Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Riepilogo

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico ^{marcato con 14}C.

Abstract

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica chiave per soddisfare le richieste energetiche del fegato e fornire substrati e cofattori per processi aggiuntivi, come la chetogenesi e la gluconeogenesi, che sono essenziali per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e supportare la funzione extra-epatica degli organi nello stato a digiuno. La β-ossidazione degli acidi grassi avviene all'interno dei mitocondri e dei perossisomi ed è regolata attraverso molteplici meccanismi, tra cui l'assorbimento e l'attivazione degli acidi grassi, i livelli di espressione enzimatica e la disponibilità di cofattori come il coenzima A e NAD ⁺. Nei saggi che misurano la β-ossidazione degli acidi grassi negli omogeneizzati epatici, la lisi cellulare e l'aggiunta comune di livelli soprafisiologici di cofattori mascherano gli effetti di questi meccanismi regolatori. Inoltre, l'integrità degli organelli negli omogeneizzati è difficile da controllare e può variare significativamente tra i preparati. La misurazione dell'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti primari intatti supera le insidie di cui sopra. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione dell'ossidazione β degli acidi grassi in una sospensione di epatociti primari di topo appena isolati incubati con acido palmitico ^{marcato con 14}C. Evitando ore o giorni di coltura, questo metodo ha il vantaggio di preservare meglio i livelli di espressione proteica e l'attività della via metabolica del fegato originale, compresa l'attivazione della β-ossidazione degli acidi grassi osservata negli epatociti isolati da topi a digiuno rispetto ai topi nutriti.

Introduzione

L'β-ossidazione degli acidi grassi è un processo essenziale nel metabolismo dei lipidi, fornendo un percorso catabolico per bilanciare la sintesi e l'assunzione di acidi grassi dalla dieta. Questo processo genera energia per più organi, tra cui il muscolo cardiaco, la corteccia renale e il fegato a digiuno, e utilizza acidi grassi ottenuti dalla dieta, lipolisi del tessuto adiposo e depositi interni di trigliceridi ^1,2.

L'ossidazione dell'acido grasso attraverso la via β-ossidazione provoca l'accorciamento sequenziale della catena acilica grassa di due carboni alla volta, rilasciati....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sui topi (C57BL/6J, maschi, 9-11 settimane di età) sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) della West Virginia University.

1. Isolamento degli epatociti

1. Preparazione
   1. Nei giorni precedenti l'isolamento degli epatociti, preparare i tamponi e i terreni di coltura cellulare elencati nella Tabella 1. Impostare un bagno d'acqua con la temperatura impostata a 37 °C vicino a dove verrà eseguito l'intervento chirurgico.
   2. Il giorno dell'isolamento degli epatociti, sotto una cappa a flusso laminare, trasferire 35 mL di Tampone 1 in un tu....

Risultati

La perfusione epatica qui descritta produce tipicamente 30-40 milioni di cellule / fegato con vitalità media dell'80%, come stimato dall'esclusione del tripano blu (Figura 2). La concentrazione tipica di glucosio nel tampone di Krebs-Henseleit (KHB), che viene utilizzato per preparare i tamponi di perfusione 1 e 2, è di 11 mM. Quando si misura l'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti isolati da topi a digiuno, la concentrazione di glucosio nel KHB può essere abbassata per rappr.......

Discussione

Durante la perfusione epatica, è fondamentale evitare l'introduzione di bolle d'aria, in quanto bloccano i microcapillari nel fegato, impedendo o limitando la circolazione tampone e diminuendo complessivamente la resa e la vitalità degli epatociti^20,21. Precauzioni, come l'ispezione ravvicinata della linea di ingresso riempita di tampone prima della cannulazione dell'IVC ed evitare di sollevare la linea di ingresso dal tubo contenente buffer 1 per passare al bu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(R)-(+)-Etomoxir sodium salt	Tocris Bioscience	4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL	American Radiolabeled Chemicals	ARC 0172A
1 M HEPES, sterile	Corning	25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette	Mettler Toledo	17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes	CellTreat	229421
70% Perchloric acid	Fisher Scientific	A2296-1LB
BSA, fatty acid-free	Fisher Scientific	BP9704100
CaCl2 dihydrate	MilliporeSigma	223506
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021
EGTA	Gold Biotechnology	E-217
Ethanol	Pharmco	111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile	CellTreat	229707
Gentamicin sulphate	Gold Biotechnology	G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials	Fisher Scientific	03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in	BD Biosciences	305156
Isoflurane	VetOne	502017
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
KH2PO4	MilliporeSigma	P5655
Liberase TM Research Grade	MilliporeSigma	5401119001	Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium	MilliporeSigma	M5017
MgSO4 heptahydrate	MilliporeSigma	M1880
Microcentrifuge	Fisher Scientific		accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5980
NaCl	Chem-Impex International	30070
NaHCO3	Acros Organics	424270010
Palmitic acid	MilliporeSigma	P0500
Penicillin/streptomycin (100x)	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva Life Sciences	SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL	Mettler Toledo	17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes	Eppendorf		5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes	Fisher Scientific	14-956-9A
Scintillation counter	Perkin Elmer		TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail	Fisher Scientific	SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity	New Brunswick Scientific		Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm	Fisher Scientific	22363549
Thumb Dressing Forceps	Roboz Surgical Instrument Co	RS-8120
Trypan Blue	Corning	25900CI
Variable-flow peristaltic pump	Fisher Scientific	138762
Water baths, 2–2.5 L capacity