Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Zusammenfassung

Verschiedene Techniken zur Isolierung von Knochenmark aus adulten Mäusen sind gut etabliert. Die Isolierung von Knochenmark aus neonatalen Mäusen ist jedoch eine Herausforderung und zeitaufwändig, aber für einige Modelle translational relevant und notwendig. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und unkomplizierte Methode zur Aufbereitung von Knochenmarkzellen von 7-9 Tage alten Welpen. Diese Zellen können dann weiter isoliert oder in bestimmte Zelltypen von Interesse differenziert werden. Makrophagen sind wichtige Immunzellen, die eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Infektionen spielen. Während der Entwicklung tragen neonatale Makrophagen wesentlich zum Gewebeumbau bei. Darüber hinaus unterscheiden sich der Phänotyp und die Funktionen neonataler Makrophagen von denen ihrer erwachsenen Gegenstücke. Dieses Protokoll beschreibt auch die Differenzierung von neonatalen Makrophagen von den isolierten Knochenmarkzellen in Gegenwart von L929-konditioniertem Medium. Oberflächenmarker für differenzierte neonatale Makrophagen wurden mittels durchflusszytometrischer Analyse untersucht. Um die Funktionalität zu demonstrieren, wurde die phagozytäre Effizienz auch mit pH-sensitiven Farbstoff-konjugierten Escherichia coli getestet.

Einleitung

Das Knochenmark umschließt sowohl hämatopoetische als auch mesenchymale Stammzellpopulationen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelllinien differenziert werden können. Hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark führen zu myeloischen und lymphoiden Linien¹. Mesenchymale Stammzellen produzieren Osteoblasten (Knochen), Adipozyten (Fett) oder Chondrozyten (Knorpel)². Diese Zellen haben vielfältige Anwendungen im Bereich der Zellbiologie und des Tissue Engineering, einschließlich der Gentherapie ^3,4. Im Knochenmark vorkommende Vorläuf....

Protokoll

Alle Verfahren wurden von den West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt und gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council durchgeführt. Für diese Studie wurden C57BL/6J-Maus-Welpen verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie 3 ml MEM-Nährmedien, die mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 25 mM HEPES und Penicillin (100 μg/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt sind, in einem 5 ml-Zentrifugenröhrchen vor und bewahre....

Diskussion

Die Forschung an neugeborenen Mausmodellen kann eine Reihe von Herausforderungen mit sich bringen. Neugeborene haben ein sich entwickelndes Immunsystem, das im Vergleich zu Erwachsenen einzigartig ist⁸. Daher sollte nicht davon ausgegangen werden, dass Daten, die aus adulten Tiermodellen generiert wurden, auf Neugeborene zutreffen, und mehrere veröffentlichte Arbeiten haben diese Idee gut artikuliert^18,19. Daher sind neonatalspezifische M.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal