Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Özet

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Özet

Yetişkin farelerden kemik iliğini izole etmek için çeşitli teknikler iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, yenidoğan farelerinden kemik iliğini izole etmek zor ve zaman alıcıdır, ancak bazı modeller için translasyonel olarak ilgili ve gereklidir. Bu protokol, 7-9 günlük yavrulardan kemik iliği hücrelerini hazırlamak için etkili ve basit bir yöntemi tanımlar. Bu hücreler daha sonra daha fazla izole edilebilir veya ilgilenilen spesifik hücre tiplerine farklılaştırılabilir. Makrofajlar, iltihaplanma ve enfeksiyonda önemli bir rol oynayan çok önemli bağışıklık hücreleridir. Gelişim sırasında, neonatal makrofajlar dokunun yeniden şekillenmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, neonatal makrofajların fenotipi ve işlevleri yetişkin meslektaşlarından farklıdır. Bu protokol aynı zamanda L929 şartlandırılmış besiyerinin varlığında neonatal makrofajların izole kemik iliği hücrelerinden farklılaşmasını da ana hatlarıyla belirtir. Diferansiye neonatal makrofajlar için yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirildi. İşlevselliği göstermek için, fagositik verimlilik ayrıca pH'a duyarlı boya konjuge Escherichia coli kullanılarak test edildi.

Giriş

Kemik iliği, kendi kendini yenileyebilen ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen hem hematopoetik hem de mezenkimal kök hücre popülasyonlarını kapsar. Kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler miyeloid ve lenfoid soylara yol açar¹. Mezenkimal kök hücreler osteoblastlar (kemik), adipositler (yağ) veya kondrositler (kıkırdak) ^üretir2. Bu hücrelerin, gen terapisi ^3,4 dahil olmak üzere hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanında birçok uygulaması vardır. Kemik iliğinde bulunan progenitör hücreler, soya özgü büyüme faktörlerinin varlığında....

Protokol

Tüm prosedürler Batı Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyelerine göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için C57BL/6J fare yavruları kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Medya hazırlığı

1. 5 mL'lik bir santrifüj tüpünde% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 3 mL MEM kültür ortamı hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
2. Kemik....

Tartışmalar

Yenidoğan fare modellerini içeren araştırmalar bir takım zorluklar ortaya çıkarabilir. Yenidoğanlar, yetişkinlere kıyasla benzersiz olan gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahiptir⁸. Bu nedenle, yetişkin hayvan modellerinden elde edilen verilerin yenidoğanlar için geçerli olduğu varsayılmamalıdır ve yayınlanmış birkaç çalışma bu fikri iyi bir şekilde ifade etmiştir^18,19. Bu nedenle, erken yaşam bağ?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal