Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Zusammenfassung

Verschiedene Techniken zur Isolierung von Knochenmark aus adulten Mäusen sind gut etabliert. Die Isolierung von Knochenmark aus neonatalen Mäusen ist jedoch eine Herausforderung und zeitaufwändig, aber für einige Modelle translational relevant und notwendig. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und unkomplizierte Methode zur Aufbereitung von Knochenmarkzellen von 7-9 Tage alten Welpen. Diese Zellen können dann weiter isoliert oder in bestimmte Zelltypen von Interesse differenziert werden. Makrophagen sind wichtige Immunzellen, die eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Infektionen spielen. Während der Entwicklung tragen neonatale Makrophagen wesentlich zum Gewebeumbau bei. Darüber hinaus unterscheiden sich der Phänotyp und die Funktionen neonataler Makrophagen von denen ihrer erwachsenen Gegenstücke. Dieses Protokoll beschreibt auch die Differenzierung von neonatalen Makrophagen von den isolierten Knochenmarkzellen in Gegenwart von L929-konditioniertem Medium. Oberflächenmarker für differenzierte neonatale Makrophagen wurden mittels durchflusszytometrischer Analyse untersucht. Um die Funktionalität zu demonstrieren, wurde die phagozytäre Effizienz auch mit pH-sensitiven Farbstoff-konjugierten Escherichia coli getestet.

Einleitung

Das Knochenmark umschließt sowohl hämatopoetische als auch mesenchymale Stammzellpopulationen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelllinien differenziert werden können. Hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark führen zu myeloischen und lymphoiden Linien¹. Mesenchymale Stammzellen produzieren Osteoblasten (Knochen), Adipozyten (Fett) oder Chondrozyten (Knorpel)². Diese Zellen haben vielfältige Anwendungen im Bereich der Zellbiologie und des Tissue Engineering, einschließlich der Gentherapie ^3,4. Im Knochenmark vorkommende Vorläuferzellen differenzieren sich in Gegenwart von linienspezifischen Wachstumsfaktoren in spezifische Zelltypen. Erythropoietin fördert die Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen, der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) stimuliert das Wachstum neutrophiler Kolonien und Thrombopoietin reguliert die Produktion von Blutplättchen, um nur einige Beispiele für linienspezifische Wachstumsfaktoren^{zu nennen 5}. Das mit Zelloberflächenantigen markierte FACS und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) sind etablierte Methoden zur Isolierung und Reinigung der spezifischen Zelltypen aus dem Knochenmark⁶.

Obwohl Neugeborenenstudien Fortschritte machen, um die Ursachen für den Tod von Neugeborenen zu finden und die Komplikationen bei Frühgeburten zu behandeln, bleibt die direkte therapeutische Entwicklung ein ungedeckter medizinischer Bedarf. Smith und Davis stellten fest: "Pädiatrische Patienten bleiben therapeutische Waisen"⁷. Es gibt mehrere Herausforderungen, wie z. B. kleine Stichproben, lebenslange Auswirkungen des Ergebnisses und ethische Fragen bei der Einholung der Einwilligung in klinischen Studien mit Neugeborenen⁸. Daher besteht ein hoher Bedarf an in vivo und in vitro Studienmodellen, die spezifisch für Neugeborene sind, um translationale Relevanz zu erreichen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen anatomischen und Gewebeebenen, kurzen Schwangerschaftszeiten und Wurfgrößen sind Nagetiere das am besten untersuchte Säugetiermodellsystem.

Hier beschreiben wir ein detailliertes, sehr praktikables und reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von Knochenmark von 7-9 Tage alten Mausbabys und deren Fähigkeit, sich in Makrophagen zu differenzieren. Eine Vielzahl von Zelllinien konnte jedoch durch die Verwendung unterschiedlicher Differenzierungssignale erreicht werden. Wir zeigen auch das Vorhandensein von Zelloberflächenmarkern und das Vorhandensein von in vitro phagozytärer Aktivität, die für aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) erwartet wird.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von den West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt und gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council durchgeführt. Für diese Studie wurden C57BL/6J-Maus-Welpen verwendet. Die Details zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Medien

1. Bereiten Sie 3 ml MEM-Nährmedien, die mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 25 mM HEPES und Penicillin (100 μg/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt sind, in einem 5 ml-Zentrifugenröhrchen vor und bewahren Sie es auf Eis auf.
2. Falls für die Lagerung von Knochenmarkvorläuferzellen in flüssigem Stickstoff erforderlich, bereiten Sie Gefriermedien vor, die 10 % DMEM, 80 % FBS und 10 % DMSO enthalten.
3. Für ein vollständiges DMEM bereiten Sie DMEM vor, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 25 mM HEPES und Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt wird.
4. Für die Makrophagendifferenzierung bereiten Sie DMEM zu, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, Penicillin (100 E/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) und 10 % L929-Zellüberstand ^9,10,11 ergänzt wird.

2. Vorbereitung des L929-Zellüberstands

1. In flüssigem Stickstoff gelagerte L929-Zellen werden aufgetaut und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml vollständigem DMEM überführt. Zentrifugieren Sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständigem DMEM-Medium und säen Sie sie in einen T25-Gewebekulturkolben mit einer Dichte von 2×10⁵ Zellen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit 0,4 % Trypanblau. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren, bis eine Konfluenz von 70 % erreicht ist.
3. Um die Zellen zu lösen, waschen Sie sie zuerst mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 2,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA.
4. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ 5 min inkubieren und 5 ml vollständiges DMEM hinzufügen.
5. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Das Zellpellet wird in 15 mL vollständigem DMEM-Medium resuspendiert und in einen T75-Kolben überführt.
7. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, dann das Medium auffangen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Die M-CSF-haltigen Medien werden durch einen 0,45 μm Filter filtriert und bei -80 °C in 5 mL Aliquots eingefroren.

3. Vorbereitung der Tiere

1. Trennen Sie die 7-9 Tage alten C57BL/6J-Mausbabys (ein Wurf von 6 Jungtieren) vorsichtig unter einer Biosicherheitswerkbank vom Muttertier und setzen Sie sie in einen separaten Käfig.
2. Tränken Sie einen Wattebausch in 2 ml tierärztlichem Isofluran in einer Glasglocke oder einer anderen Auffangkammer.
3. Lege einen Welpen in die Kammer und schließe den Deckel. Überwachen Sie das Neugeborene ca. 90 s lang, um sicherzustellen, dass es bewegungslos und bewusstlos wird.
4. Entferne den Welpen schnell und enthaupte ihn mit einer scharfen Schere (nach institutionell anerkannten Protokollen), bevor der Welpe wieder zu Bewusstsein kommt.
   HINWEIS: Neugeborene atmen nicht tief genug, um allein durch Isofluran-Inhalation eingeschläfert zu werden.
5. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Behälters geschlossen ist, nachdem jeder Welpe entfernt wurde. Der gleiche Wattebausch kann für 5-7 Welpen verwendet werden.

4. Isolierung des Knochenmarks von Neugeborenen

1. Sterilisieren Sie den Körper des Neugeborenen mit 70% Ethanol.
2. "Machen Sie mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere mit feiner Spitze einen Schnitt zwischen den
   Bauch und Hinterbeine. Entfernen Sie die Haut, indem Sie in Richtung des Fußes der Hintergliedmaßen ziehen.
3. Kratzen Sie das Bindegewebe und die Muskeln, die an den Knochen befestigt sind, mit einer scharfkantigen Pinzette ab.
4. Schneiden Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen, wie in Abbildung 1 gezeigt, mit einer Schere ab, um sie zu lösen und zu entfernen. Lege diese Knochen mit einer Pinzette in den Medienschlauch auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Welpen.
5. Übertragen Sie die Knochen mit Hilfe einer Pinzette in ein 40 μm Sieb mit einem Entnahmeröhrchen. Zerkleinern Sie die Knochen und geben Sie das Mark frei, indem Sie mit einem 3-ml-Spritzenkolben gegen das Sieb drücken.
6. Die Zellsuspension bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
7. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren von 0,2 % NaCl, einer hypotonen Lösung für die Lyse von Erythrozyten. Fügen Sie sofort ein gleiches Volumen von 1,6 % NaCl hinzu, um die Lösung isotonisch zu machen.
8. Bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und die Lyselösung entfernen.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem DMEM für den sofortigen Gebrauch oder in Einfriermedien zur Lagerung und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie ergab diese Methode 6,55 (± 1,44) × 10⁶ Knochenmarkzellen/Welpen (Abbildung 1E).
10. Lagern Sie die Zellen bei -80 °C in Gefriermedien oder verwenden Sie sie sofort wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Aufgrund des Alters sind die Knochen transparent und klar genug, um das Knochenmark durch sie hindurch sichtbar zu machen. Es ist wichtig, beim Ziehen an den Knochen vorsichtig zu sein, da der leichte Druck auf sie ausreichen kann, um das Knochenmark freizusetzen. Das Knochenmark in den Knochen von Neugeborenen hat die Form einer Flüssigkeit und nicht eines intakten Fadens, wie es in erwachsenen Knochen zu finden ist. Es ist schwierig, das Knochenmark zu entnehmen, wenn es bei der Entnahme der Knochen austritt.

5. Differenzierung neonataler Makrophagen aus dem Knochenmark

1. Saatgut 2 × 10⁷ Knochenmarkzellen pro T75-Kolben in 10 ml vollständigem DMEM, das 10 % L929-Zellüberstand (2,5 ml) als M-CSF-Quelle enthält. Die Kulturschalen werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ 5 Tage lang inkubiert. Fügen Sie 2 ml L929-konditioniertes Medium am Tag 3 der Differenzierung hinzu.
2. Beobachten Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop mit einem inversen Mikroskop und einem bildgebenden System mit 20-facher Vergrößerung. Bei der Differenzierung sollten Makrophagen adhärent, länglich und heterogen erscheinen (Abbildung 2).
3. Um die Makrophagen für nachgelagerte Assays zu ernten, aspirieren Sie das Differenzierungsmedium.
4. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, um nicht adhärente Zellen und Serumproteine zu entfernen, die die Ablösung beeinträchtigen. Aspirieren Sie das PBS.
5. Ernten Sie die Zellen, indem Sie 5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben. Den Kulturkolben 5 Minuten lang bei 37 °C mit einem 5 % CO_{2 -} Inkubator aufstellen und 5 ml DMEM hinzufügen.
6. Pipettieren Sie die Zellen, um sie zu lösen, und zentrifugieren Sie sie bei 350 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
7. Dissoziieren Sie das Zellpellet in 1 ml vollständigem DMEM und zählen und überprüfen Sie die Zellviabilität mit Trypanblau. BMDMs, die mit dieser Methode isoliert werden, betragen 7,05 (± 2,52) ×10⁵ Zellen/PUP (Abbildung 1E).
   HINWEIS: Beobachten Sie das Vorhandensein von spindelförmigen Zellen, die am zweiten Tag der Differenzierung zu erscheinen beginnen (Abbildung 1B, rote Pfeile). Wenn die Farbe des Mediums gelb wird, was darauf hinweist, dass es verbraucht ist, fügen Sie am Tag 4 der Differenzierung weitere L929-konditionierte Medien hinzu. Ein vollständiger Austausch des Mediums wird nicht empfohlen.

6. Immunmarkierung und durchflusszytometrische Analyse

1. Blockieren Sie die unspezifische Antikörpermarkierung der BMDMs (2x10⁵/Markierung) durch Behandlung mit 10 μL/10^{7 Zellen} FcR-Blockierungsreagenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers in einem Volumen von 100 μL/Markierung Durchflusszytometrie-Puffer (PBS ergänzt mit 2 mM EDTA und 0,5 % Rinderserumalbumin). 10 Minuten auf Eis halten.
   HINWEIS: Die Zellen können in großen Mengen oder in einzelnen Vertiefungen oder Röhrchen verstopft werden. Alle nachfolgenden Schritte zeigen Mengen und Volumina pro Einzelzellmarkierung bei einem Endvolumen von 100 μl an.
2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl Durchflusszytometrie-Puffer hinzufügen und bei 525 x g für 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
3. Entfernen Sie den Überstand und säen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden bei einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Well. Färbezellen durch Zugabe von FVS780-Lebend-/Totzellzählfarbstoff, verdünnt auf das 3.000-fache und 0,625 μl BV786-CD11b, PE-F4/80 und AlexaFluor488-CD206 in 100 μl Durchflusszytometrie-Puffer entweder einzeln oder in Kombination 12,13,14,15. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang auf Eis, das mit Folie bedeckt ist.
4. Fügen Sie 100 μl Durchflusszytometrie-Puffer hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 7 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 525 x g zentrifugieren.
5. Saugen Sie den Überstand an und wirbeln Sie das Zellpellet vorsichtig ein. 100 μl 0,4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 μl Durchflusszytometriepuffer und Pellet durch Zentrifugation bei 525 x g für 7 min bei Raumtemperatur.
7. Resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl Durchflusszytometrie-Puffer und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.

7. In-vitro-Assay zur Bewertung der phagozytären Wirksamkeit von Makrophagen aus dem Knochenmark von Neugeborenen

1. Resuspendieren Sie die BMDMs in vollständigem DMEM ohne Phenolrot oder Antibiotika und säen Sie sie mit einer Dichte von 2 × 10⁵/Quadrant in einer 35 mm Quad-Schale bei einem Volumen von 500 μL aus.
2. Um das bakterielle Inokulum bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 25 oder einem anderen gewünschten MOI vorzubereiten, entnehmen Sie einen vorberechneten Bestand an Escherichia coli O1:K1:H7, der bei -80 °C gelagert wurde.
3. Aliquotieren Sie das gewünschte Bakterienvolumen in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Bakterien, indem Sie PBS zu einem Gesamtvolumen von 1 ml hinzufügen. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt.
4. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 50 μl PBS und fügen Sie grün fluoreszierenden pH-sensitiven Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 500 μM hinzu. Dies ist ein pH-empfindlicher Farbstoff ohne Fluoreszenzsignal bei neutralem pH-Wert und fluoresziert während des Prozesses der Phagozytose hell in sauren Umgebungen, wie z. B. angesäuerten Phagosomen.
5. Inkubieren Sie die Bakterienzellen 20 Minuten lang im Dunkeln für die Farbstoffkonjugation.
6. Waschen Sie die Bakterien viermal mit 1 mL PBS durch Zentrifugation bei 1000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
7. Resuspendieren Sie die Bakterien in 500 μl vollständigem DMEM ohne Phenolrot und geben Sie sie in die BMDM-Kulturen.
8. Inkubieren Sie die BMDMs bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ -Inkubator für 4 h und fügen Sie dann 200 ng eines zellpermeablen roten Fluoreszenzfarbstoffs hinzu, der die Lysosomen färbt.
   HINWEIS: Phagozytenbakterien können durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Ergebnisse

Mit der in dieser Studie beschriebenen Methode können 25 bis 37 Millionen Knochenmarkzellen aus einer Wurfgröße von fünf C57BL/6-Maus-Welpen erfolgreich isoliert werden. Diese Methode wurde mit Wurfgrößen von 5 bis 7 Welpen validiert. Das Mindestalter für die Isolation in unseren Experimenten lag bei 7 Tagen. Abhängig von der Wurfgröße und der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Zellen von weniger als einer Million könnten die Forscher dieses Protokoll für Mäuse ausprobieren, die jünger als 7 Tage...

Diskussion

Die Forschung an neugeborenen Mausmodellen kann eine Reihe von Herausforderungen mit sich bringen. Neugeborene haben ein sich entwickelndes Immunsystem, das im Vergleich zu Erwachsenen einzigartig ist⁸. Daher sollte nicht davon ausgegangen werden, dass Daten, die aus adulten Tiermodellen generiert wurden, auf Neugeborene zutreffen, und mehrere veröffentlichte Arbeiten haben diese Idee gut artikuliert^18,19. Daher sind neonatalspezifische M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal