Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Özet

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Özet

Yetişkin farelerden kemik iliğini izole etmek için çeşitli teknikler iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, yenidoğan farelerinden kemik iliğini izole etmek zor ve zaman alıcıdır, ancak bazı modeller için translasyonel olarak ilgili ve gereklidir. Bu protokol, 7-9 günlük yavrulardan kemik iliği hücrelerini hazırlamak için etkili ve basit bir yöntemi tanımlar. Bu hücreler daha sonra daha fazla izole edilebilir veya ilgilenilen spesifik hücre tiplerine farklılaştırılabilir. Makrofajlar, iltihaplanma ve enfeksiyonda önemli bir rol oynayan çok önemli bağışıklık hücreleridir. Gelişim sırasında, neonatal makrofajlar dokunun yeniden şekillenmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, neonatal makrofajların fenotipi ve işlevleri yetişkin meslektaşlarından farklıdır. Bu protokol aynı zamanda L929 şartlandırılmış besiyerinin varlığında neonatal makrofajların izole kemik iliği hücrelerinden farklılaşmasını da ana hatlarıyla belirtir. Diferansiye neonatal makrofajlar için yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirildi. İşlevselliği göstermek için, fagositik verimlilik ayrıca pH'a duyarlı boya konjuge Escherichia coli kullanılarak test edildi.

Giriş

Kemik iliği, kendi kendini yenileyebilen ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen hem hematopoetik hem de mezenkimal kök hücre popülasyonlarını kapsar. Kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler miyeloid ve lenfoid soylara yol açar¹. Mezenkimal kök hücreler osteoblastlar (kemik), adipositler (yağ) veya kondrositler (kıkırdak) ^üretir2. Bu hücrelerin, gen terapisi ^3,4 dahil olmak üzere hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanında birçok uygulaması vardır. Kemik iliğinde bulunan progenitör hücreler, soya özgü büyüme faktörlerinin varlığında spesifik hücre tiplerine farklılaşır. Eritropoietin, eritroid progenitör hücrelerin proliferasyonunu teşvik eder, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), nötrofil kolonilerinin büyümesini uyarır ve trombopoietin, soya özgü büyüme faktörlerinin birkaç örneği olarak trombosit üretimini düzenler⁵. FACS ve manyetik ile aktive edilmiş hücre sınıflandırma (MACS) işaretli hücre yüzeyi antijeni, spesifik kemik iliği türevli hücre tiplerinin^izolasyonu ve saflaştırılması için iyi bilinen yöntemlerdir 6.

Yenidoğan çalışmaları, yenidoğan ölümlerinin nedenlerini bulmaya ve prematüre doğumlar sırasındaki komplikasyonları ele almaya doğru ilerlemesine rağmen, doğrudan terapötik gelişim karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Smith ve Davis, "Pediatrik hastalar terapötik yetimler olmaya devam ediyor" ^dedi7. Yenidoğanların klinik çalışmalarında küçük örnekler, sonucun yaşam boyu etkileri ve onam almada etik sorunlar gibi çeşitli zorluklar vardır⁸. Bu nedenle, translasyonel alaka düzeyini elde etmek için yenidoğanlara özgü in vivo ve in vitro çalışma modellerine yüksek talep vardır. Anatomik ve doku seviyeleri, kısa gebelik süreleri ve altlık boyutları arasındaki benzerlikler nedeniyle, kemirgenler en çok çalışılan memeli model sistemidir.

Burada, 7-9 günlük fare yavrularından kemik iliğini izole etmek ve makrofajlara farklılaşma yeteneklerini belirlemek için ayrıntılı, oldukça uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir prosedürü açıklıyoruz. Bununla birlikte, farklı farklılaşma sinyallerinin kullanılmasıyla çeşitli hücre soyları elde edilebilir. Ayrıca hücre yüzey belirteçlerinin varlığını ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) için beklenen in vitro fagositik aktivitenin varlığını da gösteriyoruz.

Protokol

Tüm prosedürler Batı Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyelerine göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için C57BL/6J fare yavruları kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Medya hazırlığı

1. 5 mL'lik bir santrifüj tüpünde% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 3 mL MEM kültür ortamı hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
2. Kemik iliği progenitörlerini sıvı nitrojen içinde saklamak için gerekirse,% 10 DMEM,% 80 FBS ve% 10 DMSO içeren dondurma ortamı hazırlayın.
3. Tam DMEM için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.
4. Makrofaj farklılaşması için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ve% 10 L929 hücreli süpernatant ^9,10,11 ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.

2. L929 hücreli süpernatan hazırlığı

1. Sıvı nitrojen içinde depolanan L929 hücrelerini çözün ve 5 mL tam DMEM içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
2. Hücreleri 5 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bunları 2×10⁵ hücre yoğunluğunda bir T25 doku kültürü şişesine tohumlayın. % 0.4 tripan mavisi kullanarak otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile% 70 birleşme noktasına ulaşana kadar inkübe edin.
3. Hücreleri ayırmak için önce 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 2.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile değiştirin.
4. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 5 dakika inkübe edin ve 5 mL tam DMEM ekleyin.
5. Hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
6. Hücre peletini 15 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bir T75 şişesine aktarın.
7. Hücreler% 90 birleşmeye ulaşana kadar% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra ortamı toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. M-CSF içeren ortamı 0,45 μm'lik bir filtreden süzün ve -80 °C'de 5 mL'lik alikotlarda dondurun.

3. Hayvan hazırlama

1. Bir biyogüvenlik kabini altında, 7-9 günlük C57BL/6J fare yavrularını (6 yavrudan oluşan bir çöp) barajdan dikkatlice ayırın ve ayrı bir kafese koyun.
2. Bir pamuğu 2 mL veterinerlik sınıfı izofluran içinde bir çan kavanozuna veya başka bir muhafaza odasına batırın.
3. Hazneye bir yavru yerleştirin ve kapağı kapatın. Hareketsiz ve bilinçsiz hale geldiğinden emin olmak için yenidoğanı yaklaşık 90 saniye izleyin.
4. Yavru bilincini geri kazanmadan önce yavruyu hızla çıkarın ve keskin bir makasla (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) kafasını kesin.
   NOT: Yenidoğanlar, tek başına izofluran inhalasyonu ile ötenazi için yeterince derin nefes almazlar.
5. Her yavru çıkarıldıktan sonra kabın kapağını kapattığınızdan emin olun. Aynı pamuk topu 5-7 yavru için de kullanılabilir.

4. Yenidoğan kemik iliği izolasyonu

1. Yenidoğanın vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin.
2. "Forseps ve ince uçlu cerrahi makas kullanarak, aralarına bir kesi yapın.
   karın ve arka bacaklar. Arka bacakların ayağına doğru çekerek cildi çıkarın.
3. Keskin kenarlı forseps kullanarak kemiklere bağlı bağ dokusunu ve kasları kazıyın.
4. Tibia ve uyluk kemiğini Şekil 1'de gösterildiği gibi ayırmak ve çıkarmak için makasla kesin. Forseps kullanarak, bu kemikleri buz üzerindeki medya tüpüne yerleştirin. Her yavru için işlemi tekrarlayın.
5. Kemikleri forseps yardımıyla toplama tüpü olan 40 μm'lik bir süzgecin içine aktarın. Kemikleri ezin ve süzgecin üzerine 3 mL'lik bir şırınga pistonu ile bastırarak iliği serbest bırakın.
6. Hücre süspansiyonunu 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı aspire edin ve eritrositlerin parçalanması için hipotonik bir çözelti olan% 0.2 NaCl'de hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden süspanse edin. Çözeltiyi izotonik hale getirmek için hemen% 1.6 NaCl eşit hacimde ekleyin.
8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve lizis çözeltisini çıkarın.
9. Hemen kullanım için tam DMEM'de yeniden askıya alın veya depolama için dondurma ortamı ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   NOT: Bu çalışmada bu yöntemle 6.55 (± 1.44) × 10⁶ kemik iliği hücresi/yavru elde edilmiştir (Şekil 1E).
10. Hücreleri -80 °C'de dondurucu ortamda saklayın veya aşağıda açıklandığı gibi hemen kullanın.
    NOT: Yaş nedeniyle, kemikler içlerinden iliği görselleştirecek kadar şeffaf ve berraktır. Kemikleri çekerken dikkatli olmak önemlidir çünkü üzerlerine hafif bir baskı uygulamak iliği serbest bırakmak için yeterli olabilir. Yenidoğan kemiklerindeki ilik, yetişkin kemiklerinde bulunan sağlam bir iplikten ziyade sıvı formundadır. Kemiklerin toplanması sırasında kaçarsa iliği toplamak zordur.

5. Neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajların farklılaşması

1. M-CSF kaynağı olarak% 10 L929 hücreli süpernatant (2.5 mL) içeren 10 mL tam DMEM'de T75 şişesi başına 2 ×¹⁰ 7 kemik iliği hücresi tohumu. Kültür kaplarını 37 °C'de% 5 CO₂ ile 5 gün boyunca inkübe edin. Farklılaşmanın 3. gününde 2 mL L929 şartlandırılmış ortam ekleyin.
2. Ters çevrilmiş bir mikroskop ve 20x büyütmeli görüntüleme sistemi kullanarak hücreleri günlük olarak mikroskop altında gözlemleyin. Farklılaşma üzerine, makrofajlar yapışık, uzamış ve heterojen görünmelidir (Şekil 2).
3. Aşağı akış tahlilleri için makrofajları hasat etmek için, farklılaşma ortamını aspire edin.
4. Yapışmayan hücreleri ve ayrılmaya müdahale edecek serum proteinlerini çıkarmak için hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin.
5. Şişeye 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin. Kültür şişesini 5 dakika boyunca% 5 CO₂ inkübatörü ile 37 ° C'ye yerleştirin ve 5 mL DMEM ekleyin.
6. Hücreleri ayırmak için pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
7. Hücre peletini 1 mL tam DMEM'de ayırın ve tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını sayın ve kontrol edin. Bu yöntem kullanılarak izole edilen BMDM'ler 7.05 (± 2.52) ×10⁵ hücre/yavrudur (Şekil 1E).
   NOT: Farklılaşmanın ikinci gününde ortaya çıkmaya başlayan mil şeklindeki hücrelerin varlığını gözlemleyin (Şekil 1B, kırmızı oklar). Ortamın rengi sararır ve harcandığını gösterirse, farklılaştırmanın 4. gününde daha fazla L929 koşullu ortam ekleyin; Ortamın tamamen değiştirilmesi önerilmez.

6. İmmünoetiketleme ve akış sitometrik analizi

1. 100 μL/etiket akış sitometrisi tamponu (2 mM EDTA ve% 0.5 sığır serum albümini ile desteklenmiş PBS) hacminde üretici tavsiyelerine göre 10 μL /^{10 7} hücreli FcR bloke edici reaktif ile muamele ederek BMDM'lerin spesifik olmayan antikor etiketlemesini (2x10⁵ / etiket) bloke edin. 10 dakika buz üzerinde tutun.
   NOT: Hücreler toplu olarak veya tek tek kuyucuklarda veya tüplerde bloke edilebilir. Sonraki tüm adımlar, 100 μL'lik bir nihai hacimde tek tek hücre işaretleyici etiketi başına miktarları ve hacimleri gösterir.
2. 200 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyin.
3. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri, oyuk başına 5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda U-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 100 μL akış sitometrisi tamponunda 3.000 kat ve 0.625 μL BV786-CD11b, PE-F4/80 ve AlexaFluor488-CD206'ya seyreltilmiş FVS780-Canlı / Ölü hücre sayma boyasını tek tek veya kombinasyon halinde ekleyerek hücreleri boyayın 12,13,14,15. Hücreleri folyo ile kaplı buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
4. 100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyerek yıkayın.
5. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini nazikçe girdaplayın. Her oyuğa 100 μL% 0.4 paraformaldehit ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
6. 100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleme ile pelet yapın.
7. Hücreleri 400 μL akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.

7. Yenidoğan kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositik etkinliğini değerlendirmek için in vitro test

1. BMDM'leri fenol kırmızısı veya antibiyotik olmadan tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve 500 μL hacminde 35 mm'lik bir dörtlü tabakta 2 ×^{10 5} / kadran yoğunluğunda tohumlayın.
2. Bakteriyel inokulumu 25 ° C'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) veya istenen başka bir MOI'de hazırlamak için, -80 ° C'de saklanan önceden hesaplanmış bir Escherichia coli O1: K1: H7 stoğunu çıkarın.
3. İstenilen bakteri hacmini 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Toplam 1 mL hacme PBS ekleyerek bakterileri yıkayın. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Yıkama adımını tekrarlayın.
4. Bakteri peletini 50 μL PBS içinde yeniden süspanse edin ve 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona yeşil floresan pH'a duyarlı boya ekleyin. Bu, nötr pH'ta floresan sinyali olmayan pH'a duyarlı bir boyadır ve fagositoz işlemi sırasında asitlenmiş fagozomlar gibi asidik ortamlarda parlak bir şekilde floresan verir.
5. Boya konjugasyonu için bakteri hücrelerini karanlıkta 20 dakika inkübe edin.
6. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüjleme ile 1 mL PBS ile dört kez yıkayın.
7. Bakterileri fenol kırmızısı olmadan 500 μL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve BMDM kültürlerine ekleyin.
8. BMDM'leri 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 4 saat inkübe edin ve ardından lizozomları lekeleyen 200 ng hücre geçirgen kırmızı floresan boya ekleyin.
   NOT: Fagositik bakteriler floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada özetlenen yöntemi kullanarak, 25 ila 37 milyon kemik iliği hücresi, beş C57BL / 6 fare yavrusunun çöp boyutundan başarılı bir şekilde izole edilebilir. Bu yöntem, 5 ila 7 yavru arasında değişen çöp boyutları ile doğrulanmıştır. Deneylerimizde minimum izolasyon yaşı 7 gündür. Çöp boyutuna ve deney için gereken hücre sayısının bir milyondan az olmasına bağlı olarak, araştırmacılar bu protokolü 7 günlükten küçük fareler için deneyebilirler. M-CSF kaynağı olarak...

Tartışmalar

Yenidoğan fare modellerini içeren araştırmalar bir takım zorluklar ortaya çıkarabilir. Yenidoğanlar, yetişkinlere kıyasla benzersiz olan gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahiptir⁸. Bu nedenle, yetişkin hayvan modellerinden elde edilen verilerin yenidoğanlar için geçerli olduğu varsayılmamalıdır ve yayınlanmış birkaç çalışma bu fikri iyi bir şekilde ifade etmiştir^18,19. Bu nedenle, erken yaşam bağ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal