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Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo
In questo articolo
Riepilogo
Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.
Abstract
Varie tecniche per isolare il midollo osseo da topi adulti sono state ben consolidate. Tuttavia, isolare il midollo osseo da topi neonati è impegnativo e richiede tempo, ma per alcuni modelli è rilevante e necessario dal punto di vista traslazionale. Questo protocollo descrive un metodo efficiente e semplice per preparare le cellule del midollo osseo da cuccioli di 7-9 giorni. Queste cellule possono quindi essere ulteriormente isolate o differenziate in specifici tipi di cellule di interesse. I macrofagi sono cellule immunitarie cruciali che svolgono un ruolo importante nell'infiammazione e nell'infezione. Durante lo sviluppo, i macrofagi neonatali contribuiscono in modo significativo al rimodellamento dei tessuti. Inoltre, il fenotipo e le funzioni dei macrofagi neonatali differiscono da quelli delle loro controparti adulte. Questo protocollo delinea anche la differenziazione dei macrofagi neonatali dalle cellule isolate del midollo osseo in presenza di terreno condizionato con L929. I marcatori di superficie per macrofagi neonatali differenziati sono stati valutati utilizzando l'analisi citofluorimetrica. Per dimostrare la funzionalità, l'efficienza fagocitaria è stata testata anche utilizzando Escherichia coli coniugato con colorante sensibile al pH.
Introduzione
Il midollo osseo racchiude popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali che sono auto-rinnovabili e possono essere differenziate in varie linee cellulari. Le cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo danno origine a linee mieloidi e linfoidi1. Le cellule staminali mesenchimali producono osteoblasti (ossa), adipociti (grasso) o condrociti (cartilagine)2. Queste cellule hanno molteplici applicazioni nel campo della biologia cellulare e dell'ingegneria tissutale, compresa la terapia genica 3,4. Le cellule progenitrici....
Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della West Virginia e sono state eseguite seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche. Per questo studio sono stati utilizzati cuccioli di topo C57BL/6J. I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione dei terreni
- Preparare 3 mL di terreno di coltura MEM integrati con FBS al 10%, 2 mM di glutammina, 25 mM di HEPES e penicillina (100 U/mL)/strepto....
Risultati Rappresentativi
Utilizzando il metodo descritto in questo studio, da 25 a 37 milioni di cellule del midollo osseo possono essere isolate con successo da una cucciolata di cinque cuccioli di topo C57BL/6. Questo metodo è stato convalidato con cucciolate di dimensioni comprese tra 5 e 7 cuccioli. L'età minima per l'isolamento nei nostri esperimenti è stata di 7 giorni. A seconda delle dimensioni della cucciolata e del numero di cellule necessarie per l'esperimento inferiore a un milione, i ricercatori hanno potuto tentare questo protoc.......
Discussione
La ricerca che coinvolge modelli murini neonatali può presentare una serie di sfide. I neonati hanno un sistema immunitario in via di sviluppo unico rispetto agli adulti8. Pertanto, i dati generati da modelli animali adulti non dovrebbero essere considerati applicabili ai neonati, e diversi lavori pubblicati hanno articolato bene questa idea 18,19. Pertanto, sono necessari modelli e fonti di cellule neonatali specifici per studiare le com.......
Divulgazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti per questo articolo.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01 AI163333] per CMR. Riconosciamo l'ulteriore sostegno finanziario fornito alla West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility dalle seguenti sovvenzioni: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 e NIH grant OD016165.
....Materiali
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Riferimenti
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23),....
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