Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Özet

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, ¹⁴C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Yağ asidi β-oksidasyonu, karaciğerin enerji taleplerini karşılamak ve tüm vücut glikoz homeostazını korumak ve açlık durumunda ekstra-hepatik organ fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan ketogenez ve glukoneogenez gibi ek işlemler için substratlar ve kofaktörler sağlamak için önemli bir metabolik yoldur. Yağ asidi β-oksidasyonu, mitokondri ve peroksizomlarda meydana gelir ve yağ asitlerinin alımı ve aktivasyonu, enzim ekspresyon seviyeleri ve koenzim A ve ^{NAD +} gibi kofaktörlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla düzenlenir. Karaciğer homojenatlarında yağ asidi β-oksidasyonunu ölçen tahlillerde, hücre lizisi ve kofaktörlerin suprafizyolojik seviyelerinin yaygın olarak eklenmesi, bu düzenleyici mekanizmaların etkilerini maskelemektedir. Ayrıca, homojenatlardaki organellerin bütünlüğünün kontrol edilmesi zordur ve preparatlar arasında önemli ölçüde değişebilir. Bozulmamış primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunun ölçümü yukarıdaki tuzakların üstesinden gelir. Bu protokol, ¹⁴C etiketli palmitik asit ile inkübe edilmiş taze izole edilmiş birincil fare hepatositlerinin bir süspansiyonunda yağ asidi β-oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Saatlerce kültürden kaçınarak, bu yöntem, beslenen farelere kıyasla oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde gözlenen yağ asidi β-oksidasyonunun aktivasyonu da dahil olmak üzere, orijinal karaciğerin protein ekspresyon seviyelerini ve metabolik yol aktivitesini daha iyi koruma avantajına sahiptir.

Giriş

Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır ^1,2.

Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşir. Çoğu yağ asidi sadece β oksidasyona uğrarken, bazıları bu yola girmeden önce farklı karbonlarda oksitlenir. Örneğin, fitanik asit gibi 3-metil ikame edilmiş yağ asitleri, α-oksidasyon yoluna girmeden önce peroksizomlarda β-oksidasyon ile bir karbonun uzaklaştırılmasına uğrar. Benzer şekilde, bazı yağ asitleri ilk önce endoplazmik retikulumdaki terminal metil grubunun (ω-oksidasyon) oksidasyonu ile dikarboksilik yağ asitlerine dönüştürülür ve tercihen peroksizomlarda β-oksidasyon³ ile oksitlenir.

Spesifik organelden bağımsız olarak, bir yağ asidi önce β-oksidasyon yolundan oksitlenmek üzere bir koenzim A (CoA) tiyoesterine veya açil-CoA'ya dönüştürülmelidir. β-Mitokondriyal matriksteki uzun zincirli açil-CoAs'ın oksidasyonu, translokasyonları için karnitin mekiğine ihtiyaç duyar, burada karnitin palmitoyltransferaz 1 (CPT1), açil-CoAs'ın asilkarnitinlere dönüşümünü katalize eder ve bu işlemde hız sınırlayıcı enzimdir⁴. Mitokondriyal matrise aktarıldıktan sonra, açil-CoAs yeniden oluşturulur ve mitokondriyal β-oksidasyon makineleri için substratlar olarak işlev görür. Oruç tutulan durumda, hepatik mitokondride β-oksidasyon yoluyla üretilen asetil-CoA öncelikle ketogeneze kanalize edilir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli, dallı zincirli ve dikarboksilik yağ asitlerinin β oksidasyonu için birincil bölge olarak işlev görür. Peroksizomlar, karnitin mekiğinin yağ asidi substratlarını ithal etmesini gerektirmez, bunun yerine ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ABCD1-3^5'in aktivitesi yoluyla karşılık gelen açil-CoAs'ı ithal eder. Peroksizomlar içinde, açil-CoA'lar daha sonra mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyon makinesinden farklı olarak özel bir enzim seti tarafından oksitlenir. Hem mitokondri hem de peroksizomlar, yağlı açil zincirlerini oksitlemek için NAD ⁺ ve serbest CoA tedariki gerektirir. Karaciğerdeki CoA seviyelerinin, açlığa yanıt olarak arttığı ve bu durumda meydana gelen yağ asidi oksidasyon oranının artmasını desteklediği gösterilmiştir⁶. Ayrıca, peroksizomlarda artan CoA bozunumu, peroksizomal yağ asidi oksidasyonunda seçici bir azalmaya neden^{olur 7}. Bu nedenle, hücre içindeki yağ asidi oksidasyon süreci, yağ asitlerinin aktivasyonu, taşınması ve oksidasyonunda yer alan enzimlerin ekspresyon seviyeleri ve aktivitelerinin yanı sıra çoklu hücre altı bölmeler boyunca kofaktörlerin ve diğer metabolitlerin konsantrasyonları ile düzenlenir.

Yağ asidi oksidasyonunu ölçmek için doku homojenatları kullanan prosedürler, bu süreci düzenleyen ve destekleyen hücresel mimariyi tahrip eder ve bu da in vivo metabolizmayı doğru bir şekilde yansıtmayan bir veri toplanmasına yol açar. Kaplanmış primer hepatositleri kullanan teknikler bu sistemi korurken, izole hücrelerin uzun süre kültürlenmesi, hala hayvan içinde yaşarken hücrelerde bulunan in vivo gen ekspresyon profilinin kaybına neden olur ^8,9. Aşağıdaki protokol, primer hepatositleri izole etmek ve [^1-14C] palmitik asit kullanarak, izolasyondan hemen sonra ve süspansiyonda yağ asidi β-oksidasyon kapasitelerini test etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Tahlil, asitte çözünür metabolitler (ASM) veya [1-14 C] palmitik asit^10,11'in β-oksidasyonu ile üretilen asetil-CoA gibi ürünlerle ilişkili radyoaktivitenin ölçümüne ^{dayanmaktadır.}

Protokol

Fareler (C57BL / 6J, erkekler, 9-11 haftalık) üzerindeki tüm deneysel prosedürler, Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hepatosit izolasyonu

1. Hazırlık
   1. Hepatosit izolasyonundan önceki günlerde, Tablo 1'de listelenen tamponları ve hücre kültürü ortamını hazırlayın. Ameliyatın yapılacağı yere yakın sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu kurun.
   2. Hepatosit izolasyonu gününde, laminer bir akış başlığı altında, 35 mL Tampon 1'i steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 70 mL Tampon 2'yi 100 mL'lik steril bir beher veya şişeye aktarın.
   3. Her iki tampona da gentamisin (50 μg / mL) ve penisilin / streptomisin (1x) antibiyotik ekleyin.
   4. Adım 1.1.3'te hazırlanan 20 mL Tampon 2'yi 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
   5. Kalan 50 mL Tampon 2'yi steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Antibiyotik takviyeli Tampon 1 ve 2'yi içeren 50 mL tüpleri 37 ° C'de ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve perfüzyona başlamadan önce en az 15 dakika ısınmalarına izin verin.
      NOT: Bir seansta birden fazla hepatosit izolasyonu yapıyorsanız, buna göre hazırlanmak için Tampon 1 ve 2'nin antibiyotik takviyeli alikotlarının sayısını artırın.
   6. Bir aliquot kollajenaz çözeltisini çözün ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Uygun şekilde saklanırsa, dondurulmuş ve 3 defaya kadar çözülmüş ve hazırlandıktan sonraki 3 hafta içinde kullanılan kollajenaz çözeltilerinde önemli bir enzim aktivitesi kaybı yoktur.
   7. Cerrahi aletleri ve peristaltik pompayı hazırlayın. Peristaltik pompanın hatlarını 15 mL% 70 etanol, ardından 15 mL steril su sirküle ederek sterilize edin.
   8. Çıkış hattına 22 G'lik bir iğne bağlayın (Şekil 1A). Bir kateterin içi boş filtresi bir konektör olarak iyi çalışır. Hatları Arabellek 1 ile doldurun ve hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için çizgileri, konektörü ve iğneyi inceleyin.

Şekil 1: Perfüzyon aparatı ve perfüze karaciğer. (A) Karaciğeri kanüle etmek ve perfüze etmek için kullanılan iğneye bağlı çıkış hattına sahip peristaltik pompa. (B) Başarılı kanülasyon, karaciğerin derhal ve homojen bir şekilde ağartılması ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Karaciğer perfüzyonu ve ayrışması
   1. Bir fareyi, taşıyıcı gaz olarak tıbbi sınıf hava ile izofluran inhalasyonu yoluyla, indüksiyon için% 4 izofluran ve anesteziyi sürdürmek için% 1.5 izofluran kullanarak anestezi yapın. Pedal refleksinin kaybını değerlendirerek anestezi derinliğini doğrulayın.
   2. Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt olmadığında, fareyi bir ameliyat tahtasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin, uzuvları uzatın ve pimlerle tahtaya sabitleyin.
   3. Farenin karnını ve göğsünü % 70 etanol ile serbestçe püskürtün.
   4. Forseps kullanarak, cildi ve karın duvarını karın tabanına yakın bir yere çekin ve organları açığa çıkarmak için orta hattın her iki tarafında ve diyaframa kadar yanal olarak kesin.
   5. Bağırsakları sağ tarafa hareket ettirerek ve karaciğerin loblarını hafifçe yukarı çevirerek inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarın. IVC'yi hafifçe eğmek ve kanülasyonunu kolaylaştırmak için farenin arkasına iğne kapağı gibi küçük bir silindirik nesne yerleştirin (Şekil 1B).
   6. Pompayı en düşük hızda çalıştırın ve Tampon 1 akarken iğneyi IVC'ye yerleştirin.
   7. Basıncı hafifletmek ve kan ve perfüzyon tamponlarının drenajına izin vermek için portal damarı kesin, ardından akış hızını hemen 7 mL / dak'ya yükseltin. Doğru yapılırsa, karaciğer birkaç saniye içinde eşit şekilde beyazlayacaktır (Şekil 1B).
   8. Daha tutarlı sonuçlar için, iğneyi perfüzyonun tüm süresi boyunca elle yerinde tutun.
   9. Karaciğeri ılık Tampon 1 ile perfüze edin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, Tampon 1 içeren tüpe yerleştirilen hattın sürekli olarak suya batırıldığından emin olun.
   10. Perfüzyon meydana gelirken, Tampon 2'ye 130 μL kollajenaz çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle pipetle veya 5 mL veya 10 mL serolojik pipetle karıştırarak karıştırın.
   11. Tampon 1'i içeren tüpteki hacim yaklaşık 5 mL'ye düştüğünde, tüpün yan tarafına pipet uygulayarak yavaşça Tampon 1'e 5 mL Tampon 2 ekleyin. Amaç, Tampon 1'den Tampon 2'ye geçerken hatta hava kabarcıkları girmekten kaçınmaktır.
   12. Ses seviyesi tekrar 5 mL'ye düşene kadar bekleyin ve yavaşça 5 mL'lik bir Arabellek 2 daha ekleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Tampon 2, Tampon 1'in yerini aldığında ve ayrışma başladığında, karaciğer şişecektir.
   13. Kalan Tampon 2'yi, orijinal olarak Tampon 1'i içeren tüpe ekleyin. Tüpte yaklaşık 5-10 mL Tampon 2 kaldığında perfüzyonu durdurun.
       NOT: Tampon 2 karaciğeri perfüze ederken, portal ven aralıklı olarak forseps ile 5 s boyunca kelepçelenebilir. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak karaciğer boyunca basınçta ortaya çıkan artış, ayrışmasını ve dolayısıyla nihai hepatosit verimini artırabilir.
   14. Karaciğeri dikkatlice tüketin ve 1.1.4 adımında bir kenara bırakılan 20 mL buz gibi soğuk Tampon 2'yi içeren 100 mm'lik kültür kabına aktarın.
   15. Laminer akış başlığının altında, cerrahi makas ve cımbız kullanarak karaciğeri yavaşça ayırın.
   16. Hepatosit süspansiyonuna yaklaşık 20 mL buz gibi soğuk M199 ekleyin ve daha büyük karaciğer parçalarından ilave hepatositlerin salınmasını nazikçe teşvik etmek için bir şırınganın pistonunu kullanarak 100 μm hücre süzgecinden süzün.
   17. 100 mm'lik kültür kabını ve hücre süzgecini toplama tüpü dolana kadar ilave M199 ile yıkayın.
   18. Süspansiyonu 50 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hepatosit peletini 30 mL soğuk M199'da döndürerek yavaşça yeniden askıya alın.
   19. Adım 1.2.18'de belirtildiği gibi hepatositleri toplayın. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
   20. Hepatositleri 10 mL ılık M199'da yeniden askıya alın ve tripan mavisi dışlama yöntemini ve bir hemositometre^12'yi kullanarak canlılığı ve verimi belirleyin.
   21. M199'daki hücreleri 37 ºC'ye ısıtarak 1.0 x 10⁶ canlı hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin ve hemen tahlil işlemine başlayın.

2. Yağ asidi β-oksidasyon testi

NOT: Tahlil üçlü olarak gerçekleştirilir ve her reaksiyon karışımı 750.000 hücre, 1.35 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 100 μM palmitik asit ve 2 mL'lik son hacimde 0.4 μCi [^1-14C] palmitik asit içerir.
DİKKAT: Radyoaktif bileşikler tehlikelidir. Radyoaktif malzemenin Kurumsal, Eyalet ve Federal düzenlemelere uygun olarak satın alınması, taşınması, depolanması ve bertaraf edilmesi.

1. Hazırlık
   1. Tahlilden önceki günlerde, palmitik asit ve BSA çözeltilerini hazırlayın (Tablo 1) ve -20 ° C'de saklayın.
   2. Tahlil gününde, karaciğer perfüzyonuna başlamadan önce 2.1.3-2.1.9 adımlarını tamamlayın.
   3. Palmitik asit ve BSA çözeltilerini çözün. Substrat karışımını çoklu reaksiyonlar artı %20-%30 fazlalık için hazırlayın ve tipik bir tahlil kurulumu Tablo 2'de gösterilmiştir.
   4. Bir mikrosantrifüj tüpünde reaksiyon başına 13.5 μL BSA çözeltisi Aliquot ve 41 ° C'ye ısıtın, ardından reaksiyon başına 200 mM palmitik asit çözeltisinden (BSA: palmitik asit molar oranı = 1: 5) 1 μL ekleyin.
      NOT: Radyoaktif ve radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltileri gibi organik çözücüler kullanılarak hazırlanan çözeltilerin, pozitif yer değiştirmeli pipet ve uygun uçlarla dağıtılması tercih edilir.
   5. Vorteks, çözünür palmitik asidin oluşumunu kolaylaştırmak için 41 ° C'de kuvvetli bir şekilde inkübe edilir ve inkübe edilir: BSA kompleksi. Kuluçka döneminde ara sıra vorteks.
   6. Karışım başlangıçta bulanık görünecek, ancak 41 ° C'de 20-30 dakikalık inkübasyondan sonra tamamen netleşecektir. Reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 41 ° C'de tutun.
   7. Aliquot 133 μL 1 M perklorik asit 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde reaksiyonları durdurmak için.
      DİKKAT: Perklorik asit güçlü bir asit ve güçlü bir oksidandır. Bu bileşiği işlemek için uygun koruyucu ekipman gereklidir.
   8. Bir tüpe reaksiyon başına 485.5 μL M199 Aliquot ve radyoaktif BSA'yı seyreltmek için 37 ° C'de tutun: reaksiyonlara başlamadan önce 2.1.4-2.1.6 adımlarında hazırlanan palmitik asit kompleksi.
   9. 750 μL M199'u, numuneler kadar 14 mL yuvarlak tabanlı tüplere dağıtın. İstenirse, bir araç kontrolü de dahil olmak üzere etomoksir, rotenon ve antimisin gibi yağ asidi β-oksidasyon inhibitörleri ekleyin (Tablo 2).
   10. Hepatosit yıkama adımları sırasında, reaksiyonlara başlamadan 10-15 dakika önce, adım 2.1.9'da hazırlanan tüpleri 37 ° C'ye ayarlanmış ve 180-200 rpm'de çalkalanan bir sallanan su banyosuna aktarın.
2. Yağ asidi β-oksidasyon reaksiyonlarını başlatmak, durdurmak ve analiz etmek
   1. Hepatositlerin yaşayabilirliği kabul edilebilirse (tipik olarak %75'≥, Şekil 2), her reaksiyon için, berraklaştırılmış BSA: palmitik asit çözeltisini içeren mikrosantrifüj tüpüne 0.8 μL [^1-14C] palmitik asit (0.5 mCi / mL) aktarın (adım 2.1.4-2.1.6). Vorteks yapın ve 41 °C'de su banyosuna geri dönün.
   2. Hepatositleri 37 ° C'ye dengelemek ve inhibitörlerle (varsa) önceden inkübe etmek için, son hepatosit yeniden süspansiyonundan hemen sonra (adım 1.2.21), hepatosit süspansiyonunun 750 μL'sini, sallanan su banyosundaki 14 mL yuvarlak tabanlı tüplerin her birine 1 mL'lik bir pipetle aktarın (adım 2.1.9-2.1.10) ve vorteksi karıştırmak için kısa bir süre düşük hızda.
   3. Her bir ilaveyi 30 s kademelendirin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Protein tayini için bir numune kaydetmek için, başka bir hepatosit alikotunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 3.000 x g'de döndürün.
      NOT: Dağıtım sırasında, numuneler arasında çökelmeyi ve hücre sayısında büyük değişkenliği önlemek için hepatosit süspansiyonunun sürekli olarak döndürülmesi veya 1 mL pipetle birlikte hafifçe karıştırılması gerekir.
   4. Süpernatantı çıkarın ve sonuçları normalleştirmek için numunedeki toplam protein miktarını ölçmeye hazır olana kadar peleti -80 ° C'de saklayın (Şekil 3).
   5. Hepatositler 37 ° C'de ön inkübasyon altındayken, radyoaktif BSA: palmitik asit kompleksini 2.1.8'deki ılık ortama ekleyin ve reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 37 ° C'de tutun. Bu son substrat karışımıdır.
   6. Reaksiyonları başlatmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve 500 μL substrat karışımı ekleyin.
   7. Vorteks, hücreleri tamamen askıya almak ve su banyosuna geri dönmek için 5 s düşük hızda vorteks. Tüm örneklerle tekrarlayın, 30 sn şaşırtın.
   8. 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bir dizi reaksiyonu başlatın ve arka plan radyoaktivitesini belirlemek için hemen durdurun (bkz. adım 2.2.10-2.2.11) (Tablo 2).
   9. Artık substrat karışımının yinelenen alikotlarını (200-250 μL) 6 mL sintilasyon şişelerine aktarın ve sayılmak üzere bir kenara koyun. 500 μL substrat karışımında oksidasyon için mevcut olan toplam palmitik asit nmollerine karşılık gelen radyoaktiviteyi hesaplamak için bu sayıları kullanın.
   10. Reaksiyonları durdurmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın, hepatositleri orta hızda vorteks yaparak yeniden askıya alın ve ardından hepatosit süspansiyonunun 400 μL'sini perklorik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   11. Hemen tüpleri kapatın. Bu sırayı tüm numuneler için 30 sn kademelendirerek tekrarlayın.
   12. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini kuvvetlice vorteksleyin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürün.
   13. Süpernatantın 300 μL'sini 6 mL'lik bir sintilasyon şişesine aktarın, 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve numunelerdeki radyoaktiviteyi ve substrat karışımı alikotları (adım 2.2.9) bir sintilasyon sayacında sayın.
       DİKKAT: Santrifüjlemeden sonra, yağ asidi β-oksidasyonu tarafından üretilen ve asidik koşullar tarafından salınan ¹⁴C-asetil-CoA'nın tam oksidasyonu ile üretilen ¹⁴C-CO_2'nin solunmasını önlemek için tüpleri bir duman başlığı altında açın.

Arabellekler/Medya Bileşenleri	Miktar	Son Konsantrasyon	Talimat -ları
Çözüm C
Kartal	1.79 gr	480 mM	50 mL'ye su ekleyin.  4 °C'de depolayın
MgSOİ4 heptahidrat	1.48 gr	120 mM
KH2PO4	0.81 gr	119 mM
Krebs-Henseleit Tamponu (KHB), kalsiyum içermez
Arjantin	7.0 gr	120 mM	900 mL'ye su ekleyin, pH'ı 7,4'e ayarlayın ve son hacmi 1 L'ye getirin.
NaHCO3	2.0 gr	24 mM
1 M HEPES pH 7.45	5 mL	5 mM
Glikoz	1 veya 2 g	5,6 veya 11 mM
Çözüm C	10 mL
Arabellek 1
cesaret	500 mL		Bileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın
50 mM EGTA	1,0 mL	0,1 mM
Arabellek 2
cesaret	500 mL		Bileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın
1 M CaCl2 dihidrat	686 μL	1,4 mM
Gentamisin çözeltisi
Gentamisin sülfat	0.5 gr	50 mg/mL	10 mL'ye su ekleyin ve sterilize edin. Aliquot ve -20 °C'de saklayın
Kollajenaz çözeltisi
Kollajenaz I ve II karışımı	10 mg	7 mg/mL	Şişenin tüm içeriğini 1.43 mL su içinde çözün.  Aliquot ve -20 °C'de saklayın
M199 Serisi
M199 Serisi	1 kese		900 mL'ye su ekleyin ve pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye getirin ve sterilize edin. 4 °C'de depolayın
NaHCO3	2.2 gr	26 mM
1 M HEPES (hücre kültürü sınıfı)	25 mL	25 mM
Ekstra glikoz (sadece beslenen fareler için)	1 gr	11 mM
BSA çözümü
Yağ asidi içermeyen BSA	400 mg	%20 (w/d)	2 mL suda çözün.  Aliquot ve -20 °C'de saklayın
Radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltisi
Palmitik asit	103 mg	200 mM	2 mL etanol içinde çözün, -20 °C'de saklayın
1 M Perklorik asit
%70 Perklorik asit	3,5 mL	1 milyon	Su ile 40 mL'ye kadar seyreltin. Oda sıcaklığında saklayın

Tablo 1: Hepatosit izolasyonu ve yağ asidi β-oksidasyon testi için gerekli tamponlar, ortamlar ve diğer çözeltiler

Reaksiyon numarası	M199 ± İnhibitörleri			Hepatosit süspansiyonu (μL)		Substrat karışımı (μL)
	Ses seviyesi (μL)	Etomoksir
1	750	-	37 °C'de ön ısıtma	750	15 dakika boyunca 37 °C'de ön inkübasyon	500	15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin
2
3
4		+
5
6
7		+					Hemen durdurun
8
9

Tablo 2: Etomoksir varlığında ve yokluğunda üçlü olarak test edilen hepatosit süspansiyonu için deney düzeneği örneği.

Sonuçlar

Burada tarif edilen karaciğer perfüzyonu tipik olarak, tripan mavisi dışlaması ile tahmin edildiği gibi, ortalama% 80 canlılığa sahip 30-40 milyon hücre / karaciğer verir (Şekil 2). Perfüzyon Tamponları 1 ve 2'yi hazırlamak için kullanılan Krebs-Henseleit tamponundaki (KHB) tipik glikoz konsantrasyonu 11 mM'dir. Oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçerken, KHB'deki glikoz konsantrasyonu, açlık durumunu daha iyi temsil etmek iç...

Tartışmalar

Karaciğer perfüzyonu sırasında, karaciğerdeki mikrokılcal damarları bloke ettiklerinden, tampon dolaşımını önledikleri veya kısıtladıkları ve genel olarak hepatosit verimini ve canlılığını azalttıkları için hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir^20,21. IVC'nin kanülasyonundan önce tampon dolu giriş hattının yakından incelenmesi ve burada açıklandığı gibi Tampon 2'ye geçmek için Tampon 1'i içeren tüpten gir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(R)-(+)-Etomoxir sodium salt	Tocris Bioscience	4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL	American Radiolabeled Chemicals	ARC 0172A
1 M HEPES, sterile	Corning	25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette	Mettler Toledo	17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes	CellTreat	229421
70% Perchloric acid	Fisher Scientific	A2296-1LB
BSA, fatty acid-free	Fisher Scientific	BP9704100
CaCl2 dihydrate	MilliporeSigma	223506
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021
EGTA	Gold Biotechnology	E-217
Ethanol	Pharmco	111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile	CellTreat	229707
Gentamicin sulphate	Gold Biotechnology	G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials	Fisher Scientific	03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in	BD Biosciences	305156
Isoflurane	VetOne	502017
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
KH2PO4	MilliporeSigma	P5655
Liberase TM Research Grade	MilliporeSigma	5401119001	Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium	MilliporeSigma	M5017
MgSO4 heptahydrate	MilliporeSigma	M1880
Microcentrifuge	Fisher Scientific		accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5980
NaCl	Chem-Impex International	30070
NaHCO3	Acros Organics	424270010
Palmitic acid	MilliporeSigma	P0500
Penicillin/streptomycin (100x)	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva Life Sciences	SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL	Mettler Toledo	17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes	Eppendorf		5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes	Fisher Scientific	14-956-9A
Scintillation counter	Perkin Elmer		TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail	Fisher Scientific	SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity	New Brunswick Scientific		Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm	Fisher Scientific	22363549
Thumb Dressing Forceps	Roboz Surgical Instrument Co	RS-8120
Trypan Blue	Corning	25900CI
Variable-flow peristaltic pump	Fisher Scientific	138762
Water baths, 2–2.5 L capacity