Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Abstract

Varie tecniche per isolare il midollo osseo da topi adulti sono state ben consolidate. Tuttavia, isolare il midollo osseo da topi neonati è impegnativo e richiede tempo, ma per alcuni modelli è rilevante e necessario dal punto di vista traslazionale. Questo protocollo descrive un metodo efficiente e semplice per preparare le cellule del midollo osseo da cuccioli di 7-9 giorni. Queste cellule possono quindi essere ulteriormente isolate o differenziate in specifici tipi di cellule di interesse. I macrofagi sono cellule immunitarie cruciali che svolgono un ruolo importante nell'infiammazione e nell'infezione. Durante lo sviluppo, i macrofagi neonatali contribuiscono in modo significativo al rimodellamento dei tessuti. Inoltre, il fenotipo e le funzioni dei macrofagi neonatali differiscono da quelli delle loro controparti adulte. Questo protocollo delinea anche la differenziazione dei macrofagi neonatali dalle cellule isolate del midollo osseo in presenza di terreno condizionato con L929. I marcatori di superficie per macrofagi neonatali differenziati sono stati valutati utilizzando l'analisi citofluorimetrica. Per dimostrare la funzionalità, l'efficienza fagocitaria è stata testata anche utilizzando Escherichia coli coniugato con colorante sensibile al pH.

Introduzione

Il midollo osseo racchiude popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali che sono auto-rinnovabili e possono essere differenziate in varie linee cellulari. Le cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo danno origine a linee mieloidi e linfoidi¹. Le cellule staminali mesenchimali producono osteoblasti (ossa), adipociti (grasso) o condrociti (cartilagine)². Queste cellule hanno molteplici applicazioni nel campo della biologia cellulare e dell'ingegneria tissutale, compresa la terapia genica ^3,4. Le cellule progenitrici presenti nel midollo osseo si differenziano in tipi cellulari specifici in presenza di fattori di crescita specifici del lignaggio. L'eritropoietina promuove la proliferazione delle cellule progenitrici eritroidi, il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) stimola la crescita delle colonie di neutrofili e la trombopoietina regola la produzione di piastrine come alcuni esempi di fattori di crescita specifici del lignaggio⁵. Il FACS marcato con antigene di superficie cellulare e il sorting cellulare attivato magneticamente (MACS) sono metodi consolidati per l'isolamento e la purificazione di specifici tipi di cellule derivate dal midollo osseo⁶.

Sebbene gli studi neonatali stiano avanzando verso la ricerca delle cause delle morti neonatali e l'affrontare le complicanze durante le nascite premature, lo sviluppo terapeutico diretto rimane un'esigenza medica insoddisfatta. Smith e Davis affermarono: "I pazienti pediatrici rimangono orfani terapeutici"⁷. Ci sono diverse sfide, come piccoli campioni, effetti permanenti del risultato e questioni etiche nell'ottenere il consenso negli studi clinici sui neonati⁸. Pertanto, c'è una forte domanda di modelli di studio in vivo e in vitro specifici per i neonati per ottenere rilevanza traslazionale. A causa delle somiglianze tra i livelli anatomici e tissutali, i brevi periodi gestazionali e le dimensioni della cucciolata, i roditori sono il sistema modello di mammifero più studiato.

Qui, descriviamo una procedura dettagliata, altamente fattibile e riproducibile per isolare il midollo osseo da cuccioli di topo di 7-9 giorni e la loro capacità di differenziarsi in macrofagi. Tuttavia, una varietà di linee cellulari potrebbe essere ottenuta con l'uso di segnali di differenziazione distinti. Dimostriamo anche la presenza di marcatori di superficie cellulare e la presenza di attività fagocitaria in vitro attesa per i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM).

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della West Virginia e sono state eseguite seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche. Per questo studio sono stati utilizzati cuccioli di topo C57BL/6J. I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei terreni

1. Preparare 3 mL di terreno di coltura MEM integrati con FBS al 10%, 2 mM di glutammina, 25 mM di HEPES e penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL) in una provetta da centrifuga da 5 mL e mantenerla in ghiaccio.
2. Se necessario per conservare i progenitori del midollo osseo in azoto liquido, preparare terreni di congelamento contenenti il 10% di DMEM, l'80% di FBS e il 10% di DMSO.
3. Per un DMEM completo, preparare DMEM integrato con il 10% di FBS, 2 mM di glutammina, 25 mM di HEPES e penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL).
4. Per la differenziazione dei macrofagi, preparare DMEM integrato con FBS al 10%, glutammina 2 mM, penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL) e surnatante cellulare L929 al 10% ^9,10,11.

