak M2 polarize hücrelere kıyasla daha az bakteri içerir. (B) 7. günde 6 kuyulu plakalarda tamamen polarize, enfekte olmayan M0, M1 ve M2 hücrelerinin mikroskobik görüntüleri ve 0, 3 ve 7. günde monositlerden M1 hücre farklılaşmasının temsili görüntüleri. Büyütme 20x (üst panel) ve 10x (alt panel) dir. M1 hücrelerinin daha yuvarlak M0 ve M2 hücrelerine (üst panel) kıyasla daha uzun ve gerilmiş olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8783
Şekil 2: Farklı polarize miyeloid türevli hücrelerin gating stratejisi. Bulaşmamış M0 makrofajlarının (A) İleri saçılma (FSC) ve yan dağılım (SSC) özelliklerini gösteren temsili nokta çizimleri. FSC-A/FSC-H çizimi, alan ve yükseklik için orantılı tek hücrelerin manuel olarak gatingini gösterir. Canlı hücre kapısı Zombie-UV (canlılık boyası) için pozitif olan hücreleri hariç tuttu. FITC kanalında gözlenen canlı hücrelerde hücre içi Mtb GFP ekspresyözü ile saptanmıştır. (B) Hem enfekte olmayan hücrelerde hem de Mtb ile enfekte olmuş hücrelerde 4 h ve 24 h enfeksiyon sonrası FCS /SSC nokta çizgilerini gösteren M1 ve (C) M2 makrofajlarının gating. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9822
Şekil 3: In vitro M1/M2 polarizasyon protokolünün etkinliği. CD64 ve CD86 (M1) veya CD163 ve CD200R (M2) kullanarak M1 ve M2 polarize hücrelerin alt küme frekanslarını gösteren temsili nokta çizimleri ve çeyreklik gating (A) lekesiz ve lekesiz hücrelerde ve (B) Mtb ile enfekte olmuş hücreler enfeksiyon sonrası 4 saat. (B)işaretlerindeki nokta çizimleri, farklı alt kapılardan elde edilen M1 ve M2 polarize makrofajlardaki GFP ekspresyonunun (ısı haritası) floresan yoğunluğunu göstermektedir. (C) Geometrik floresan yoğunluğu ortalaması (MFI), 4 saat Mtb enfeksiyonundan sonra bir temsilci donörden yapılan histogramlarda gösterilmiştir. Üst panelde enfekte olmayan M1 (açık mavi) ve M2 hücrelerindeki (açık mor) MFI değerleri, alt panelde ise Mtb ile enfekte olmuş M1 (koyu mavi) ve M2 hücreleri (koyu mor) sunulmuştur. (D) Enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 polarize hücrelerin temsili konfokal görüntüleri gösterilmiştir. M1 ve M2 hücreleri sırasıyla CD64 ve CD163 ekspresyolojisi için immünoresans kullanılarak boyandı. Pozitif yüzey boyama kırmızı, GFP ifade eden hücre içi bakteriler ise yeşil renkte gösterilmiştir. DAPI lekeli çekirdekler mavi renkte gösterilir. Ölçek – 10 μm. Sağdaki görüntülerin büyüttmesi 350x'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11490
Şekil 4: Tekdüzen Manifold Yaklaşım ve Projeksiyon (UMAP) ile boyutsallık azalması ve enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 hücrelerinin fenograf analizi. (A) UMAP, enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 hücre kültürlerinden 11000 canlı hücrenin iki temsili kan bağışçısından, 4 h (sol grafikler) veya 24 saat (sağ grafikler) enfeksiyon sonrası birleştirilmesiyle oluşturulur. GFP ekspresyesi (alt panel) için ısı haritası, enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş hücreleri gösterir. (B-C) Enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 hücrelerinde ifade edilen belirteçlerin MFI'si enfeksiyon sonrası 24 saat, (B) ısı haritası veya (C) çubuk çizimleri olarak gösterilir. (D-F) Fenograf analizi, enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş M1 ve M2 kültürleri arasında farklı olarak dağıtılan 24 küme tanımladı. 8-13 kümeleri enfekte olmayan M1 hücrelerinde benzersizdir, 1-7 kümeleri Mtb ile enfekte olmuş M1 hücrelerinde benzersizdir, 20-24 kümeleri enfekte olmayan M2 hücrelerinde benzersizdir ve 14-19 kümeleri Mtb ile enfekte olmuş M2 hücrelerinde benzersizdir. Her fenograf kümesindeki her işaretçinin MFI'si (F) içinde gösterilir. Veriler enfekte olmayan M1 (açık mavi) ve M2 hücreleri (açık mor) ve Mtb ile enfekte M1 (derin mavi) ve M2 hücreleri (derin mor) olarak sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Akış sitometrisi için kullanılan antikorların listesi.

LazerFiltreFlorokromFenotipIşlevKlonKatalog no.Şirket
639670/30AF647TLR2Patojen tanıma reseptörüTL2.1309714BioLegend
639780/60APC-Cy7CD206Mannoz reseptörü15-2321120BioLegend
405610/20BV605CD163Çöpçü reseptörüGHI/61333616BioLegend
405670/30BV650CD80Yardımcı uyarıcı molekül2D10305227BioLegend
405710/50BV711CCR7Kemokin reseptörüG043H7353228BioLegend
405780/60BV785CD86Yardımcı uyarıcı molekülIT2.2305442BioLegend
488530/30GFPMtbHücre içi bakteriler
561586/15PeCD200RInhibitör reseptörÖKÜZ-108329306BioLegend
561620/14PE/GÖZ KAMAŞTıRAN 594CD64IgG'nin FC gama reseptörü-I10.1305032BioLegend
561661/20PE-Cy5 (PC5)HLA-DRMHC sınıf II molekülüL243307608BioLegend
355450/50BUV395Uygulanabilirlik BoyasıCanlı/ölü hücre işaretçisiZombi UV423108Invitrogen

Tartışmalar

Bu deneysel protokol, miyeloid türevli hücrelerin M1 veya M2 fenotiplerine etkili polarizasyonunu açıklar, buna GFP etiketli Mtb'nin çeşitli makrofaj alt kümelerinde görselleştirilmesine ve derin karakterizasyonuna izin veren 10 renkli akış sitometri paneli ile değerlendirme de dahildir. TB eski bir insan hastalığı olmasına rağmen, şu anda Mtb-makrofaj etkileşimlerini incelemek için altın standart bir model yoktur ve makrofajların çok renkli akış sitometrisi lenfosit yanıtlarının analizlerine kıyasla karmaşık olabilir. İnsan monositlerinin makrofajlara in vitro farklılaşması için mevcut birkaç protokol, üretilen makrofajların türü hakkında derin bilgi sunar. Makrofaj polarizasyonu ve akış sitometrik değerlendirmesi için temel bir protokol, katı bir işaret paneli kullanarak makrofaj aktivasyonunun bu tür bir karakterizasyonu kolaylaştırabilir ve farklı koşullar altında tedavi edilen polarize hücrelerin ek özelliklerini keşfetme fırsatları sunabilir. Bu, in vitro kültürlü hücrelerin analizlerinin yanı sıra klinik örneklerde in vivo hücrelerin analizlerini, yani vücut sıvılarından (örneğin, bronkoalveoler lavaj) veya homojenize dokudan pbmc ve tek hücreli süspansiyonları içerir. Buna göre hastalardan elde edilen monosit ve makrofajların farklılaşması ve/veya aktivasyon durumu hastalık sonucu ile ilişkili olabilir. Pulmoner TBhastalarında periferik kanda CD16 + CD163+ monositlerin genişlemesi bildirilmiştir30. Atopik dermatit hastalarının iltihaplı derisinde cd163+ hücre sıklığının arttığı da tespit edildi31. Benzer şekilde, CD206+ M2 benzeri makrofajların adipozit dokusunun mikroçevrimi32'deki hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasına engel olduğu ve akut miyeloid lösemi (AML)29hastalarından kemik iliği örneklerinde zenginleştirildiği gösterilmiştir. Osteoartritli hastaların tam kanında CD64 (M1) ile CD163 (M2) hücrelerinin yüksek oranının hastalık şiddeti33ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Başka bir çalışmada, dokudaki yüksek M1 ekspresyonunun kötü huylu beyin tümörlerinin bir alt grubunda daha kötü sonuçla ilişkili olduğunu göstermek için CD86 (M1) ve CD163 (M2) kullanıldı34.

Bu deneysel M1/M2 akış sitometrisi protokolünün birkaç önemli avantajı vardır. Bu model, virülan Mtb enfeksiyonuna doğuştan gelen immün yanıtları inceleme fırsatı sağlar ve karışık lenfosit reaksiyonlarında (MLR' ler) M1 veya M2 makrofajları ile birlikte otolog T hücreleri ekleyerek uyarlanabilir immün yanıtların çalışmalarını içerecek şekilde geliştirilebilir. Protokol ayrıca farklı immünomodülatör ve antimikrobiyal bileşiklerin ilaç taraması ve testleri için de uygundur. Burada, daha önce D vitamini ve histone deacetylaz inhibitörü fenilbütiratın Mtb enfeksiyonundan sonra miyeloid türevli hücreler üzerindeki etkilerini inceledik25,35. M1/M2 akış sitometrisi, hücre kültürü süpernatantları veya hasta plazması ile koşullandırmadan sonra makrofaj aktivasyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. HIV veya helmintler veya TB-diyabet ko-morbiditesi ile TB ko-enfeksiyonu in vivo çalışmaları zor olsa da, daha az karmaşık M1 / M2 modeli in vitro eş morbiditelerin çalışmalarını kolaylaştırabilir. Aynı şekilde, protokol, hücrelerin Mtb enfektivitesini incelemek veya bireysel M1/M2 hücrelerinin fagositik ve antijen sunum kapasitesini araştırmak için iletim çalışmaları için kullanılabilir. M1/M2 akış sitometrisi, biyobelirteç ve aşı çalışmalarında, tedavi sırasında hastalık prognozlarını takip etmek ve miyeloid türevi hücreleri hedef alan tedavileri test etmek için de çekicidir. Daha da önemlisi, konfokal mikroskopi (Şekil 3D),gerçek zamanlı PCR, batı blot, multipleks tahlilleri ve kültür süpernatantındaki çözünür faktörlerin ELISA'sının yanı sıra GFP ekspresyonu (akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi) ve koloni oluşturan birimler (CFU) kullanılarak hücre içi bakteriyel enfektivite ve büyümenin değerlendirilmesi. M1 veya M2 hücrelerinin Mtb-GFP bakterisi ile enfeksiyonu, tek hücre-RNA dizileme analizi için enfekte olmayan ve Mtb ile enfekte olmuş hücrelerin aynı örnekten sıralanarak sıralanarak sıralanarak enfekte olduğunu da sağlar.

Açıklanan protokolün hem teknik hem de bilimsel dezavantajları da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. İnsan kanı bağışçılarından monosit türevli makrofajların kullanılmasının dezavantajı, donör değişkenliğinin genellikle yüksek olması ve hücrelerin insan dokularının fizyolojik ortamında polarize olmamasıdır. M1/M2 polarizasyon etkinliğindeki büyük değişkenlik veya donörler arasındaki Mtb-enfeksiyözlüğü, hem deneyim içi hem de deneyimsel varyasyonlarda sorunlara, düşük istatistiksel güce ve güvenilir sonuçlar elde etmek için birçok bağışçıyı dahil etme ihtiyacına neden olabilir. Ek olarak, PBMC'lerden monositlerin plastik yapışması, sonunda Mtb enfeksiyonundan sonra makrofaj polarizasyonunu ve hücre canlılığını etkileyebilecek rastgele bir MOI sağlayabilecek donöre bağımlı sayıda monosit / kuyu ile sonuçlanır. Protokoldeki kritik adımlar, makrofaj polarizasyonunu da etkileyebilecek hücre kültürlerini kirletmek için diğer hücre türlerini önlemek için uygun yıkamayı içerir. Çok düşük bir MOI gizli TB enfeksiyonunu taklit edebilirken, çok yüksek bir MOI hücreleri öldürür ve uygun bir MOI kullanmanın önemini vurgular. Ayrıca, akış sitometrisi analizleri için kullanılan bazı makrofaj alt kümelerinin önyargılı bir şekilde temsil edilmesine neden olabilecek, kopma üzerine sıkıca yapışan hücreleri almak zor olabilir. Akış sitometrisi analizinde önemli bir adım, boncuk kompanzasyon matrisinin doğru kullanımını ve doğru manuel gating sağlamak için lekelenmemiş hücreler veya FMO (Floresan Eksi Bir) kontrolleri gibi negatif kontrolleri içerir.

Diğer bir sınırlama, yerel doku ortamından değil, kandan elde edilen monositlerin polarizasyonunu içerir. İnsan TB'nin ayırt edici özelliği Mtb ile enfekte dokularda granülom oluşumudur ve bu nedenle TB'deki immünopatoloji tercihen lokal doku bölgesinde çalışılmalıdır. Bununla birlikte, monositler, hücrelerin GM-CSF12gibi enflamatuar sitokinlerin varlığında makrofajlara farklılaşabileceği iltihaplanma / enfeksiyon üzerine periferik kandan akciğere işe alınmaktadır. Daha da önemlisi, doku in vivosunun fizyolojik milieu'sunda, tb enfeksiyonunun kaderine katkıda bulunan çeşitli M1 ve M2 benzeri makrofaj popülasyonlarının bir karışımı ve farklı oranları da dahil olmak üzere makrofaj polarizasyonunun büyük bir heterojenliği muhtemeldir36. Daha önce TB37'demakrofaj aracılı granülom oluşumunun 3D etüdlerini sağlayan bir insan organotipik akciğer dokusu modeli geliştirdik. Deneysel dokuda TB granülom oluşumunu, efektör fonksiyonlarını ve M1/M2 oranını daha fazla incelemek için akciğer dokusu modeli ile birlikte mevcut M1/M2 polarizasyon protokolünün istismar edilmesi ilginç olabilir.

Bu M1/M2 akış mikropları protokolü, inhibitör ve inflamatuar yanıtlarla ilişkili özelliklerin değerlendirilmesi için yararlı olan genişletilmiş bir miyeloid belirteç panelini içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir. Makrofaj yanıtlarını modüle edebilecek PD-1, SIRP-α, IDO ve arginazlar gibi inhibitör immün kontrol noktası moleküllerine büyük bir araştırma ilgisi vardır38. Bu bağlamda, miyeloid hücrelerin polarizasyonu, TB38dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol aldığı gösterilen immünoregülatör makrofajları (Mreg) veya miyeloid türevli baskılayıcı hücreleri (MDSC) destekleyen diğer uyaranları da içerebilir. M1/M2/Mreg makrofaj alt kümelerinin daha gelişmiş akış sitometri panelleri ayrıca sitokinlerin/kemokinlerin hücre içi boyanmasını içerebilir IL-1β, TNF-α, IL-10 ve MCP-1 veya indüklenebilir nitrik oksit (iNOS) ve antimikrobiyal peptitler gibi diğer çözünür faktörler veya efektör moleküller. Bu, T hücreleri için kapsamlı olarak açıklananlara benzer şekilde poli işlevli makrofaj yanıtlarını inceleme olanaklarını artırabilir39.

Şu anda, akış sitometri boyama panelleri, aynı anda birden fazla hücre alt kümesini ve moleküllerini immünofenotipleme yeteneği sağlayan 30-40 renge kadar içerebilir. Bu M1/M2 akış sitometri protokolünün temel deneysel kurulumu, çoğu eski ve yeni akış sitometreleri ile uyumlu bir omurga olarak kullanılabilir ve BSL-3 ortamında virülan Mtb ile çalışmanın getirdiği zorluklar da dahil olmak üzere bireysel ihtiyaçlara göre inşa edilebilir ve uyarlanabilir. Günümüzde, UMAP gibi boyutsallık azaltma teknikleri, yüksek boyutlu verilerin daha iyi görselleştirilmesi ve yorumlanması için gerekli olan tek hücreli çalışmalarda üretilen çok sayıda parametrenin analizini sağlayan akış sitometri yazılımının yeni sürümlerinde mevcuttur40. Akış sitometristindeki sürekli teknolojik gelişmeler, çok parametrik fenotiplemenin modern hücre sıralama yetenekleri ile kombinasyonu da dahil olmak üzere önümüzdeki yıllarda devam edecektir, burada bu protokol birkaç makrofaj bazlı Mtb enfeksiyonu testlerinde yararlı olabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

İsveç Halk Sağlığı Kurumu'ndaki meslektaşlarımız Matilda Svensson ve Solomon Ghebremichael'e BSL-3 laboratuvarındaki yardımları için teşekkür ediyoruz.

Bu çalışma İsveç Kalp ve Akciğer Vakfı (HLF) (2019-0299 ve 2019-0302 SB), İsveç Araştırma Konseyi (VR) (2014-02592, 2019-01744 ve 2019-04720'den SB'ye), Antibiyotik Direncini Önleme Vakfı (Resist), Karolinska Institutet Foundations ve KID'den SB'ye (Marco Loreti için doktora eğitiminin kısmi finansmanı) Karolinska Enstitüsü'nden. ML, İsveç Çocuk Kanserleri Vakfı (TJ2018-0128 ve PR2019-0100) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
8-well chamber slidesLab-Tek154534
BD Comp bead plusBD560497
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
DAPI Mounting mediaVector LaboratoriesH-1200-10
EDTA (0.5 M)Karolinska University hospital, HuddingeN/A
Falcon 6-well Flat Bottom platesCorning Life Sciences353046
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Glycerol (70%)Karolinska University hospital, HuddingeN/A
GM-CSFPeprotech300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibodyInvitrogenR37121Secondary antibody for CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibodyInvitrogenA-11037Secondary antibody for CD163
HEPESGE Healthcare Life SciencesSH30237.01
IFN-γPeprotech300-02
IL-4Peprotech200-04
L-GlutamineGE Healthcare Life SciencesSH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5)Sigma-AldrichL6529
LymphoprepAlere Technologies AS11508545
M-CSFPeprotech300-25
Middle Brook 7H10 agar platesKarolinska University hospital, HuddingeN/A
Middle Brook 7H9 mediaKarolinska University hospital, HuddingeN/A
Mouse anti-human CD64 primary antibodyBio-RadMCA756GClone: 10.1
Na-pyruvateGE Healthcare Life SciencesSH300239.01
Normal goat serumJackson ImmunoResearch005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibodyGeneTexGTX81526Polyclonal
RPMI 1640Life Technologies CorporationSH30096.01
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
TubeSpin bioreactor tubesTPP Techno Plastic Products AG87050
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Tween-80Sigma-AldrichP4780

Referanslar

  1. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  2. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Scientific World Journal. 11, 2391-2402 (2011).
  3. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. Journal of Immunology. 164 (12), 6166-6173 (2000).
  4. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Reports. 6, 13 (2014).
  5. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  6. Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
  7. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  8. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. Journal of Immunology. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  9. Nathan, C. F., Murray, H. W., Wiebe, M. E., Rubin, B. Y. Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity. Journal of Experimental Medicine. 158 (3), 670-689 (1983).
  10. Leidi, M., et al. M2 macrophages phagocytose rituximab-opsonized leukemic targets more efficiently than m1 cells in vitro. Journal of Immunology. 182 (7), 4415-4422 (2009).
  11. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 176 (1), 287-292 (1992).
  12. Italiani, P., Boraschi, D. From Monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5, 514 (2014).
  13. Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4560-4565 (2004).
  14. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 88 (1), 159-168 (2010).
  15. Refai, A., Gritli, S., Barbouche, M. R., Essafi, M. Mycobacterium tuberculosis virulent factor ESAT-6 drives macrophage differentiation toward the pro-inflammatory M1 phenotype and subsequently switches it to the anti-inflammatory M2 phenotype. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 327 (2018).
  16. Kahnert, A., et al. Alternative activation deprives macrophages of a coordinated defense program to Mycobacterium tuberculosis. European Journal of Immunology. 36 (3), 631-647 (2006).
  17. Marino, S., et al. Macrophage polarization drives granuloma outcome during Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 83 (1), 324-338 (2015).
  18. Erbel, C., et al. An in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization. Journal of Visualized Experiments. (76), e50332 (2013).
  19. Lee, C. Z. W., Kozaki, T., Ginhoux, F. Publisher Correction: Studying tissue macrophages in vitro: are iPSC-derived cells the answer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 726 (2018).
  20. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (76), e50323 (2013).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Njoroge, J. M., et al. Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells. Cytometry. 44 (1), 38-44 (2001).
  24. Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
  25. Rao Muvva, J., Parasa, V. R., Lerm, M., Svensson, M., Brighenti, S. Polarization of human monocyte-derived cells with vitamin D promotes control of Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Immunology. 10, 3157 (2019).
  26. Tarique, A. A., et al. functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
  27. Hristodorov, D., et al. Targeting CD64 mediates elimination of M1 but not M2 macrophages in vitro and in cutaneous inflammation in mice and patient biopsies. MAbs. 7 (5), 853-862 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Xu, Z. J., et al. The M2 macrophage marker CD206: a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia. Oncoimmunology. 9 (1), 1683347 (2020).
  30. Liu, Q., et al. Differential expression and predictive value of monocyte scavenger receptor CD163 in populations with different tuberculosis infection statuses. BMC Infectious Diseases. 19 (1), 1006 (2019).
  31. Sugaya, M., et al. Association of the numbers of CD163(+) cells in lesional skin and serum levels of soluble CD163 with disease progression of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Dermatological Science. 68 (1), 45-51 (2012).
  32. Nawaz, A., et al. CD206(+) M2-like macrophages regulate systemic glucose metabolism by inhibiting proliferation of adipocyte progenitors. Nature Communications. 8 (1), 286 (2017).
  33. Liu, B., Zhang, M., Zhao, J., Zheng, M., Yang, H. Imbalance of M1/M2 macrophages is linked to severity level of knee osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 16 (6), 5009-5014 (2018).
  34. Lee, C., et al. M1 macrophage recruitment correlates with worse outcome in SHH Medulloblastomas. BMC Cancer. 18 (1), 535 (2018).
  35. Rekha, R. S., et al. Phenylbutyrate induces LL-37-dependent autophagy and intracellular killing of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Autophagy. 11 (9), 1688-1699 (2015).
  36. Mattila, J. T., et al. Microenvironments in tuberculous granulomas are delineated by distinct populations of macrophage subsets and expression of nitric oxide synthase and arginase isoforms. Journal of Immunology. 191 (2), 773-784 (2013).
  37. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. Journal of Visualized Experiments. (104), e53084 (2015).
  38. Brighenti, S., Joosten, S. A. Friends and foes of tuberculosis: modulation of protective immunity. Journal of Internal Medicine. , 12778 (2018).
  39. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Good cell, bad cell: flow cytometry reveals T-cell subsets important in HIV disease. Cytometry Part A. 77 (7), 614-622 (2010).
  40. Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38-44 (2019).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 163makrofajinsanpolarizasyonM1 M2Mycobacterium tuberculosisenfeksiyonimm n yan tak sitometrisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır