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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.

Abstract

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica chiave per soddisfare le richieste energetiche del fegato e fornire substrati e cofattori per processi aggiuntivi, come la chetogenesi e la gluconeogenesi, che sono essenziali per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e supportare la funzione extra-epatica degli organi nello stato a digiuno. La β-ossidazione degli acidi grassi avviene all'interno dei mitocondri e dei perossisomi ed è regolata attraverso molteplici meccanismi, tra cui l'assorbimento e l'attivazione degli acidi grassi, i livelli di espressione enzimatica e la disponibilità di cofattori come il coenzima A e NAD +. Nei saggi che misurano la β-ossidazione degli acidi grassi negli omogeneizzati epatici, la lisi cellulare e l'aggiunta comune di livelli soprafisiologici di cofattori mascherano gli effetti di questi meccanismi regolatori. Inoltre, l'integrità degli organelli negli omogeneizzati è difficile da controllare e può variare significativamente tra i preparati. La misurazione dell'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti primari intatti supera le insidie di cui sopra. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione dell'ossidazione β degli acidi grassi in una sospensione di epatociti primari di topo appena isolati incubati con acido palmitico marcato con 14C. Evitando ore o giorni di coltura, questo metodo ha il vantaggio di preservare meglio i livelli di espressione proteica e l'attività della via metabolica del fegato originale, compresa l'attivazione della β-ossidazione degli acidi grassi osservata negli epatociti isolati da topi a digiuno rispetto ai topi nutriti.

Introduzione

L'β-ossidazione degli acidi grassi è un processo essenziale nel metabolismo dei lipidi, fornendo un percorso catabolico per bilanciare la sintesi e l'assunzione di acidi grassi dalla dieta. Questo processo genera energia per più organi, tra cui il muscolo cardiaco, la corteccia renale e il fegato a digiuno, e utilizza acidi grassi ottenuti dalla dieta, lipolisi del tessuto adiposo e depositi interni di trigliceridi 1,2.

L'ossidazione dell'acido grasso attraverso la via β-ossidazione provoca l'accorciamento sequenziale della catena acilica grassa di due carboni alla volta, rilasciati....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sui topi (C57BL/6J, maschi, 9-11 settimane di età) sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) della West Virginia University.

1. Isolamento degli epatociti

  1. Preparazione
    1. Nei giorni precedenti l'isolamento degli epatociti, preparare i tamponi e i terreni di coltura cellulare elencati nella Tabella 1. Impostare un bagno d'acqua con la temperatura impostata a 37 °C vicino a dove verrà eseguito l'intervento chirurgico.
    2. Il giorno dell'isolamento degli epatociti, sotto una cappa a flusso laminare, trasferire 35 mL di Tampone 1 in un tu....

Risultati

La perfusione epatica qui descritta produce tipicamente 30-40 milioni di cellule / fegato con vitalità media dell'80%, come stimato dall'esclusione del tripano blu (Figura 2). La concentrazione tipica di glucosio nel tampone di Krebs-Henseleit (KHB), che viene utilizzato per preparare i tamponi di perfusione 1 e 2, è di 11 mM. Quando si misura l'β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti isolati da topi a digiuno, la concentrazione di glucosio nel KHB può essere abbassata per rappr.......

Discussione

Durante la perfusione epatica, è fondamentale evitare l'introduzione di bolle d'aria, in quanto bloccano i microcapillari nel fegato, impedendo o limitando la circolazione tampone e diminuendo complessivamente la resa e la vitalità degli epatociti20,21. Precauzioni, come l'ispezione ravvicinata della linea di ingresso riempita di tampone prima della cannulazione dell'IVC ed evitare di sollevare la linea di ingresso dal tubo contenente buffer 1 per passare al bu.......

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health grant R35GM119528 a Roberta Leonardi.

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(R)-(+)-Etomoxir sodium saltTocris Bioscience4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mLAmerican Radiolabeled ChemicalsARC 0172A
1 M HEPES, sterileCorning25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipetteMettler Toledo17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubesCellTreat229421
70% Perchloric acidFisher ScientificA2296-1LB
BSA, fatty acid-freeFisher ScientificBP9704100
CaCl2 dihydrateMilliporeSigma223506
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG7021
EGTAGold BiotechnologyE-217
EthanolPharmco111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, SterileCellTreat229707
Gentamicin sulphateGold BiotechnologyG-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vialsFisher Scientific03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 inBD Biosciences305156
IsofluraneVetOne502017
KClFisher ScientificBP366-1
KH2PO4MilliporeSigmaP5655
Liberase TM Research GradeMilliporeSigma5401119001Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 mediumMilliporeSigmaM5017
MgSO4 heptahydrateMilliporeSigmaM1880
MicrocentrifugeFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Microdissecting ScissorsRoboz Surgical Instrument CoRS-5980
NaClChem-Impex International30070
NaHCO3Acros Organics424270010
Palmitic acidMilliporeSigmaP0500
Penicillin/streptomycin (100x)Gibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Cytiva Life SciencesSH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µLMettler Toledo17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubesEppendorf5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubesFisher Scientific14-956-9A
Scintillation counterPerkin ElmerTriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktailFisher ScientificSX18-4
Shaking water bath, 30 L capacityNew Brunswick Scientific Model G76
Sterile cell strainers, 100 µmFisher Scientific22363549
Thumb Dressing ForcepsRoboz Surgical Instrument CoRS-8120
Trypan BlueCorning25900CI
Variable-flow peristaltic pumpFisher Scientific138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

Riferimenti

  1. Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
  2. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.

Ristampe e Autorizzazioni

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BiochimicaNumero 175

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