2. Preparazione del surnatante di cellule L929

1. Scongelare le cellule L929 conservate in azoto liquido e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di DMEM completo. Centrifugare a 350 x g per 5 min a temperatura ambiente.
2. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno DMEM completo e seminarle in un pallone di coltura tissutale T25 alla densità di 2×10⁵ cellule. Contare le celle con un contatore di celle automatizzato utilizzando il tripano blu allo 0,4%. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ fino a raggiungere il 70% di confluenza.
3. Per staccare le cellule, lavarle prima con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aspirare il PBS e sostituirlo con 2,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%.
4. Incubare a 37 °C con CO₂ al 5% per 5 minuti e aggiungere 5 mL di DMEM completo.
5. Raccogliere le celle e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Risospendere il pellet di cella in 15 mL di terreno DMEM completo e trasferirlo in un matraccio T75.
7. Incubare a 37 °C con CO₂ al 5% fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%, quindi raccogliere il terreno e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Filtrare il terreno contenente M-CSF attraverso un filtro da 0,45 μm e congelare a -80 °C in aliquote da 5 mL.

3. Preparazione degli animali

1. Sotto una cabina di biosicurezza, separare accuratamente i cuccioli di topo C57BL/6J di 7-9 giorni (una cucciolata di 6 cuccioli) dalla madre e metterli in una gabbia separata.
2. Immergere un batuffolo di cotone in 2 ml di isoflurano di grado veterinario in una campana di vetro o in un'altra camera di contenimento.
3. Metti un cucciolo nella camera e chiudi il coperchio. Monitorare il neonato per circa 90 secondi per assicurarsi che diventi immobile e incosciente.
4. Rimuovi rapidamente il cucciolo e decapitalo con forbici affilate (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente) prima che il cucciolo possa riprendere conoscenza.
   NOTA: I neonati non respirano sufficientemente profondamente per l'eutanasia con la sola inalazione di isoflurano.
5. Assicurati di chiudere il coperchio del contenitore dopo che ogni cucciolo è stato rimosso. Lo stesso batuffolo di cotone può essere utilizzato per 5-7 cuccioli.

4. Isolamento del midollo osseo neonatale

1. Sterilizzare il corpo del neonato con etanolo al 70%.
2. "Usando una pinza e forbici chirurgiche a punta fine, fai un'incisione tra il
   addome e zampe posteriori. Rimuovere la pelle tirando verso il piede degli arti posteriori.
3. Raschiare il tessuto connettivo e il muscolo attaccato alle ossa usando una pinza a spigoli vivi.
4. Tagliare la tibia e il femore, come mostrato in Figura 1, con le forbici per staccare e rimuovere. Usando una pinza, posiziona queste ossa nel tubo multimediale sul ghiaccio. Ripeti il processo per ogni cucciolo.
5. Trasferire le ossa con l'aiuto di una pinza in un colino da 40 μm con una provetta di raccolta. Schiacciare le ossa e rilasciare il midollo premendo con uno stantuffo da siringa da 3 ml contro il colino.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato in NaCl allo 0,2%, una soluzione ipotonica per la lisi degli eritrociti. Aggiungere immediatamente un volume uguale di NaCl all'1,6% per portare la soluzione a isotonica.
8. Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere la soluzione di lisi.
9. Risospendere in DMEM completo per l'uso immediato o congelare i terreni per la conservazione e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
   NOTA: Per il presente studio, questo metodo ha prodotto 6,55 (± 1,44) × 10⁶ cellule di midollo osseo/cucciolo (Figura 1E).
10. Conservare le celle a -80 °C in un mezzo di congelamento o utilizzarle immediatamente come descritto di seguito.
    NOTA: A causa dell'età, le ossa sono trasparenti e abbastanza chiare da visualizzare il midollo attraverso di esse. È importante fare attenzione mentre si tirano le ossa poiché l'applicazione di una leggera pressione su di esse può essere sufficiente per rilasciare il midollo. Il midollo nelle ossa neonatali è sotto forma di liquido piuttosto che di un filo intatto che si trova nelle ossa adulte. È difficile raccogliere il midollo se fuoriesce durante la raccolta delle ossa.

5. Differenziamento dei macrofagi di derivazione midollare neonatale

1. Seminare 2 × 10⁷ cellule di midollo osseo per pallone T75 in 10 mL di DMEM completo che contiene il 10% di surnatante di cellule L929 (2,5 mL) come fonte di M-CSF. Incubare le piastre di coltura a 37 °C con CO₂ al 5% per 5 giorni. Aggiungere 2 mL di terreno condizionato con L929 il giorno 3 di differenziazione.
2. Osserva le cellule al microscopio ogni giorno utilizzando un microscopio invertito e un sistema di imaging con ingrandimento 20x. Dopo la differenziazione, i macrofagi dovrebbero apparire aderenti, allungati ed eterogenei (Figura 2).
3. Per raccogliere i macrofagi per i saggi a valle, aspirare i mezzi di differenziazione.
4. Lavare le cellule con 5 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti e le proteine sieriche che interferiscono con il distacco. Aspirare il PBS.
5. Raccogliere le cellule aggiungendo 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al pallone. Posizionare il pallone di coltura a 37 °C con l'incubatore al 5% di CO₂ per 5 minuti e aggiungere 5 mL di DMEM.
6. Pipettare le cellule da staccare e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Dissociare il pellet cellulare in 1 mL di DMEM completo, contare e controllare la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano. I BMDM isolati con questo metodo sono 7,05 (± 2,52) ×10⁵ cellule/cucciolo (Figura 1E).
   NOTA: Osservare la presenza di cellule a forma di fuso che iniziano a comparire il secondo giorno di differenziazione (Figura 1B, frecce rosse). Se il colore del terreno diventa giallo, indicando che è esaurito, aggiungere altro terreno condizionato con L929 il giorno 4 di differenziazione; Si sconsiglia la sostituzione completa dei supporti.

