Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Zusammenfassung

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung ^{von 14}C-markierter Palmitinsäure.

Zusammenfassung

Die Fettsäure-β-Oxidation ist ein wichtiger Stoffwechselweg, um den Energiebedarf der Leber zu decken und Substrate und Cofaktoren für zusätzliche Prozesse wie Ketogenese und Glukoneogenese bereitzustellen, die für die Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase unerlässlich sind und die extrahepatische Organfunktion im nüchternen Zustand unterstützen. Die Fettsäure-β-Oxidation erfolgt in den Mitochondrien und Peroxisomen und wird durch mehrere Mechanismen reguliert, einschließlich der Aufnahme und Aktivierung von Fettsäuren, der Enzymexpression und der Verfügbarkeit von Cofaktoren wie Coenzym A und NAD ^+. In Assays, die die Fettsäure-β-Oxidation in Leberhomogenaten messen, maskieren die Zelllyse und die übliche Zugabe supraphysiologischer Cofaktorenspiegel die Auswirkungen dieser Regulationsmechanismen. Darüber hinaus ist die Integrität der Organellen in den Homogenaten schwer zu kontrollieren und kann zwischen den Präparaten erheblich variieren. Die Messung der Fettsäure- β-Oxidation in intakten primären Hepatozyten überwindet die oben genannten Fallstricke. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter primärer Maushepatozyten, die mit ¹⁴C-markierter Palmitinsäure inkubiert wurden. Durch die Vermeidung von Stunden bis Tagen der Kultur hat diese Methode den Vorteil, dass die Proteinexpressionsniveaus und die Stoffwechselwegaktivität der ursprünglichen Leber besser erhalten bleiben, einschließlich der Aktivierung der Fettsäure-β-Oxidation, die in Hepatozyten beobachtet wird, die von nüchternen Mäusen isoliert wurden, verglichen mit gefütterten Mäusen.

Einleitung

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Prozess im Fettstoffwechsel und bietet einen katabolen Weg, um die Fettsäuresynthese und -aufnahme aus der Nahrung auszugleichen. Dieser Prozess erzeugt Energie für mehrere Organe, einschließlich des Herzmuskels, der Nierenrinde und der nüchternen Leber, und verwendet Fettsäuren, die aus der Nahrung, der Fettgewebelipolyse und den internen Triglyceridspeichern^{gewonnen werden 1,2}.

Die Oxidation von Fettsäuren durch den β-Oxidationsweg führt zur sequentiellen Verkürzung der Fettacylkette um zwei Kohlenstoffe gleichzeitig, die als Acetyl-CoA freigesetzt werden, und dieser Prozess findet sowohl in den Mitochondrien als auch in den Peroxisomen statt. Während die meisten Fettsäuren nur einer β-Oxidation unterzogen werden, werden einige an verschiedenen Kohlenstoffen oxidiert, bevor sie in diesen Weg eintreten. Zum Beispiel werden 3-methylsubstituierte Fettsäuren, wie Phytansäure, durch α-Oxidation in den Peroxisomen entfernt, bevor sie in den β-Oxidationsweg eintreten. Ebenso werden einige Fettsäuren zunächst durch Oxidation der terminalen Methylgruppe (ω-Oxidation) im endoplasmatischen Retikulum in Dicarbonsäuren umgewandelt, bevor sie in den Peroxisomen durch β-Oxidation bevorzugt oxidiert^{werden 3}.

Unabhängig von der spezifischen Organelle muss eine Fettsäure zunächst in einen Coenzym A (CoA)-Thioester oder Acyl-CoA umgewandelt werden, um über den β-Oxidationsweg oxidiert zu werden. β-Oxidation von langkettigen Acyl-CoAs in der mitochondrialen Matrix benötigt das Carnitin-Shuttle für ihre Translokation, wobei Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT1) die Umwandlung von Acyl-CoAs in Acylcarnitine katalysiert und das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym in diesem Prozess^{ist 4}. Nach der Translokation in die mitochondriale Matrix werden die Acyl-CoAs neu geformt und dienen als Substrate für die mitochondriale β-Oxidationsmaschinerie. Im nüchternen Zustand wird das durch β-Oxidation in den hepatischen Mitochondrien erzeugte Acetyl-CoA hauptsächlich zur Ketogenese geleitet. Peroxisomen dienen als primärer Ort für die β-Oxidation von sehr langkettigen, verzweigtkettigen und dicarbonsäurehaltigen Fettsäuren. Peroxisomen benötigen das Carnitin-Shuttle nicht, um Fettsäuresubstrate zu importieren, sondern importieren die entsprechenden Acyl-CoAs durch die Aktivität der ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC) ABCD1-3⁵. Innerhalb der Peroxisomen werden Acyl-CoAs dann durch einen speziellen Satz von Enzymen oxidiert, die sich von der mitochondrialen Fettsäure- β-Oxidationsmaschine unterscheiden. Sowohl Mitochondrien als auch Peroxisomen benötigen auch eine Zufuhr von NAD⁺ und freiem CoA, um Fettacylketten zu oxidieren. Es wurde gezeigt, dass der CoA-Spiegel in der Leber als Reaktion auf das Fasten ansteigt, was die erhöhte Rate der Fettsäureoxidation unterstützt, die in diesem Zustand auftritt⁶. Darüber hinaus führt ein erhöhter CoA-Abbau in den Peroxisosomen zu einer selektiven Abnahme der peroxisomalen Fettsäureoxidation⁷. Daher wird der Prozess der Fettsäureoxidation innerhalb der Zelle durch die Expressionsniveaus und Aktivitäten von Enzymen reguliert, die an der Aktivierung, dem Transport und der Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, sowie durch die Konzentrationen von Cofaktoren und anderen Metaboliten in mehreren subzellulären Kompartimenten.

Verfahren, bei denen Gewebehomogenate zur Messung der Fettsäureoxidation verwendet werden, zerstören die zelluläre Architektur, die diesen Prozess reguliert und unterstützt, was zu einer Sammlung von Daten führt, die den In-vivo-Stoffwechsel nicht genau widerspiegeln. Während Techniken, die plattierte primäre Hepatozyten verwenden, dieses System erhalten, führt die Kultivierung isolierter Zellen über längere Zeiträume zu einem Verlust des In-vivo-Genexpressionsprofils, das in den Zellen vorhanden war, als sie noch im Tier lebten ^8,9. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten und zur Bestimmung ihrer Fettsäure- β-Oxidationskapazität unmittelbar nach der Isolierung und in Suspension unter Verwendung von [^1-14C]Palmitinsäure. Der Assay basiert auf der Messung der Radioaktivität, die mit den säurelöslichen Metaboliten (ASM) oder Produkten wie Acetyl-CoA assoziiert ist, die durch die ^β-Oxidationvon [1-14 C]palmitinsäure^10,11 erzeugt werden.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren an Mäusen (C57BL/6J, Männer, 9-11 Wochen alt) wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der West Virginia University genehmigt.

1. Hepatozyten-Isolierung

1. Präparat
   1. Bereiten Sie in den Tagen vor der Hepatozytenisolierung die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer und Zellkulturmedien vor. Stellen Sie ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 ° C in der Nähe des Ortes auf, an dem die Operation durchgeführt wird.
   2. Am Tag der Hepatozytenisolierung werden unter einer laminaren Durchflusshaube 35 ml Puffer 1 in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen und 70 ml Puffer 2 in ein steriles 100 ml steriles Becherglas oder eine sterile Flasche übertragen.
   3. Fügen Sie den beiden Puffern die Antibiotika Gentamicin (50 μg / ml) und Penicillin / Streptomycin (1x) hinzu.
   4. 20 ml Puffer 2, wie in Schritt 1.1.3 zubereitet, in eine 100-mm-Zellkulturschale überführen und auf Eis legen.
   5. Die restlichen 50 mL Puffer 2 werden in ein steriles 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt. Legen Sie die 50 ml Röhrchen mit den antibiotikahaltigen Puffern 1 und 2 in ein Wasserbad, das auf 37 ° C eingestellt ist, und lassen Sie sie mindestens 15 Minuten aufwärmen, bevor Sie mit der Durchblutung beginnen.
      HINWEIS: Wenn Sie in einer Sitzung mehrere Hepatozyten isolieren, erhöhen Sie die Anzahl der antibiotikaergänzten Aliquots der Puffer 1 und 2, um sich entsprechend vorzubereiten.
   6. Tauen Sie ein Aliquot von Kollagenaselösung auf und halten Sie es auf Eis.
      HINWEIS: Bei richtiger Lagerung gibt es keinen signifikanten Verlust der Enzymaktivität in Kollagenaselösungen, die bis zu 3 Mal eingefroren und aufgetaut und innerhalb von 3 Wochen nach der Zubereitung verwendet werden.
   7. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente und die Peristaltikpumpe vor. Sterilisieren Sie die Leitungen der Peristaltikpumpe, indem Sie 15 ml 70% Ethanol umwälzen, gefolgt von 15 ml sterilem Wasser.
   8. Schließen Sie eine 22-G-Nadel an die Ausgangsleitung an (Abbildung 1A). Der ausgehöhlte Filter eines Katheters eignet sich gut als Stecker. Füllen Sie die Leitungen mit Puffer 1 und inspizieren Sie die Leitungen, den Stecker und die Nadel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.

Abbildung 1: Perfusionsapparatur und perfundierte Leber. (A) Peristaltikpumpe mit Auslassleitung, die mit der Nadel verbunden ist, die zum Kanülieren und Perfusieren der Leber verwendet wird. (B) Eine erfolgreiche Kanülierung wird durch sofortiges und homogenes Blanchieren der Leber angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Leberperfusion und Dissoziation
   1. Anästhesieren Sie eine Maus durch Isofluran-Inhalation mit medizinischer Luft als Trägergas, wobei 4% Isofluran für die Induktion und 1,5% Isofluran zur Aufrechterhaltung der Anästhesie verwendet werden. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Verlust des Pedalreflexes beurteilen.
   2. Wenn es keine Reaktion auf Zehenkneifen gibt, legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Operationsbrett, strecken Sie die Gliedmaßen aus und befestigen Sie sie mit Stiften an der Tafel.
   3. Besprühen Sie den Bauch und die Brust der Maus großzügig mit 70% Ethanol.
   4. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Haut und die Bauchdecke in der Nähe der Bauchbasis hoch und schneiden Sie seitlich auf beiden Seiten der Mittellinie und bis zum Zwerchfell ab, um die Organe freizulegen.
   5. Legen Sie die Vena cava inferior (IVC) frei, indem Sie den Darm auf die rechte Seite bewegen und die Leberlappen vorsichtig nach oben drehen. Führen Sie ein kleines zylindrisches Objekt, z. B. eine Nadelkappe, unter die Rückseite der Maus ein, um die IVC leicht zu neigen und ihre Kanülierung zu erleichtern (Abbildung 1B).
   6. Starten Sie die Pumpe mit der niedrigsten Drehzahl und führen Sie bei fließendem Puffer 1 die Nadel in den IVC ein.
   7. Schneiden Sie die Pfortader ab, um den Druck zu entlasten und die Drainage von Blut und Perfusionspuffern zu ermöglichen, und erhöhen Sie dann sofort die Durchflussrate auf 7 ml / min. Bei richtiger Anwendung wird die Leber innerhalb weniger Sekunden gleichmäßig blanchiert (Abbildung 1B).
   8. Für konsistentere Ergebnisse halten Sie die Nadel während der gesamten Dauer der Perfusion von Hand in Position.
   9. Durchbluten Sie die Leber mit warmem Puffer 1. Um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die in das Rohr mit Puffer 1 eingeführte Leitung kontinuierlich untergetaucht bleibt.
   10. Während die Perfusion stattfindet, fügen Sie 130 μL Kollagenaselösung zu Puffer 2 hinzu und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab oder Rühren mit einer serologischen Pipette von 5 ml oder 10 ml.
   11. Da das Volumen in der Röhre, die Puffer 1 enthält, auf etwa 5 ml abnimmt, fügen Sie langsam 5 ml Puffer 2 zu Puffer 1 hinzu, indem Sie an der Seite des Rohres pipettieren. Ziel ist es, beim Wechsel von Puffer 1 zu Puffer 2 keine Luftblasen in die Leitung einzubringen.
   12. Warten Sie, bis das Volumen wieder auf 5 ml sinkt und fügen Sie langsam weitere 5 ml Puffer 2 hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Wenn Puffer 2 Puffer 1 ersetzt und die Dissoziation beginnt, schwillt die Leber an.
   13. Fügen Sie den verbleibenden Puffer 2 zu der Röhre hinzu, die ursprünglich Puffer 1 enthielt. Stoppen Sie die Perfusion, wenn sich noch etwa 5-10 ml Puffer 2 in der Röhre befinden.
       HINWEIS: Während Puffer 2 die Leber durchblutet, kann die Pfortader intermittierend mit einer Pinzette für 5 s geklemmt werden. Dieser Schritt ist optional, aber der daraus resultierende Druckanstieg in der Leber kann ihre Dissoziation und damit die endgültige Hepatozytenausbeute verbessern.
   14. Die Leber wird vorsichtig ausgeschnitten und in die 100-mm-Kulturschale mit den 20 ml eiskaltem Puffer 2 in Schritt 1.1.4 gegeben.
   15. Unter der Laminar-Flow-Haube die Leber mit chirurgischer Schere und Pinzette vorsichtig auseinander brechen.
   16. Geben Sie etwa 20 ml eiskaltes M199 in die Hepatozytensussuspension und filtern Sie es durch ein 100 μm Zellsieb mit dem Kolben einer Spritze, um die Freisetzung zusätzlicher Hepatozyten aus größeren Leberstücken sanft zu fördern.
   17. Waschen Sie die 100 mm Kulturschale und das Zellsieb mit zusätzlichem M199, bis das Auffangrohr voll ist.
   18. Zentrifen Sie die Suspension bei 50 x g für 2 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren Sie das Hepatozytenpellet vorsichtig in 30 ml kaltem M199 durch Schwenken.
   19. Die Hepatozyten werden wie in Schritt 1.2.18 erwähnt pelletiert. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.
   20. Resuspendieren Sie die Hepatozyten in 10 ml warmem M199 und bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und Ausbeute mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode und einem Hämozytometer¹².
   21. Verdünnen Sie die auf 37 ºC erwärmten Zellen in M199 auf eine Endkonzentration von 1,0 x 10⁶ lebensfähigen Zellen/ml und beginnen Sie sofort mit dem Assay.

2. Fettsäure-β-Oxidationstest

HINWEIS: Der Assay wird dreifach durchgeführt, und jede Reaktionsmischung enthält 750.000 Zellen, 1,35 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 100 μM Palmitinsäure und 0,4 μCi [^1-14C]Palmitinsäure in einem Endvolumen von 2 ml.
ACHTUNG: Radioaktive Verbindungen sind gefährlich. Kauf, Handhabung, Lagerung und Entsorgung von radioaktivem Material in Übereinstimmung mit institutionellen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.

1. Präparat
   1. In den Tagen vor dem Assay werden die Palmitinsäure- und BSA-Lösungen (Tabelle 1) hergestellt und bei -20 °C gelagert.
   2. Führen Sie am Tag des Assays die Schritte 2.1.3-2.1.9 aus, bevor Sie mit der Leberdurchblutung beginnen.
   3. Palmitinsäure und BSA-Lösungen auftauen. Bereiten Sie die Substratmischung für mehrere Reaktionen plus einen Überschuss von 20 % bis 30 % vor, wobei ein typischer Assay-Aufbau in Tabelle 2 dargestellt ist.
   4. Aliquot 13,5 μL BSA-Lösung pro Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen und auf 41 °C erwärmen, dann 1 μL der 200 mM Palmitinsäurelösung (BSA: Palmitinsäuremolarverhältnis = 1:5) pro Reaktion zugeben.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, Lösungen, die mit organischen Lösungsmitteln hergestellt wurden, wie die radioaktiven und nicht-radioaktiven Palmitinsäurelösungen, mit einer Verdrängungspipette und geeigneten Spitzen zu dosieren.
   5. Wirbel kräftig und inkubieren bei 41 ° C, um die Bildung der löslichen Palmitinsäure zu erleichtern: BSA-Komplex. Wirbel gelegentlich während der Inkubationszeit.
   6. Die Mischung erscheint zunächst trüb, klärt sich aber nach 20-30 min Inkubation bei 41 °C vollständig ab. Halten Sie es bei 41 ° C, bis Sie bereit sind, die Reaktionen zu starten.
   7. Aliquot 133 μL 1 M Perchlorsäure in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, um die Reaktionen zu stoppen.
      ACHTUNG: Perchlorsäure ist eine starke Säure und ein starkes Oxidationsmittel. Für den Umgang mit dieser Verbindung ist eine geeignete Schutzausrüstung erforderlich.
   8. Aliquot 485,5 μL M199 pro Reaktion in ein Röhrchen und halten Sie es bei 37 °C, um den radioaktiven BSA: Palmitinsäurekomplex zu verdünnen, der in den Schritten 2.1.4-2.1.6 vor Beginn der Reaktionen hergestellt wurde.
   9. Geben Sie 750 μL M199 in so viele 14-ml-Rundbodenröhrchen wie die Proben ab. Falls gewünscht, fügen Sie Inhibitoren der Fettsäure-β-Oxidation hinzu, wie Etomoxir, Rotenon und Antimycin, einschließlich einer Vehikelkontrolle (Tabelle 2).
   10. Während der Hepatozytenwaschschritte werden die in Schritt 2.1.9 vorbereiteten Röhrchen 10-15 Minuten vor Beginn der Reaktionen in ein auf 37 °C eingestelltes Schüttelwasserbad überführt und bei 180-200 U/min geschüttelt.
2. Starten, Stoppen und Analysieren der Fettsäure- β-Oxidationsreaktionen
   1. Wenn die Lebensfähigkeit der Hepatozyten akzeptabel ist (typischerweise ≥ 75%, Abbildung 2), werden für jede Reaktion 0,8 μL [^1-14C]Palmitinsäure (0,5 mCi/ml) auf das Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, das die geklärte BSA:Palmitinsäurelösung enthält (Schritte 2.1.4-2.1.6). Vortex und Rückkehr ins Wasserbad bei 41 °C.
   2. Um die Hepatozyten auf 37 °C auszugleichen und sie mit Inhibitoren vorzuinkubieren (falls vorhanden), werden unmittelbar nach der abschließenden Hepatozyten-Resuspension (Schritt 1.2.21) 750 μL der Hepatozytensuspension mit einer 1-ml-Pipette auf jedes der 14 ml-Rundbodenröhrchen im Schüttelwasserbad (Schritte 2.1.9-2.1.10) übertragen und bei niedriger Geschwindigkeit kurz zum Mischen vorgewirbelt.
   3. Jede Zugabe um 30 s taumeln und 15 min inkubieren. Um eine Probe für die Proteinbestimmung zu speichern, übertragen Sie ein weiteres Aliquot von Hepatozyten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie es bei 3.000 x g für 5 min.
      HINWEIS: Während der Dosierung muss die Hepatozytensussuspension kontinuierlich mit der Dosierpipette 1 ml gewirbelt oder vorsichtig gerührt werden, um ein Absetzen und eine große Variabilität der Zellzahl zwischen den Proben zu verhindern.
   4. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet bei -80 °C, bis es bereit ist, die Gesamtproteinmenge in der Probe zu messen, um die Ergebnisse zu normalisieren (Abbildung 3).
   5. Während die Hepatozyten bei 37 °C vorinkubiert werden, wird der radioaktive BSA:Palmitinsäure-Komplex in 2.1.8 in das warme Medium gegeben und bei 37 °C gehalten, bis die Reaktionen eingeleitet werden können. Dies ist die endgültige Substratmischung.
   6. Um die Reaktionen zu starten, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad und fügen Sie 500 μL Substratmischung hinzu.
   7. Wirbeln Sie mit niedriger Geschwindigkeit für 5 s vor, um die Zellen vollständig zu suspendieren und zum Wasserbad zurückzukehren. Wiederholen Sie mit allen Proben, die um 30 s staffeln.
   8. 15 min inkubieren Starten Sie eine Reihe von Reaktionen und stoppen Sie sofort (siehe Schritte 2.2.10-2.2.11), um die Hintergrundradioaktivität zu bestimmen (Tabelle 2).
   9. Doppelte Aliquots (200-250 μL) der übrig gebliebenen Substratmischung auf 6 ml Szintillationsfläschchen übertragen und zur Zählung beiseite gelegt. Verwenden Sie diese Zählungen, um die Radioaktivität zu berechnen, die den für die Oxidation verfügbaren Gesamtnmolen Palmitinsäure in 500 μL Substratmischung entspricht.
   10. Um die Reaktionen zu stoppen, entfernen Sie die Hepatozyten aus dem Wasserbad, resuspendieren Sie die Hepatozyten durch Vortexing mit mäßiger Geschwindigkeit und übertragen Sie dann 400 μL der Hepatozytenssuspension auf die Mikrozentrifugenröhrchen, die Perchlorsäure enthalten.
   11. Verschließen Sie sofort die Röhren. Wiederholen Sie diese Sequenz für alle Proben und staffeln Sie um 30 s.
   12. Wirbeln Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen kräftig um und drehen Sie sie 10 min lang mit 13.000 x g durch die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   13. 300 μL des Überstands werden auf eine 6 ml Szintillationsdurchstechflasche übertragen, 4 ml Szintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in den Proben und die Substratmischung aliquots (Schritt 2.2.9) in einem Szintillationszähler gezählt.
       ACHTUNG: Öffnen Sie nach dem Zentrifugieren die Schläuche unter einem Abzug, um das ^Einatmendes 14_{C-CO 2} zu vermeiden, das durch die vollständige Oxidation von ¹⁴C-Acetyl-CoA erzeugt wird, das durch Fettsäure-β-Oxidation erzeugt und durch die sauren Bedingungen freigesetzt wird.

Puffer/Medienkomponenten	Menge	Endkonzentration	Anweisungen
Lösung C
Kcl	1,79 g	480 mM	Wasser zu 50 ml hinzufügen.  Bei 4 °C lagern
MgSO4 Heptahydrat	1,48 g	120 mM
KH2PO4	0,81 g	119 mM
Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), calciumfrei
NaCl	7,0 g	120 mM	Wasser auf 900 ml geben, den pH-Wert auf 7,4 einstellen und das endgültige Volumen auf 1 l bringen. Bei 4 °C lagern
NaHCO3	2,0 g	24 mM
1 m HEPES pH 7,45	5 ml	5 mM
Traubenzucker	1 oder 2 g	5,6 oder 11 mM
Lösung C	10 ml
Puffer 1
KHB	500 ml		Mischen Sie Komponenten und filtersterilisieren Sie. Bei 4 °C lagern
50 mM EGTA	1,0 ml	0,1 mM
Puffer 2
KHB	500 ml		Mischen Sie Komponenten und filtersterilisieren Sie. Bei 4 °C lagern
1 M CaCl2 Dihydrat	686 μL	1,4 mM
Gentamicin Lösung
Gentamicinsulfat	0,5 g	50 mg/ml	Wasser zu 10 ml geben und Filter sterilisieren. Aliquot und bei -20 °C lagern
Kollagenase-Lösung
Kollagenase I und II Mischung	10 mg	7 mg/ml	Lösen Sie den gesamten Inhalt der Durchstechflasche in 1,43 ml Wasser auf.  Aliquot und bei -20 °C lagern
M199
M199	1 Beutel		Wasser auf 900 ml geben und den pH-Wert auf 7,2-7,4 einstellen. Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 L und filtersterilisieren Sie. Bei 4 °C lagern
NaHCO3	2,2 g	26 mM
1 M HEPES (Zellkulturgrad)	25 ml	25 mM
Zusätzliche Glukose (nur für gefütterte Mäuse)	1 g	11 mM
BSA-Lösung
Fettsäurefreie BSA	400 mg	20% (w/v)	In 2 ml Wasser auflösen.  Aliquot und bei -20 °C lagern
Nicht-radioaktive Palmitinsäurelösung
Palmitinsäure	103 mg	200 mM	In 2 ml Ethanol auflösen, bei -20 °C lagern
1 M Perchlorsäure
70% Perchlorsäure	3,5 ml	1 Mio.	Mit Wasser auf 40 ml verdünnen. Bei Raumtemperatur lagern

Tabelle 1: Puffer, Medien und andere Lösungen, die für die Hepatozytenisolierung und den Fettsäure-β-Oxidationstest erforderlich sind

Reaktionszahl	M199 ± Inhibitoren			Hepatozytensuspensionen (μL)		Substratmischung (μL)
	Volumen (μL)	Etomoxir
1	750	-	Vorwärmen bei 37 °C	750	Vorinkubation bei 37 °C für 15 min	500	Inkubieren bei 37 °C für 15 min
2
3
4		+
5
6
7		+					Sofort aufhören
8
9

Tabelle 2: Beispiel für den Versuchsaufbau einer Hepatozytensuspension, die in dreifacher Ausfertigung in Gegenwart und Abwesenheit von Etomoxir untersucht wurde.

Ergebnisse

Die hier beschriebene Leberperfusion ergibt typischerweise 30-40 Millionen Zellen / Leber mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%, wie durch den Trypanblau-Ausschluss geschätzt (Abbildung 2). Die typische Konzentration von Glucose im Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), der zur Herstellung der Perfusionspuffer 1 und 2 verwendet wird, beträgt 11 mM. Bei der Messung der Fettsäure-β-Oxidation in Hepatozyten, die von gefasteten Mäusen isoliert wurden, kann die Glukosekonzentration im...

Diskussion

Während der Leberdurchblutung ist es wichtig, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden, da sie die Mikrokapillaren in der Leber blockieren, die Pufferzirkulation verhindern oder einschränken und insgesamt die Hepatozytenausbeute und Lebensfähigkeit verringern^20,21. Vorsichtsmaßnahmen, wie die genaue Inspektion der mit Puffern gefüllten Einlassleitung vor der Kanülierung des IVC und das Vermeiden des Abhebens der Einlassleitung von dem Rohr, das Puffer 1 ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(R)-(+)-Etomoxir sodium salt	Tocris Bioscience	4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL	American Radiolabeled Chemicals	ARC 0172A
1 M HEPES, sterile	Corning	25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette	Mettler Toledo	17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes	CellTreat	229421
70% Perchloric acid	Fisher Scientific	A2296-1LB
BSA, fatty acid-free	Fisher Scientific	BP9704100
CaCl2 dihydrate	MilliporeSigma	223506
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021
EGTA	Gold Biotechnology	E-217
Ethanol	Pharmco	111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile	CellTreat	229707
Gentamicin sulphate	Gold Biotechnology	G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials	Fisher Scientific	03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in	BD Biosciences	305156
Isoflurane	VetOne	502017
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
KH2PO4	MilliporeSigma	P5655
Liberase TM Research Grade	MilliporeSigma	5401119001	Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium	MilliporeSigma	M5017
MgSO4 heptahydrate	MilliporeSigma	M1880
Microcentrifuge	Fisher Scientific		accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5980
NaCl	Chem-Impex International	30070
NaHCO3	Acros Organics	424270010
Palmitic acid	MilliporeSigma	P0500
Penicillin/streptomycin (100x)	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva Life Sciences	SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL	Mettler Toledo	17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes	Eppendorf		5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes	Fisher Scientific	14-956-9A
Scintillation counter	Perkin Elmer		TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail	Fisher Scientific	SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity	New Brunswick Scientific		Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm	Fisher Scientific	22363549
Thumb Dressing Forceps	Roboz Surgical Instrument Co	RS-8120
Trypan Blue	Corning	25900CI
Variable-flow peristaltic pump	Fisher Scientific	138762
Water baths, 2–2.5 L capacity