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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.
L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica chiave per soddisfare le richieste energetiche del fegato e fornire substrati e cofattori per processi aggiuntivi, come la chetogenesi e la gluconeogenesi, che sono essenziali per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e supportare la funzione extra-epatica degli organi nello stato a digiuno. La β-ossidazione degli acidi grassi avviene all'interno dei mitocondri e dei perossisomi ed è regolata attraverso molteplici meccanismi, tra cui l'assorbimento e l'attivazione degli acidi grassi, i livelli di espressione enzimatica e la disponibilità di cofattori come il coenzima A e NAD +. Nei saggi che misurano la β-ossidazione degli acidi grassi negli omogeneizzati epatici, la lisi cellulare e l'aggiunta comune di livelli soprafisiologici di cofattori mascherano gli effetti di questi meccanismi regolatori. Inoltre, l'integrità degli organelli negli omogeneizzati è difficile da controllare e può variare significativamente tra i preparati. La misurazione dell'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti primari intatti supera le insidie di cui sopra. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione dell'ossidazione β degli acidi grassi in una sospensione di epatociti primari di topo appena isolati incubati con acido palmitico marcato con 14C. Evitando ore o giorni di coltura, questo metodo ha il vantaggio di preservare meglio i livelli di espressione proteica e l'attività della via metabolica del fegato originale, compresa l'attivazione della β-ossidazione degli acidi grassi osservata negli epatociti isolati da topi a digiuno rispetto ai topi nutriti.
L'β-ossidazione degli acidi grassi è un processo essenziale nel metabolismo dei lipidi, fornendo un percorso catabolico per bilanciare la sintesi e l'assunzione di acidi grassi dalla dieta. Questo processo genera energia per più organi, tra cui il muscolo cardiaco, la corteccia renale e il fegato a digiuno, e utilizza acidi grassi ottenuti dalla dieta, lipolisi del tessuto adiposo e depositi interni di trigliceridi 1,2.
L'ossidazione dell'acido grasso attraverso la via β-ossidazione provoca l'accorciamento sequenziale della catena acilica grassa di due carboni alla volta, rilasciati....
Tutte le procedure sperimentali sui topi (C57BL/6J, maschi, 9-11 settimane di età) sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) della West Virginia University.
1. Isolamento degli epatociti
La perfusione epatica qui descritta produce tipicamente 30-40 milioni di cellule / fegato con vitalità media dell'80%, come stimato dall'esclusione del tripano blu (Figura 2). La concentrazione tipica di glucosio nel tampone di Krebs-Henseleit (KHB), che viene utilizzato per preparare i tamponi di perfusione 1 e 2, è di 11 mM. Quando si misura l'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti isolati da topi a digiuno, la concentrazione di glucosio nel KHB può essere abbassata per rappr.......
Durante la perfusione epatica, è fondamentale evitare l'introduzione di bolle d'aria, in quanto bloccano i microcapillari nel fegato, impedendo o limitando la circolazione tampone e diminuendo complessivamente la resa e la vitalità degli epatociti20,21. Precauzioni, come l'ispezione ravvicinata della linea di ingresso riempita di tampone prima della cannulazione dell'IVC ed evitare di sollevare la linea di ingresso dal tubo contenente buffer 1 per passare al bu.......
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health grant R35GM119528 a Roberta Leonardi.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
(R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
Hemocytometer | |||
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
Isoflurane | VetOne | 502017 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
Water baths, 2–2.5 L capacity |
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