6. Immunomarcatura e citofluorimetria

1. Bloccare la marcatura degli anticorpi non specifici dei BMDM (2x10⁵/marca) trattando con 10 μL/10⁷ cellule di reagente bloccante FcR secondo le raccomandazioni del produttore in un volume di 100 μL/tampone per citometria a flusso (PBS integrato con 2 mM di EDTA e 0,5% di albumina sierica bovina). Conservare in ghiaccio per 10 min.
   NOTA: Le cellule possono essere bloccate in blocco o in singoli pozzetti o provette. Tutte le fasi successive indicano le quantità e i volumi per singola etichetta di marcatore cellulare a un volume finale di 100 μl.
2. Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone per citometria a flusso e centrifugare a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il surnatante e seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U a una densità di 5 × 10⁵ cellule per pozzetto. Colorare le cellule aggiungendo il colorante per la conta delle cellule vive/morte FVS780 diluito a 3.000 volte e 0,625 μL di BV786-CD11b, PE-F4/80 e AlexaFluor488-CD206 in 100 μL di tampone per citometria a flusso singolarmente o in combinazione 12,13,14,15. Incubare le celle per 45 minuti su ghiaccio coperto con un foglio.
4. Aggiungere 100 μL di tampone per citometria a flusso e lavare le cellule centrifugando a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
5. Aspirare il surnatante e agitare delicatamente il pellet cellulare. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide allo 0,4% in ciascun pozzetto e incubare per una notte a 4 °C.
6. Lavare le cellule aggiungendo 100 μL di tampone per citometria a flusso e pellet mediante centrifugazione a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
7. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone per citometria a flusso e analizzarle utilizzando un citometro a flusso.

7. Saggio in vitro per valutare l'efficacia fagocitaria di macrofagi neonatali derivati dal midollo osseo

1. Risospendere i BMDM in DMEM completo senza rosso fenolo o antibiotici e seminarli a una densità di 2 × 10⁵/ quadrante in un piatto quadruplo da 35 mm a un volume di 500 μL.
2. Per preparare l'inoculo batterico con una molteplicità di infezione (MOI) di 25 o di un altro MOI desiderato, rimuovere una scorta precalcolata di Escherichia coli O1:K1:H7 conservata a -80 °C.
3. Aliquotare il volume desiderato di batteri in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL. Lavare i batteri aggiungendo PBS a un volume totale di 1 ml. Pellettare i batteri mediante centrifugazione a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio.
4. Risospendere il pellet batterico in 50 μL di PBS e aggiungere un colorante fluorescente verde sensibile al pH a una concentrazione finale di 500 μM. Si tratta di un colorante sensibile al pH senza segnale fluorescente a pH neutro e fluorescente in ambienti acidi, come i fagosomi acidificati, durante il processo di fagocitosi.
5. Incubare le cellule batteriche per 20 minuti al buio per la coniugazione del colorante.
6. Lavare i batteri quattro volte con 1 mL di PBS mediante centrifugazione a 1000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Risospendere i batteri in 500 μL di DMEM completo senza rosso fenolo e aggiungerli alle colture BMDM.
8. Incubare i BMDM a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 4 ore e quindi aggiungere 200 ng di un colorante fluorescente rosso permeabile alle cellule che colora i lisosomi.
   NOTA: I batteri fagocitici possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza.

Risultati

Utilizzando il metodo descritto in questo studio, da 25 a 37 milioni di cellule del midollo osseo possono essere isolate con successo da una cucciolata di cinque cuccioli di topo C57BL/6. Questo metodo è stato convalidato con cucciolate di dimensioni comprese tra 5 e 7 cuccioli. L'età minima per l'isolamento nei nostri esperimenti è stata di 7 giorni. A seconda delle dimensioni della cucciolata e del numero di cellule necessarie per l'esperimento inferiore a un milione, i ricercatori hanno potuto tentare questo protoc...

Discussione

La ricerca che coinvolge modelli murini neonatali può presentare una serie di sfide. I neonati hanno un sistema immunitario in via di sviluppo unico rispetto agli adulti⁸. Pertanto, i dati generati da modelli animali adulti non dovrebbero essere considerati applicabili ai neonati, e diversi lavori pubblicati hanno articolato bene questa idea ^18,19. Pertanto, sono necessari modelli e fonti di cellule neonatali specifici per studiare le com...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal